KR101889072B1 - 디지털 PCR을 이용한 유전성 강직성 대마비(Hereditary spastic paraplegia, HSP) 관련 유전자 SPG4의 거대결손 검증법 - Google Patents

디지털 PCR을 이용한 유전성 강직성 대마비(Hereditary spastic paraplegia, HSP) 관련 유전자 SPG4의 거대결손 검증법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전성 강직성 대마비(Hereditary spastic paraplegia)의 진단을 위한 프라이머 및 이를 포함하는 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물 및 이를 이용한 유전성 강직성 대마비 정보 제공방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머는 소량의 시료로도 정확한 진단이 가능한 효과를 가진다.

Description

디지털 PCR을 이용한 유전성 강직성 대마비(Hereditary spastic paraplegia, HSP) 관련 유전자 SPG4의 거대결손 검증법{Verification of large deletion of SPG4 gene associated Hereditary spastic paraplegia(HSP) using digital PCR}
본 발명은 SPG4 유전자 결손을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브와 이를 포함하는 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물에 관한 발명이다. 또한, 상기 조성물을 포함하는 유전성 강직성 대마비 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용한 유전성 강직성 대마비 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 발명이다.
유전성 강직성 대마비(Hereditary　spastic　paraplegia: HSP 또는 SPG)는 다리의 근육이 점차적으로 약해져 마비되고, 근육의 긴장성이 증가하며, 뻣뻣해지는 증상이 나타나는 유전성 신경계 질환으로, 전세계적으로 발생하는 희귀 난치 질환이다.
유전성 강직성 대마비의 진단은 철저한 임상평가를 통해 신체 소견상의 특징을 발견하며, 환자와 가족의 과거력을 자세하게 조사하여 수행한다. 또한 혈액검사, 방사선 검사, 신경과 근육의 전기적인 활동 등을 검사하고, 뇌와 척수의　CT와　MRI를 수행하거나 침근전도검사와 신경전도속도검사 등의 전기생리학검사를 수행하기도 한다. 그리고 최종적으로 확진을 위해 유전자 검사법을 시도하여 어떤 유전자의 변이로 질병이 발현되었는지 확인한다.
유전성 강직성 하반신마비의 원인 유전자로 현재까지 70여종이 보고되었으나 아직 원인 유전자가 규명되지 않은 경우들도 다수 보고되고 있어서 HSP관련 유전자 서열변이 발굴연구가 현재도 지속적으로 수행되고 있다. 하지만 SPAST(SPG4)와 ATL1(SPG3A)는 상염색체 우성(Autosomal Dominant) 타입 유전성 강직성 하반신마비 환자의 50% 이상에서 원인 유전자로 확인되고 있어서 유전성 강직성 하반신마비 진단시 SPAST(SPG4)와 ATL1(SPG3A) 유전자 검사만으로도 환자의 50%에 대한 확진이 가능하다. 따라서 이들 유전자 검사를 위한 간편 검사법이 요구된다.
SPG4(Spastic Paraplegia Gene 4) 유전자 서열변이는 유전성 강직성 대마비와 관련하여 잘 알려져 있는 바, SPG4 유전자 서열분석에 의한 유전성 강직성 하반신마비 질환 진단이 중요하다. 그 외에도 SPG4 유전자 코딩부위의 거대결손이 다수 보고되고 있는데, 유전자서열 분석으로는 유전자결손을 정확히 판단하기 어려워 이를 검증할 수 있는 진단법이 추가로 필요하다.
현재까지 유전자 거대결손 검증을 위해 사용되고 있는 방법으로는 서던블랏(Southern blotting), MAPH(multiplex amplification and probe hybridization), MLPA (multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) 등이 있고, 그 중 MLPA 방법이 가장 정확한 방법이나 분석시간이 길고 시료가 과량(수십 ug 수준/1회 분석) 필요해서 좀 더 간편한 분석법으로의 개선이 필요하다.
디지털 PCR법은 소량의 유전자 시료로도 절대정량이 가능한 유전자 검출방법으로 최근 각광받고 있으며, 분자진단기술에 적용하려는 기술최적화 단계에 있다. 수십 ng 정도의 소량의 유전자로도 절대 정량이 가능한 디지털 PCR법의 장점은 유전자 카피수를 확인하는 용도로의 활용에 매우 적절하다. 이에 디지털 PCR법을 이용한 카피수 분석법이 여러 질환 관련 유전자들에 대해 지속적으로 개발되고 있다(대한민국 공개특허 제10-2017-0051256호).
