JPWO2012043633A1 - 優性変異遺伝子発現抑制剤 - Google Patents
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Abstract
Description
ASPスコア=[(対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比)−(対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比)]×(1−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比)
(式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である)
前記RNAi分子が標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する16〜30塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって4〜15番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、前記遺伝子発現抑制剤。
ASPスコア=[(対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比)−(対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比)]×(1−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比)
(式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である)
前記RNAi分子が標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する16〜30塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって4〜15番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、前記遺伝子発現抑制剤。
を含む、前記設計方法。
ASPスコアは、以下の式から算出される、前記設計方法。
(式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である)
(23)RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、(21)又は(22)に記載の設計方法。
1−1.概要
本発明の第1の実施形態は、優性変異遺伝子発現抑制剤である。本発明の抑制剤は、RNAi分子及び/又はそれをコードする発現ベクターを有効成分として含み、優性変異遺伝子の発現を選択的に抑制することを特徴とする。
本明細書において、「RNAi分子」とは、生体内においてRNA干渉(RNA interference)を誘導し、標的とする優性変異遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を転写後翻訳前に抑制(サイレンシング)することができる分子をいう。RNAi機構を介して遺伝子の発現を抑制できる分子であれば、一本鎖分子又は二本鎖分子のいずれであってもよい。例えば、siRNA(small interfering RNA)のような二本鎖分子、shRNA(short hairpin RNA)又はmiRNA(micro RNA)のような一本鎖分子が挙げられる。RNA干渉については、例えば、Bass B.L., 2000, Cell, 101, 235-238;Sharp P.A., 2001, Genes Dev., 15 ,485-490;Zamore P.D., 2002, Science, 296, 1265-1269;Dernburg ,A.F. & Karpen, G.H., 2002, Cell, 111,159-162を参照されたい。なお、本明細書では、RNAi機構を介した転写後の遺伝子サイレンシングを、以下、「遺伝子の発現抑制」として表す。
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子は、標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点を含むRNAiセンス鎖領域、及びそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含む。
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子は、いずれの形態の場合にも、RNAiセンス鎖領域(0601)、RNAiアンチセンス鎖領域(0602)及び不連続接合点(0603)を必須の構成要素として含む。以下、RNAi分子に共通する構成要素について説明をする。