그러나, 아직 유전성 강직성 대마비를 진단할 수 있는 방법은 확립되지 않은 사정으로, 소량의 시료로도 정확하고 신속한 진단이 가능한 방법의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 유전성 강직성 대마비를 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, SPG4 유전자의 결손 여부를 검출할 수 있는 택맨반응(Taqman reaction)를 개발하고 이를 이용한 디지털 PCR법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 SPG4 유전자 결손을 검출하기 위한 프라이머를 포함하는, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 유전성 강직성 대마비 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, SPG4 유전자의 결손을 검출하는 단계를 포함하는, 유전성 강직성 대마비 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및 서열번호 31 및 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 포함하는, 유전성 강직성 대마비 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, SPG4 유전자 결손을 검출하기 위한 프라이머를 포함하는, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "유전성 강직성 대마비(Hereditary spastic paraplegia: HSP 또는 SGP)"는 다리의 근육이 점차적으로 약해져 마비되고, 근육의 긴장성이 증가하며, 뻣뻣해지는 증상이 나타나는 유전성 신경계 질환으로, 전세계적으로 발생하는 희귀 난치 질환이다. 이 질환과 관련된 증상들이 매우 다양하게 나타나기 때문에, 이 질환을 가지고 있더라도 진단되지 않고 지낼 수 있으며, 이로 인해 얼마나 자주 이 질환이 발생하는지는 파악하기 어렵다. 남성과 여성에게 비교적 동일한 비율로 발생하고, 증상이 시작되는 나이와 근육이 약해지는 정도, 그리고 근육 강직의 정도는 한 가족 안의 구성원이라 할지라도 각각 다르게 나타난다. 증상은 빠르면 신생아기에 시작되고, 늦게는 80∼90세에 시작되는 등 어느 연령에서나 나타날 수 있는데, 중년기 초반에 증상이 나타나는 경우가 대부분이다. 일차적으로 근육 강직, 허약한 다리 근육, 몸의 균형을 잡기 어려움, 자주 넘어지거나, 평상시와는 다른 보행 장애 등이 나타나는데 질환이 진행됨에 따라 보행 장애는 더 심해지지만 걷는 능력이 완전히 상실되는 경우는 비교적 드물다.
본 발명의 용어, "SPG4(Spastic Paraplegia Gene 4) 유전자"는 인간 염색체 2번에 존재하고 94,086개의 염기로 구성되어 있으며, 17개의 엑손으로 구성되어 있고, AAA(ATPases associated with a variety of cellular activities) 패밀리의 단백질을 암호화한다. ATPase 도메인을 갖고 있는 SPG4(Spastin) 단백질은 세포막 운송과정, 세포내 운동성, 단백질 접힘, 단백질 분해 등의 다양한 세포 기능에 관여함이 보고되어 있다.
본 발명의 용어, "유전자 결손"은 DNA 복제 시 염색체 또는 DNA 서열의 일부가 결손되는 돌연변이이다. 단일 염기부터 전체 염색체까지의, 임의의 수의 뉴클레오티드가 결손될 수 있다. 가장 작은 단일 염기 결손 돌연변이는 DNA 폴리머 라제 활성 부위 내에서, 주형 DNA에서 단일 염기 뒤집힘, 그 이후의 주형 DNA 가닥의 미끄러짐에 의해 발생한다고 알려져 있다. 결손은 감수 분열 중 염색체 교차의 오류로 인해 발생할 수 있으며, 이로 인해 여러 심각한 유전병이 발생한다. 3배수가 아닌 염기의 결손은 유전적 서열의 3-뉴클레오티드 단백질 판독 프레임의 변화에 의해 틀 이동을 야기할 수 있다. 작은 결손은 치명적인 가능성이 적지만, 큰 결실은 일반적으로 치명적이다. 다만, 어떤 유전자가 결실되었는지에 따라 다양한 결과를 야기한다.
상기 SPG4 유전자의 결손을 포함하는 유전자변이는 유전성 강직성 대마비와 관련하여 잘 알려져 있으며, 현재까지 200여 개의 점돌연변이가 보고되었다. 그 외에도 SPG4 유전자 코딩부위의 거대결손이 다수 보고되고 있는데, 현재까지 보고된 유전자 결손부위는 매우 다양하여 특별히 결손이 많이 발생하는 부위를 지정할 수 없다(도 1). 따라서 SPG4 유전자의 결손을 확인하기 위해서는 17개 엑손 모두의 존재 여부에 대한 확인이 바람직하다. 본 발명에서, SPG4 유전자의 결손은 상기 17개 엑손 중 하나 이상의 엑손이 결손된 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서, 상기 유전자의 RNA 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 유전자의 RNA의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용 가능하다.
구체적으로, 본 발명의 프라이머는 서열번호 1 내지 20 및 23 내지 32의 뉴클레오티드 서열 중 선택되는 것일 수 있다. 본 발명의 프라이머는 SPG4 유전자의 엑손에 특이적으로 결합하며, 이를 통해 정확하고 신속하게 유전성 강직성 대마비의 진단을 가능하게 한다. 본 발명의 프라이머는 통상적인 PCR에 사용될 수 있으며, 구체적으로 디지털 PCR에 이용될 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 구체예는, SPG4 유전자 결손은 SPG4 유전자의 엑손 1 내지 엑손 10, 엑손 12 내지 엑손 16 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 결손인 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "엑손"은, 진핵생물에서 DNA가 가지는 염기서열의 일부분으로서 단백질에 대한 실질적인 정보를 가지는 DNA의 핵심 부분이다. 이와 대비되는 개념으로 인트론이 있다. 진핵세포에는 인트론이 존재하기 때문에, mRNA에서 실질적인 정보를 가지지 않는 인트론을 제외하고 엑손만을 이어 맞추는 RNA-이어맞추기(RNA-sprising) 기전이 일어난다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 프라이머 세트가 SPG4 유전자의 17개의 엑손 중 엑손 1 내지 엑손 10 및 엑손 12 내지 엑손 16을 특이적으로 검출하는 것을 확인함으로써, SPG4 유전자 결손을 확인할 수 있음을 확인하였다(실시예 2, 도 3).
엑손 11의 경우, 실시간 PCR반응을 여러 경우의 반응을 설계하여 시도하였으나 적절한 반응을 도출하지 못하였고(실시예 1), 엑손 17의 경우, 디지털 PCR 반응이 적절히 수행 가능하지 않았다(실시예 2).
따라서, 엑손 11 및 17 에 대해서는 다른 형식의 택맨반응을 설계하여 다시 분석을 시도하였으나 적당한 반응을 선별할 수 없었는 바, SPG4 유전자의 결손을 검출하는 데 있어서, 적절하지 않음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, 상기 조성물은 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 31 및 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머 쌍을 포함하는 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 1을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 2을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 3을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 4을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 5을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 6을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 7을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 8을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 9를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 10을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 12을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 13을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 14를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 15를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 31 및 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 SPG4 유전자의 엑손 16을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다.
상기 프라이머 쌍은 프로브와 함께 택맨 반응에 이용될 수 있으며, 그 결과로부터 SPG4 유전자의 결손을 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, 상기 조성물은 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및 서열번호 31 및 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 포함하는 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, 상기 조성물은 프로브를 추가로 포함하는 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "프로브"는 RNA 또는 단백질과 특이적 결합을 이룰 수 있는, 라벨링(labeling)된 핵산 단편 또는 펩타이드를 의미한다. 구체적인 예로, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브, 올리고펩타이드(oligonucleotide peptide) 프로브, 폴리펩타이드 프로브(polypeptide) 등의 형태로 제작될 수 있으나, 본 발명의 목적상, 프라이머로 증폭된 산물을 검출할 수 있는 한, 종류나 제조방법에 제한되지 않는다. 또한, 형광 물질을 비롯한 표지물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 형광물질의 구체적인 예로서는 FAM 형광물질이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, 상기 조성물은 서열번호 39 내지 서열번호 48 및 50 내지 54의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 서열을 포함하는 1개 이상의 프로브를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, SPG4 유전자 결손을 검출할 수 있는 프로브인 한, 구체적인 서열에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 서열번호 39의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 1을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 40의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 2를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 41의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 3을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 42의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 4를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 43의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 5를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 6을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 7을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 46의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 8을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 47의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 9를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 48의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 10을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 50의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 12를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 51의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 13을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 52의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 14를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 53의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 15를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있고; 상기 서열번호 54의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브는 SPG4 유전자의 엑손 16을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, SPG4 유전자의 결손 여부를 결정하기 위해 상기 유전자의 17개 엑손의 DNA 서열을 PCR을 이용하여 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 상기 PCR의 결과물을 확인할 수 있는 형광표지 프로브를 설계하였고(실시예 1-1, 표 1 및 표 2), 상기 설계된 프라이머 쌍 및 프로브들이 택맨 반응에 적합한지 확인하기 위해 실시간 PCR을 수행하였다(실시예 1-2, 표 3, 표 4 및 도 4). 그 결과, 상기의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 SPG4 유전자의 엑손의 결손이 검출 가능한 것으로 확인하였다.
본 발명에서 이용되는 뉴클레오티드 서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
따라서, 상기 서열번호 1 내지 20, 23 내지 32, 39 내지 49 및 50 내지 54로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 높은 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, 상기 조성물은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 및 서열번호 39의 프로브; 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍, 및 서열번호 40의 프로브; 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍, 및 서열번호 41의 프로브; 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 및 서열번호 42의 프로브; 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍, 및 서열번호 43의 프로브; 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍, 및 서열번호 44의 프로브; 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍, 및 서열번호 45의 프로브; 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍, 및 서열번호 46의 프로브; 서열번호 17 및 18의 프라이머 쌍, 및 서열번호 47의 프로브; 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍, 및 서열번호 48의 프로브; 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍, 및 서열번호 50의 프로브; 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍, 및 서열번호 51의 프로브; 서열번호 27 및 28의 프라이머 쌍, 및 서열번호 52의 프로브; 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍, 및 서열번호 53의 프로브; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍, 및 서열번호 54의 프로브를 포함하는 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 구체적으로 유전성 강직성 대마비의 발병 여부를 판단하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로 SPG4 유전자의 결손을 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물은 SPG4 유전자의 결손의 검출에 의해 유전성 강직성 대마비 발병 여부를 진단하는 것일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1 내지 20 및 23 내지 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 39 내지 48 및 50 내지 54의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 것 일 수 있다. 보다 구체적으로 디지털 PCR에 이용되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 포함하는 유전성 강직성 대마비 진단용 키트을 제공한다.