式中、対照RNAi分子は、本実施形態の有効成分であるsiRNA分子のネガティブコントロールとなるRNAi分子で、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子であり、それ故、上記式では、対照RNAi分子で処理した標準化した遺伝子の発現量を100%とみなす。例えば、標的となる遺伝子が存在しない任意の塩基配列を含むRNAi分子が該当する。上記式において、標準化後の発現量の相対比が「1.0」を超えた場合、それは発現抑制効果が無いものとみなし、その相対比を「1.0」として算出する。
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子がsiRNAのような二本鎖分子の場合、前記図6Aに示すように、上記RNAi分子共通構成要素であるRNAiセンス鎖領域(0601)、RNAiアンチセンス鎖領域(0602)及び不連続接合点(0603)に加えて、任意でさらにそれぞれのポリペプチド鎖の3’末端に3’末端付加塩基(0606)を含むことができる。「3’末端付加塩基」(0606)は、TT(チミン‐チミン)又はUU(ウラシル‐ウラシル)の2塩基で構成される。この塩基を付加したRNAi分子は、RNAi抑制効率を高めることができる(Tuschl T et al., 1999, Genes Dev, 13(24):3191-7)。
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子がshRNAのような一本鎖分子の場合、前記図6Bに示すように、上記RNAi分子共通構成要素であるRNAiセンス鎖領域(0601)、RNAiアンチセンス鎖領域(0602)及び不連続接合点(0603)に加えて、さらにRNAiセンス鎖領域(0601)と、それとは逆向きのRNAiアンチセンス鎖領域(0602)とを連結する短いスペーサー配列(0608)を含む。スペーサー配列は、通常3〜24塩基、好ましくは、4〜15塩基からなる任意の塩基配列とすることができる。したがって、RNAi分子が一本鎖の場合、分子全体として、35塩基(16×2+3)〜84塩基(30×2+24)からなる。RNAi分子内では、RNAiセンス鎖領域とRNAiアンチセンス鎖領域が互いに塩基対合し、その間に位置するスペーサー配列がループ構造を形成することによって、分子全体がヘアピン型のステム−ループ構造をなし得る。前記構造を有する一本鎖RNAi分子が細胞内に導入されると、細胞質内でDicerと呼ばれるエンドヌクレアーゼの働きによって二本鎖siRNAに加工され、そのうちRNAiアンチセンス鎖領域がRISC(RNA-induced silencing complex)複合体に取り込まれた後、前述の二本鎖RNAi分子と同様のRNAi機構によって標的遺伝子の転写後翻訳前発現を抑制することができる。一本鎖分子におけるRNAiセンス鎖領域(0601)とRNAiアンチセンス鎖領域(0602)は、前記二本鎖RNAi分子と同様に、それぞれの領域の3’末端に3’末端付加塩基を含むこともできる。一本鎖分子における5’末端、及び/又は3’末端には、任意の配列を付加することもできる。例えば、5’末端及び/又は3’末端にステムループ構造を形成し得る塩基配列を付加することもできる。
本明細書において「発現ベクター」とは、本実施形態の阻害剤に含まれる有効成分であって、前記RNAi分子をコードするDNAを発現可能なように発現用ベクター内に挿入したベクターである。
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子の設計方法について説明をする。本設計方法は、図7で示すように、基準塩基設定工程(0701)、3’末端塩基設定工程(0702)、RNAiセンス鎖領域設定工程(0703)、及びRNAiアンチセンス鎖領域設定工程(0704)を含む。以下、それぞれの工程について説明をする。
本実施形態の抑制剤に含まれる発現ベクターの調製方法は、基本的には、当該分野で公知の方法、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法に従って調製することができる。
本実施形態の優性変異遺伝子発現抑制剤の一例として、変異型EGFR(上皮成長因子受容体)遺伝子の発現を特異的に抑制するRNAi分子(EGFR-RNAi分子)を有効成分とする変異型EGFR遺伝子発現抑制剤が挙げられる。ここでいう変異型EGFR遺伝子とは、後天的に発生する優性変異遺伝子で、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer;NSCLC)の原因となる遺伝子である。EGFRの細胞外ドメインに上皮成長因子(EGF)等のリガンドが結合すると、通常は細胞内ドメインのチロシンキナーゼ活性化され、自己リン酸化作用が作動する。変異型EGFR遺伝子では、EGFR遺伝子の特定の塩基に置換、欠失、挿入が生じ、下流の細胞内シグナル伝達経路が構成的に活性化状態にある機能獲得型となることによって発生すると考えられている(Paez G.J. et al., Science, 2004, 304;1497-1500)。