이때, 상기 "유전성 강직성 대마비"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는, 상기 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물을 이용하여 SPG4 유전자의 결손 여부를 분석할 수 있다. 구체적으로, 상기 키트는 dPCR 키트, RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 예로, 상기 키트는 dPCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, dPCR 키트는, dPCR premix, 프라이머, 프로브 및 DNA template 등을 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(Ph 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 유전성 강직성 대마비 진단용 DNA 칩 키트일 수 있다. 본 발명의 용어, "DNA 칩"은 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한 번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다. 상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어 DNA 칩상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, SPG4 유전자의 결손을 검출하는 단계를 포함하는, 유전성 강직성 대마비의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 정보 제공 방법은 SPG4 유전자의 결손을 검출함으로써 유전성 강직성 대마비를 특이적으로 진단하는 방법일 수 있다.
또한, 상기 조성물을 이용하여 SPG4 유전자의 결손을 검출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 "SPG4 유전자", "유전자 결손"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"는 유전성 강직성 대마비가 발병되거나 발병될 가능성이 있는 모든 생물체를 의미하며, 구체적인 예로, 마우스, 원숭이, 소, 돼지, 미니돼지, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "시료"는 유전성 강직성 대마비가 발병되거나 발병될 가능성이 있는 개체로부터 유래한 물질을 의미하며, 구체적으로 세포, 혈액, 혈청, 소변 또는 머리카락일 수 있으나, 개체의 DNA를 확보할 수 있고 그로부터 SPG4 유전자의 결손을 확인할 수 있는 한, 그 종류는 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 하나의 구체예는, SPG4 유전자 결손은 SPG4 유전자의 엑손 1 내지 엑손 10, 엑손 12 내지 엑손 16 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 엑손의 결손인 것인, 방법을 제공한다.
이때, 상기 "엑손"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 구체예는, 상기 검출하는 단계는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 31 및 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머 쌍을 이용하는 것인, 방법을 제공한다.
이때, 상기 "프라이머"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, 상기 검출하는 단계는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및 서열번호 31 및 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 이용하는 것인, 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, 상기 검출하는 단계는 서열번호 39 내지 48 및 50 내지 54의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 서열을 포함하는 1개 이상의 프로브를 추가로 이용하는 것인, 방법을 제공한다.
이때, 상기 "프로브"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 정보 제공 방법은 SPG4 유전자의 특정 엑손을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여, 상기 엑손을 증폭한 후, 상기 증폭된 산물을 프로브를 통해 확인하는 것일 수 있으나, 상기 프라이머 및/또는 프로브를 이용하여 SPG4 유전자의 결손을 확인할 수 있는 한, SPG4 유전자의 결손을 검출하는 방법은 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, 상기 검출하는 단계는 상기 조성물은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 및 서열번호 39의 프로브; 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍, 및 서열번호 40의 프로브; 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍, 및 서열번호 41의 프로브; 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 및 서열번호 42의 프로브; 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍, 및 서열번호 43의 프로브; 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍, 및 서열번호 44의 프로브; 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍, 및 서열번호 45의 프로브; 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍, 및 서열번호 46의 프로브; 서열번호 17 및 18의 프라이머 쌍, 및 서열번호 47의 프로브; 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍, 및 서열번호 48의 프로브; 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍, 및 서열번호 50의 프로브; 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍, 및 서열번호 51의 프로브; 서열번호 27 및 28의 프라이머 쌍, 및 서열번호 52의 프로브; 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍, 및 서열번호 53의 프로브; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍, 및 서열번호 54의 프로브를 이용하는 것인, 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 서열로 구성된 프라이머 쌍 및 프로브의 조합은 SPG4 유전자의 특정 엑손을 특이적으로 높은 민감도 및 선택성을 갖고 검출할 수 있는 효과를 가진다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, SPG4 유전자의 결손을 검출하는 단계는 SPG4 유전자 엑손의 카피수를 확인하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 정보 제공 방법에 있어서, SPG4 유전자의 결손은 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용하여, SPG4 유전자의 1개 이상의 엑손의 결실을 검출하는 것인 이상, 공지의 방법으로 수행될 수 있다. 