本実施形態の優性変異遺伝子発現抑制剤の一例として、フィラデルフィア染色体における転座変異によって生じたBCR-ABLキメラ遺伝子の発現を特異的に抑制するRNAi分子(BCR-ABL-RNAi分子)を有効成分とするBCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤が挙げられる。ここでいうBCR-ABLキメラ遺伝子とは、後天的に発生する優性変異遺伝子で、慢性骨髄性白血病(CML)又は急性リンパ性白血病(ALL)の原因遺伝子とみなされている。
本実施形態の遺伝子発現抑制剤によれば、有効成分のRNAi分子は、非標的遺伝子の発現に対しては、ほとんど影響を及ぼすことなく、標的遺伝子の発現を選択的、かつ効率的に抑制することができる。
本発明の第2の実施形態は、医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、有効成分として前記実施形態1の優性変異遺伝子発現抑制剤を含有する。優性変異遺伝子発現抑制剤は、標的とする優性変異遺伝子に対するRNAi分子又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを、単独で含んでいても良いし、同一遺伝子を標的とする一以上の異なるRNAi分子及び/又は一以上の異なるRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含んでいてもよい。
本実施形態の医薬組成物は、目的とする疾患の治療のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
本発明の医薬組成物は、疾患の治療用として使用される。例えば、常染色体優性遺伝疾患のような優性変異遺伝子の発現を原因とする疾患において適用することで、その変異遺伝子の発現を選択的に抑制し、同時に正常な機能を有する遺伝子タンパク質をコードする野生型遺伝子の形質を顕在化できることから、従来その治療が困難であった遺伝病や癌等の治療の他、動植物の品種改良等に利用することができる。したがって、本実施形態の医薬組成物の対象となる疾患は、抑制剤に含まれるRNAi分子又は発現ベクターから発現されるRNAi分子が、標的とする優性変異遺伝子の優性形質に基づく疾患である。このような疾患の具体例としては、例えば、後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた突然変異による疾患や常染色体優性変異疾患を含む。これらの疾患の具体的な例については、前述の通りである。したがって、本実施形態の医薬組成物は、治療対象となる疾患に応じて、その原因遺伝子である優性変異遺伝子に対するRNAi分子又はそれをコードするDNAを含む発現ベクターを有効成分として用いることで、様々な疾患に対して適用できる。
変異型EGFR(上皮成長因子受容体)遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNA(EGFR-siRNA)を設計し、変異遺伝子(癌原因遺伝子)に対する発現抑制効果、すなわちASP-RNAi(アレル特異的遺伝子サイレンシング:allele-specific RNAi)効果について検証した。
非小細胞肺癌患者では、EGFR遺伝子(アクセッションNo.NM_005228)内に疾患と関連する様々な変異(機能獲得型変異)が見つかっている。例えば、図8−1Aで示すような2235番目から2249番目(開始コドンのAを1番目とする。以下、同じ)の塩基配列が欠失した「del(E746-A750)変異」(前記遺伝子の欠失変異に伴い、開始メチオニンを1番目としたときに746番目のグルタミン酸から750番目までのアラニンが欠失した変異タンパク質を生じる)、図9−1Aで示すような2240番目から2251番目までの塩基配列が欠失した「del(L747-T751)-L747S変異」(前記遺伝子の欠失変異に伴い、747番目のロイシンから751番目のトレオニンが欠失し、また747番目のロイシンがセリンに置換された変異タンパク質を生じる)、図10−1Aで示すような2238番目から2248番目の塩基配列が欠失し、その欠失部位に新たに2塩基が挿入された「del(L747-E749)-A750P(G)変異」(前記遺伝子の欠失/挿入変異に伴い、747番目のロイシンから749番目までのグルタミン酸が欠失し、750番目のアラニンがプロリンに置換された変異タンパク質を生じる)、さらに図11−1Aで示すような開始コドンのAから2238番目に相当する塩基、すなわちE746をコードするコドン(GAG)の三番目の塩基が「G」(Pao et al., 2005, PloS Medicine, Vol. 2, Issue 3: e73)ではなく「A」(Paez et al.,2004、 Science, vol.304, 1497-1500)である「del(L747-E749)-A750P(A)変異」等がある。そして、その他、点突然変異も挙げられる。