구체적인 예로서, 참조 유전자 (reference 유전자)에 대해 먼저 PCR을 수행하여, PCR에 의해 얻어진 증폭 산물에서 얻어진 참조 유전자의 농도를 유전자의 카피수가 2개인 경우인 것으로 기준을 설정할 수 있다. 이후, 본 발명의 프라이머 및/또는 프로브를 이용하여 SPG4 유전자 엑손에 대해 PCR을 수행한 후, PCR 산물의 농도를 측정하여, 상기에서 설정된 기준점 (참조 유전자의 농도)와 비교하여, 상기 SPG4 유전자의 카피수를 분석한다. 분석된 카피수가 2 이상일 경우, 유전자의 결손이 없는 것으로 판단할 수 있고, 2 미만일 경우, 유전자의 결손이 있다고 판단할 수 있다. 본 발명에서, 카피수는 하기의 수식에 의해 결정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Figure 112017089959945-pat00001
다만, 상기에 서술한 방법은 프라이머를 이용하여 SPG4 유전자의 결손을 확인할 수 있는 방법 중 하나를 예시로 설명한 것이고, 유전자의 결손을 확인할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, 상기 SPG4 유전자 결손의 검출은 디지털 PCR에 의해 수행하는 것인, 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "디지털 PCR"은 핵산을 탐지하고 정량하는 실시간 PCR의 새로운 접근법으로서, 샘플 내에 단일 반응을 수행하나, 샘플은 다수의 분할 내에 분리되며, 반응은 개별적으로 각각의 분할에서 수행된다. 이 분리는 핵산 양의 민감한 측정을 가능하게 한다. 기존의 qPCR의 결과 분석 방식이 아날로그 방식인 점에 반해, 결과 신호가 0 또는 1의 값을 가져 분석 방식이 디지털 방식인 디지털 PCR 방법은 대용량 시료의 분석 및 한번에 다양한 시료의 검사가 가능한 장점이 있다. qPCR에 비해 디지털 PCR은 10 내지 1,000 피코리터(pico liter)의 극소량 시료로도 분석이 가능하며, 많은 수의 시료를 동시에 처리할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 정확한 정량 분석과 표적 핵산 분자의 고감도 탐지, 병원균 탐지 등 다양한 방면에서 활용이 가능하다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 디지털 PCR을 이용하여 정상인 또는 유전성 강직성 대마비 환자의 SPG4 유전자의 엑손에 대한 정량분석을 실시하였다. 그 결과 정상인은 SPG4 유전자의 엑손이 모두 두 카피씩 확인이 되었으나, 유전성 강직성 대마비 환자는 SPG4 유전자의 일부 엑손의 카피수가 한 개로 결손을 확인하였다(실시예 2, 도 7).
또한, 유전성 강직성 대마비 질환 가계의 환자 및 정상인을 대상으로 상기 디지털 PCR을 수행한 결과, 유전성 강직성 대마비 환자의 경우 SPG4 유전자의 결손 부위를 확인할 수 있었다(실시예 3, 도 8).
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는, 상기 SPG4 유전자의 결손이 확인되면 유전성 강직성 대마비인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 정보 제공 방법은 SPG4 유전자의 특정 엑손의 결실 여부에 대한 정보를 제공하며, 본 발명자들은 유전성 강직성 대마비 환자에게서 SPG4 유전자의 결손이 나타나는 것을 확인한 바, SPG4 유전자의 결손 여부를 확인하여, 상기 결손이 확인되면 유전성 강직성 대마비인것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 프라이머 및/또는 프로브를 이용하여 SPG4 유전자의 1개 이상, 구체적으로 3개 이상, 보다 구체적으로 5개 이상, 보다 더 구체적으로 7개 이상의 엑손이 결실된 것을 확인한 경우, 시료가 분리된 개체가 유전성 강직성 대마비라고 판단할 수 있다.
상기 결실되는 엑손은 SPG4 유전자의 엑손 1 내지 10, 12 내지 16일 수 있고, 보다 구체적으로 엑손 4 내지 7, 12 내지 16일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및 서열번호 31 및 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 포함하는, 유전성 강직성 대마비 진단용 프라이머 세트을 제공한다.
이때, 상기 "프라이머"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "프라이머 세트"는, 상기 특정서열을 갖는 프라이머 쌍의 다양한 조합으로 1개 이상 포함할 수 있으며, SPG4 유전자 결손의 검출을 위해 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예는, 상기 프라이머 세트는 서열번호 39 내지 48 및 50 내지 54의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 서열을 포함하는 1개 이상의 프로브를 추가로 포함하는 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
이때, 상기 "프로브"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 프라이머 세트는 SPG4 유전자의 특정 엑손의 결손을 특이적으로 검출할 수 있으며, 이를 이용하여 유전성 강직성 대마비를 진단할 수 있다.
본 발명의 SPG4 유전자 결손을 검출하기 위한 프라이머를 포함하는, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물은, SPG4 유전자의 엑손을 검출할 수 있으므로, 상기 엑손의 결손을 확인하여 유전성 강직성 대마비 진단에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 유전성 경직성 대마비와 관련된 SPG4 유전자의 200여 개의 점돌연변이 및 거대 결손에 대한 도면이다.
도 2는 기존에 활용되고 있는 유전자 결손확인법인 MPLA법과 디지털 PCR법의 비교분석에 대한 도면이다.
도 3은 SPG4 유전자의 15개의 엑손 확인을 위한 택맨반응 프로브 프라이머에 대한 도면이다.
도 4는 택맨반응 선별을 위한 실시간 PCR 반응의 예시에 대한 도면이다.
도 5는 선별된 택맨반응의 디지털 PCR 결과 분석한 도면이다.
도 6은 선별된 택맨반응의 디지털 PCR 결과 분석한 도면이다.
도 7은 선별된 택맨반응을 이용한 SPG4 유전자의 카피수 결정에 대한 도면이다.