上記del(E746-A750)変異、del(L747-T751)-L747S変異及びdel(L747-E749)-A750P変異については、その変異遺伝子産物(変異mRNA)上で、それぞれ図8−1A、9−1A, 10−1A及び11-1Aにおいて矢頭で示した位置に相当する箇所が本明細書に記載の不連続接合点に相当する。すなわち、del(E746-A750)変異遺伝子及びdel(L747-T751)-L747S変異遺伝子の転写産物では不連続接合点がそれぞれ一箇所、またdel(L747-E749)-A750P変異遺伝子の転写産物では二箇所存在することとなる。そこで、この不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第1及び第2基準塩基とした(基準塩基設定工程)。del(L747-E749)-A750P変異遺伝子の転写産物は、2つの不連続接合点を有し、かつそれらが僅か1塩基(L747-E749)-A750P(A)の場合)又は2塩基(L747-E749)-A750P(G)の場合)を挟んで近接している。それ故、ここでは、形式的に3’側に位置する不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第1及び第2基準塩基とした。次に、第2基準塩基に対応する塩基から3’末端までの塩基数を一つずつずらして、RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を設定した(3’末端塩基設定工程)。続いて、各変異遺伝子において、その転写産物の第1及び第2基準塩基を含む連続する19塩基を含む塩基配列をRNAiセンス鎖領域として設定した(RNAiセンス鎖領域設定工程)。また、設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域とした(RNAiアンチセンス鎖領域設定工程)。
前記(1)で調製したEGFR-siRNAのRNAi効果の評価の選定のために、ホタル・ルシフェラーゼ(Photinus luciferase)遺伝子を発現するpGL3-TK (Ohnishi Y., et al., 2006, Journal of RNAi and Gene Silencing, Vol. 2: 154-160)と及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ(Renilla luciferase)遺伝子を発現するphRL-TK プラスミド(Promega社)を用いて、siRNAの標的となる優性変異遺伝子と非標的の野生型遺伝子のレポーター遺伝子発現プラスミドの構築を行った。
ヒト由来株化細胞であるHeLa細胞を10%ウシ胎仔血清(FBS;Invitrogen社)及び抗生物質(100ユニット/mL ペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン;Wako社)含有のDMEM培養液(Wako社)を用いて、5% CO2下で37℃にて培養した。
前記レポーター遺伝子発現プラスミドを用いたレポーターアッセイによって様々なEGFR-siRNAのRNAi効果及びRNAi誘導に好適なRNAi分子の構造的一般法則性について検討した。
del(E746-A750)変異遺伝子に対する各EGFR-siRNAの結果を図8−1Bに、del(L747-T751)-L747S変異遺伝子に対する各EGFR-siRNAの結果を図9−1Bに、そしてdel(L747-E749)-A750P(G)、及びdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子に対する各EGFR-siRNAの結果をそれぞれ図10−1B、及び図11−1Bに、示す。各図において、非標的の野生型EGFR遺伝子と、標的の変異型EGFR遺伝子のルシフェラーゼ活性を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
前記実施例1で、変異型EGFR、すなわち、del(E746-A750)、del(L747-T751)-L747S、del(L747-E749)-A750Pに対して効果的な発現抑制効果を示したEGFR−siRNAについて、それらが内在性の変異型EGFRに対しても特異的な発現抑制効果(ASP-RNAi効果)を示すか否かを検討した。本実験にはEGFR del(L747-E749)-A750Pを有するヒト肺癌由来のPC3細胞を例として使用した。EGFR−siRNAには、実施例1においてdel(L747-E749)-A750P変異に対して、特に発現抑制効果のあったsi747/49-3D19、及びsi747/49(A)-8D19を用いて内在性変異型EGFRのRNAiノックダウンを行った。
(1)細胞培養
ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞であるPC3細胞を10%ウシ胎仔血清(FBS;Invitrogen社)含有のEMEM培養液(Wako社)を用いて、5% CO2下で37℃にて培養した。
前記(1)で培養した細胞をトリプシン消化によって分散させた後、遠心(120G、5分間)によって回収し、約1×106個の細胞をEGFR-siRNA(終濃度5μM)を含む100μLのエレクトロポレーションバッファ(Amaxa Cell Line Nucleofector Solution V、Amaxa社)にて懸濁した。前記エレクトロポレーション用サンプルを3つ調製し、添付されたプロトコールに従ってエレクトロポレーション(プログラム:U-005, 遺伝子導入システムNucleofector, Amaxa社)によって核酸の導入(1つは核酸を入れない対照実験群)を行なった。導入した核酸は、si747/49-3D19、si747/49(A)-8D19と RNAiを誘導しないコントロールsiRNA(QIAGEN社)である。
前記(2)で回収した細胞をTRIzol reagent (Invitrogen社)を用いて、添付されたプロトコールに従って全RNAを回収した。その後、SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen社)及びOligo(dT)15 (Promega社)を用いて逆転写酵素反応によってcDNAを合成し、その後RNaseH (Invitrogen社)処理を行った。前記操作は全て添付されたプロトコールに従い行った。
前記(3)で得たcDNAをAmpliTaq Gold DNA Polymerase (アプライドバイオシステム社)とEGFR変異部位周辺配列を特異的に増幅するプライマーを用いてPCR解析を行った。PCRの温度・時間条件は、初期変性(95℃、10分)後、変性(94℃、30秒)、アニール(55℃、30秒)、伸長反応(72℃、30秒)の3段階を26回繰返す条件とした。その後、PCR増幅産物を電気泳動法(7%ポリアクリルアミドゲル、100mA、1時間)にて解析した。使用したプライマー配列は、表7に示す。
si747/49-3D19での結果を図14に、si747/49(A)-8D19での結果を図15にそれぞれ示す。どちらのEGFR-siRNAも、野生型EGFR遺伝子の発現を抑制することなく、内在性変異型EGFR遺伝子の発現を特異的、かつ強力に抑制することが実証された。
実施例2で示した、EGFR-siRNA(si747/49-3D19、及びsi747/49(A)-8D19)を用いた内在性変異型EGFR(del(L747-E749)-A750P)の特異的かつ効果的な発現抑制が細胞増殖や細胞死に対して影響を与え得るか否かを、全細胞数、細胞毒性、細胞増殖・生存活性、細胞死(アポトーシス)に関して、それぞれ検討した。
前記「実施例2(1)」と同様にPC3細胞の培養を行った。
前記「実施例2(2)」と同様に、エレクトロポレーションを行った。
[方法]
si747/49-3D19導入後のPC3細胞における経時的な細胞数の変化(細胞増殖能)を調べるため、細胞内LDH(Lactate Dehydrogena;乳酸脱水素酵素)量をCytoTox 96(R) Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社)を用いて測定した。実験は、添付されたプロトコールに従って行った。簡潔には、前記アッセイキットに添付された細胞溶解バッファ(Lysis Solution (10x))を全サンプル群の培養液に加え、45分間37℃でインキュベートすることによって全細胞に含有される全てのLDHが放出される。このLDH量を測定することで全細胞数を間接的に算出した。吸光度の測定はBenchMark Plus (BIO-RAD社)を用いた。ネガティブコントロールには、siRNAを加えないサンプル(siRNAなし)とRNAiを誘導しないsiRNA(siControl; QIAGEN社)を添加したサンプルを用いた。
図16に結果を示す。この図では、全細胞数とみなす1日目の「siRNAなし」のLDH量を100%としたときのLDH量の相対値(%)で示した。EGFR-siRNA(si747/49-3D19)は、「siRNAなし」に対しても、また「siControl」に対しても有意にPC3細胞のその全細胞数を減少させた。すなわち、この結果はsi747/49-3D19がPC3細胞の細胞増殖を抑制したことを意味する。また、同時に、構成的活性化により細胞増殖活性を促進するPC3内在性優性変異型EGFR(del(L747-E749)-A750P)遺伝子に対してsi747/49-3D19が特異的かつ効果的に、その発現を抑制したことを示している。
[方法]
si747/49-3D19導入後のPC3細胞における細胞毒性を評価するため、細胞毒性によって細胞外に放出され、培養液中に存在するLDH量をCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社)を用いて測定した。実験操作は、添付されたプロトコールに従って行い、吸光度の測定は、BenchMark Plus (BIO-RAD社)を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ2つのコントロール(siRNAなし及びsiControl)を用いた。
図17に結果を示す。この図では、1日目の「siRNAなし」の全細胞が含有するLDH量(前記細胞増殖能評価実験と同様に細胞溶解バッファを添加したサンプル)を100%としたときの相対値(%)で示している。si747/49-3D19は、「siRNAなし」や「siControl」と同等又はそれ以上に細胞毒性、又は内在性変異型EGFRの発現抑制による細胞死を誘導しないことが明らかとなった。
[方法]