도 8은 선별된 택맨반응을 이용한 HSP 질환을 가진 가계의 SPG4 유전자의 카피수 결정 및 유전자 결손을 확인에 대한 도면이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: SPG4 유전자 엑손 부위 검출을 위한 택맨분석법(Taqman assay)의 고안 및 검증
실시예 1-1: 프라이머 및 프로브의 설계
SPG4 유전자(GenBank accession No. NG_008730.1)의 17개 엑손의 결손 여부를 결정하기 위해서 SPG4 엑손 DNA 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍과, 증폭반응 결과물을 확인할 수 있는 형광표지 프로브를 설계하였다. 반응검출을 위해 프로브의 5'-말단에 FAM 형광물질을 도입하였고, 3'-말단 부위에는 ?처(Quencher)를 붙였다. 또한 이들에 대한 대조군 택맨반응은 카피수 분석반응에서 참조 유전자(Reference gene)로 자주 활용되는 RPPH1(Ribonuclease P RNA component H1: GenBank accession No. NR_002312.1)를 대상으로 설계하였고, 또 다른 HSP유전자인 ATL1(GenBank accession No. NG_009028.1)의 11번째 엑손에 대한 반응 프라이머와 프로브도 설계하였다. 이상의 프라이머 및 프로브들의 서열은 아래 표 1 및 2와 같다.
Figure 112017089959945-pat00002
상기 표 1은 SPG4 유전자의 엑손 17개, ATL1 유전자의 엑손 1개 및 참조반응 유전자에 대한 택맨반응 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure 112017089959945-pat00003
상기 표 2는 SPG4 유전자의 엑손 17개, ATL1 유전자의 엑손 1개 및 참조반응 유전자에 대한 택맨반응 프로브 서열을 나타낸다.
실시예 1-2: 적합한 프라이머 및 프로브의 선택을 위한 리얼타임 PCR의 수행
상기 설계된 프라이머와 프로브들이 택맨반응에 적합한 지 확인하기 위해 실시간 PCR을 수행하였다. 분석대상 시료로는 정상 인체 세포주인 WI38 게놈 DNA (genomic DNA; gDNA)를 사용하였다. gDNA 시료, 상기 표 1의 프라이머와 프로브, 및 PCR 마스터믹스(real-time PCR master mixture)를 이용하여 아래 표 3의 조성대로 PCR 반응을 준비하고 Bio-Rad Realtime PCR detection system을 사용하여 실시간 PCR을 실시하였다.
Figure 112017089959945-pat00004
상기 표 3은 실시간 PCR 반응의 조성을 나타낸다.
PCR은 아래 표 4과 같이 실시하였다.
Figure 112017089959945-pat00005
상기 표 4는 실시간 PCR 반응의 조건을 나타낸다.
실험 결과, 택맨반응이 적절히 진행된 프라이머 및 프로브 세트를 선별하였고(표 1, 표 2, 도 4), 이를 디지털 PCR에 적용하였다. 엑손 11에 대한 실시간 PCR반응은 여러 경우의 반응을 설계하여 시도하였으나 적절한 반응을 도출하지 못하였고, 나머지 엑손들에 대해서는 성공적인 반응결과를 확인한 후 디지털 PCR에 적용하여 카피수 분석을 실시하였다.
실시예 2: 선별된 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 택맨반응을 활용하여 디지털 PCR에의 적용 및 SPG4 유전자 엑손들의 카피수 결정
상기 선별된 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 택맨반응을, QX 200 Droplet Digital PCR system(Bio-Rad)을 사용하여 인체 혈구세포로부터 채취한 gDNA에 대해 실시하였다. 상세한 반응과정은 다음과 같다.
아래 표 5의 조성 대로 PCR 반응 믹스를 준비하고, 방울생성카세트 (droplet generation cassette)에 로딩한 후 방울(droplet)를 형성시켰다.
Figure 112017089959945-pat00006
상기 표 5는 PCR 반응의 방울형성 믹스 조성을 나타낸다.
방울 형성 후 PCR은 아래 표 6의 내용대로 실시하였다.
Figure 112017089959945-pat00007
상기 표 6은 방울 PCR 반응의 조건을 나타낸다.
PCR 반응 후 형광방울 카운팅(Drop counting) 및 실험결과 분석은 분석장비에 설치된 소프트웨어를 사용하였다.
SPG4 엑손 14, 엑손 7, 또는 엑손 17에 대한 디지털 PCR 반응을 예로 들어 결과를 정리하면 도 5 및 6과 같은 결과를 얻을 수 있다. 방울 PCR 수행으로 PCR반응의 절대정량이 가능하였고, 이를 기준으로 타겟유전자의 농도를 계산하였다. 참조 유전자의 농도값을 유전자 카피가 2개인 경우의 기준으로 삼고 아래의 식에 따라 계산하면, 분석시료의 SPG4 엑손 1의 카피수가 2임을 확인할 수 있다.
Figure 112017089959945-pat00008
정상시료에 대한 분석결과이므로 반응이 적절히 진행된 것으로 판단하였다. 이에 SPG4의 엑손 16개에 대한 정량분석을 모두 실시하였다. 그 결과, 엑손 17 에 대한 반응을 제외한 15개의 디지털 PCR 반응이 적절히 수행 가능하여 카피수를 분석하기에 적절함을 검증하였다(도 3).
엑손 11 및 17 에 대해서는 다른 형식의 택맨반응을 설계하여 다시 분석을 시도하였으나 적당한 반응을 선별할 수 없었다.
확인된 분석법을 환자 및 정상인 시료 각각 2명의 유전자 검사에 적용한 결과는 도 7과 같았다. 정상인에서는 SPG4 유전자 엑손 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16 및 ATL1 엑손 11이 두 카피씩 모두 확인되었으나 환자 2명에서는 카피수가 한 개인 부위들이 확인되었다. 환자 1은 SPG4 유전자 엑손 2 내지 6 부위, 엑손 10 내지 16 부위의 카피수가 한 개로 결손이 확인되었고, 환자 2에서는 엑손 4 내지 16 부위의 결손이 확인되었다. 하지만 ATL1 유전자 엑손 11은 정상인 및 환자 모두에게서 두 카피씩 확인되었다. 이를 통해, 선별된 디지털 PCR반응이 임상적용이 가능함을 확인하였다.
실시예 3: 디지털 PCR을 이용한 SPG4 유전자 거대 결손 분석
상기 실시예에서 검증한 SPG4 엑손 15개의 카피수 변이 분석법을 유전성 강직성 대마비 질환 가계의 환자 및 정상인을 대상으로 실시하였다. HSPS-19 가계의 정상 및 환자 7명, HSPS-23 가계 환자 1명, 그리고 HSPS-26 가계 2명, 총 10명의 gDNA를 10ng씩 사용한 17개의 택맨반응이 2~3시간 이내에 가능하였고, PCR 결과 분석으로 각 엑손의 카피수를 얻을 수 있었다(도 8). 그 결과를 정리하면 유전자 결손부위를 확인할 수 있었는데, HSPS-19번 가계에는 SPG4 유전자의 엑손 2~7, 엑손 11~16 부위의 카피수가 1로 확인되는 유전자거대결손부위임을 알 수 있었다. 하지만 이 가계에 유전자 결손을 받지 않은 자손들은 모든 엑손이 두 카피로 정상적인 상태를 유지함을 알 수 있었다. HSPS-23 환자는 엑손 4 내지 17의 카피수가 절반으로 확인되서 거대결손부위를 형성함을 증명할 수 있었다. HSPS-26가계에서는 SPG4유전자 엑손 1 내지 16 이 모두 검출되지 않아 유전자 거대결손을 형성함을 확인하였다.
상기 결과로 디지털 PCR을 이용한 카피수 변이 검증법이 소량의 시료로 유전자 거대결손을 확인하는데 신속 및 정확하게 활용될 수 있음을 입증하였다. 이는 기존의 유전자결손 검증법인 MLPA법이 1일 이상의 분석시간과 수십 ug의 gDNA가 분석에 필요한 것에 비하면 월등한 장점을 갖는 것으로 판단된다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Verification of large deletion of SPG4 gene associated Hereditary spastic paraplegia(HSP) using digital PCR <130> KPA170430-KR <160> 57 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 1_F <400> 1 ttctcctacc cgctgtttgt 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 1_R <400> 2 cagagccaca cgaagagga 19 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 2_F <400> 3 agcatgattt gcaatattta gtgtac 26 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 2_R <400> 4 cctttttcca gttcttcaat acc 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 3_F <400> 5 gagctagacg ccttcaagct a 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 3_R <400> 6 cccacatcaa attatacatt aattg 25 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 4_F <400> 7 gtcacaaacg gacgtctata atg 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 4_R <400> 8 gcttgcatgc aaagtaagag tc 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 5_F <400> 9 cactgcctcg ttcaaaaaca 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 5_R <400> 10 ttcactccag aaaccatgga ta 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 6_F <400> 11 ccctacaact gctactcgta aga 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 6_R <400> 12 atggcaaaac ttacttgtcc ac 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 7_F <400> 13 cttgtttctt agtggaacag ctg 23 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 7_R <400> 14 ctcaggcctc agagaagga 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 8_F <400> 15 tcacagggct tagagctcc 19 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 8_R <400> 16 aactcaaatt tgaagagaac cct 23 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 9_F <400> 17 ctaatttaat atttgctctt gtgattt 27 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 9_R <400> 18 ggaaacagag cactcacgta 20 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 10_F <400> 19 ctggaataat gttgcatttt atg 23 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 10_R <400> 20 gaaaatatgt tcttacctaa aacaaag 27 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 11_F <400> 21 agatgaagtt gatagccttt tgt 23 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 11_R <400> 22 cataatcaac acttacacca tcaa 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 12_F <400> 23 gcatgtattt ccatataaat ctcc 24 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 12_R <400> 24 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Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 17_F <400> 33 ctcgactcac cacaacctcc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 17_R <400> 34 aattagctgg ggtagtggcg 20 <210> 35 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATL1_F <400> 35 ggccacagca gaagct 16 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATL1_R <400> 36 gaatgagttg catgaaggat a 21 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPPH1_F <400> 37 gtcccttggg aaggtctg 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPPH1_R <400> 38 ccgttctctg ggaactca 18 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 1_Probe <400> 39 cgcgctgctg cgtttggtcg cc 22 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 2_Probe <400> 40 caggacagaa ggagcaagct gtgga 25 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 3_Probe <400> 41 tttggttatg gccaaggacc gctt 24 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 4_Probe <400> 42 tggcatgccg caatggacat 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 5_Probe <400> 43 tgcaggcctt tcaggccacc 20 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 6_Probe <400> 44 aggaatgtgg acagcaacct tgctaac 27 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 7_Probe <400> 45 caagacttgg caaaacaagc attgca 26 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 8_Probe <400> 46 tttggtccac ctgggaatgg ga 22 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 9_Probe <400> 47 ctaaagcagt agctgcagaa tcgaatgca 29 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 10_Probe <400> 48 agggctcttt ttgctgtggc tcg 23 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 11_Probe <400> 49 ggagcacgat gctagtagac gcct 24 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 12_Probe <400> 50 cagcctcatc aagctcttgt ggcc 24 <210> 51 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 13_Probe <400> 51 taagtcttcc aatccatggt acagctac 28 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 14_Probe <400> 52 ccaaattact cacctagcaa gttgtgc 27 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 15_Probe <400> 53 tgcactccag cctgggcaac 20 <210> 54 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 16_Probe <400> 54 caggtgaaga atatgtctgc cagtgagg 28 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPG4_EXON 17_Probe <400> 55 tgcctcagcc tcccgagtag ctg 23 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATL1_Probe <400> 56 cagccgtggc aactgccaag 20 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPPH1_Probe <400> 57 ctgagactag ggccagaggc gg 22

Claims (18)

  1. SPG4 유전자 결손을 검출하기 위한 프라이머를 포함하는, 유전성 강직성 대마비 진단용 키트로서, 상기 키트는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및 서열번호 31 및 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 포함하는 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SPG4 유전자 결손은 SPG4 유전자의 엑손 1 내지 엑손 10, 엑손 12 내지 엑손 16 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 엑손의 결손인 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 키트.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 키트는 프로브를 추가로 포함하는 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 39 내지 48 및 50 내지 54의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 서열을 포함하는 1개 이상의 프로브인, 유전성 강직성 대마비 진단용 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 39의 프로브, 서열번호 40의 프로브, 서열번호 41의 프로브, 서열번호 42의 프로브, 서열번호 43의 프로브, 서열번호 44의 프로브, 서열번호 45의 프로브, 서열번호 46의 프로브, 서열번호 47의 프로브, 서열번호 48의 프로브, 서열번호 50의 프로브, 서열번호 51의 프로브, 서열번호 52의 프로브, 서열번호 53의 프로브 및 서열번호 54의 프로브인, 유전성 강직성 대마비 진단용 키트.
  8. SPG4 유전자 결손을 검출하기 위한 프라이머를 포함하는, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물로서, 상기 조성물은 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및 서열번호 31 및 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 포함하는 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 39의 프로브, 서열번호 40의 프로브, 서열번호 41의 프로브, 서열번호 42의 프로브, 서열번호 43의 프로브, 서열번호 44의 프로브, 서열번호 45의 프로브, 서열번호 46의 프로브, 서열번호 47의 프로브, 서열번호 48의 프로브, 서열번호 50의 프로브, 서열번호 51의 프로브, 서열번호 52의 프로브, 서열번호 53의 프로브, 서열번호 54의 프로브 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 프로브를 추가로 포함하는 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 조성물.
  10. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, SPG4 유전자의 결손을 검출하는 단계로서, 상기 검출하는 단계는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및 서열번호 31 및 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 이용하는 단계를 포함하는, 유전성 강직성 대마비 진단을 위한 정보 제공 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 SPG4 유전자 결손은 SPG4 유전자의 엑손 1 내지 엑손 10, 엑손 12 내지 엑손 16 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 엑손의 결손인 것인, 방법.
  12. 삭제
  13. 제10항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 서열번호 39 내지 48 및 50 내지 54의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 서열을 포함하는 1개 이상의 프로브를 추가로 이용하는 것인, 방법.
  14. 삭제
  15. 제10항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 디지털 PCR에 의해 수행하는 것인, 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 SPG4 유전자의 결손이 확인되면 유전성 강직성 대마비인 것으로 판단하는 단계를 추가적으로 포함하는, 방법.
  17. 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및 서열번호 31 및 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 포함하는, 유전성 강직성 대마비 진단용 프라이머 세트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 39 내지 48 및 50 내지 54 의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 서열을 포함하는 1개 이상의 프로브를 추가로 포함하는 것인, 유전성 강직성 대마비 진단용 프라이머 세트.
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US6924126B1 (en) 1999-09-03 2005-08-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Cloning, expression and characterization of the SPG4 gene responsible for the most frequent form of autosomal spastic paraplegia
WO2009121897A1 (en) 2008-04-02 2009-10-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Diagnosis of hereditary spastic paraplegias (hsp) by identification of a mutation in the zfyve26 gene or protein

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