si747/49-3D19導入後のPC3細胞における細胞増殖及び生存活性を評価するために、CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega社)を用いて、生細胞に含まれるNADH(nicotinamide adenine dinucleotide;ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)によるMTS還元作用を測定した。実験操作は、添付されたプロトコールに従って行い、吸光度の測定はBenchMark Plus (BIO-RAD社)を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ2つのコントロール(siRNAなし及びsiControl)を用いた。
si747/49-3D19の結果を図18、si747/49(A)-8D19の結果を図19にそれぞれ示す。この図では、細胞増殖及び生存活性(細胞生存率)を「siRNAなし」の1日目のNADH活性を100%としたときの相対値として示している。si747/49-3D19、及びsi747/49(A)-8D19は、「siRNAなし」及び「siControl」のいずれに対しても有意にその増殖率を抑制し、又は生存率を低下させた。
[方法]
si747/49-3D19導入後のPC3細胞における細胞増殖及び生存活性を評価するため、CellTiter-Glo Assay (Promega社)を用いて、細胞の相対的ATP量を測定した。実験操作は添付されたプロトコールに従って行い、発光量の測定はFusion Universal Microplate Analyzer(Perkin Elmer社)を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ2つのコントロール(siRNAなし及びsiControl)を用いた。
図20に結果を示す。細胞増殖及び生存活性(細胞生存率)は、「siRNAなし」の培養1日目の相対的ATP量を100%としたときの、1日目と4日目の相対値を示している。この図が示すように、si747/49-3D19は、培養4日目には「siRNAなし」及び「siControl」のいずれに対しても有意にその増殖率を抑制し、又は生存率を低下させた。
[方法]
si747/49-3D19導入後のPC3細胞おける細胞死(アポトーシス)評価のため、Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega社)を用いてcaspase3/7の活性を測定した。実験操作は、添付されたプロトコールに従って行い、発光量の測定は、Fusion Universal Microplate Analyzer (Perkin Elmer社)を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ2つのコントロール(siRNAなし及びsiControl)を用いた。
図21に結果を示す。caspase3/7活性は、「siRNAなし」の培養1日目の活性を100%としたときの、1日目と4日目の相対値を示している。この図が示すように、si747/49-3D19は、培養4日目の「siRNAなし」及び「siControl」のいずれと比較してもcaspase3/7活性に有意な変化を示さなかった。これは、si747/49-3D19による変異型EGFR特異的発現抑制がアポトーシスを誘導しないことを示している。
(1)EGFR遺伝子に対するEGFR−siRNAのASP-RNAi効果の検討
[方法]
実施例1で記載したように、非小細胞肺癌患者では、EGFR遺伝子内に疾患と関連する機能獲得型変異として、点突然変異も知られている(Paez G.J. et al., Science, 2004, 304;1497-1500)。例えば、図22Aで示すような2369番目の塩基CがTに置換した「T790M変異」(前記遺伝子の点突然変異に伴い、790番目のトリプトファンがメチオニンにアミノ酸変化(T790M)する点突然変異が挙げられる。このような点突然変異による置換変異を有する変異遺伝子は、その転写産物が不連続接合点を有さないことから、本願実施例1の優性変異遺伝子発現抑制剤の対象とはならない。
前記1で調製したEGFR-siRNAのRNAi効果の評価の選定のために、siRNAの標的となる優性変異遺伝子と非標的の野生型遺伝子のレポーター遺伝子発現プラスミドの構築、細胞培養、トランスフェクション及びレポーターアッセイを行なった。基本的な操作手順は、実施例1に記載の方法に準じた。
結果を図22Bに示す。この図が示すように、si790-9C/U18は、siControlと比較して野生型EGFR遺伝子の発現にも比較的強い抑制効果があることからあまり好ましいsiRNAではなかったが、si790-10C/U18とsi790-11C/U18は、野生型EGFR遺伝子に対する発現抑制効果がほとんどなく、一方、変異型EGFR遺伝子に対しては効果的な抑制作用を有することが明らかとなった。
フィラデルフィア染色体における転座変異によって生じたBCR-ABLキメラ遺伝子を標的とする本実施形態1の構成を有するsiRNA(BCR-ABL-siRNA)を設計し、白血病原因遺伝子であるBCR-ABLキメラ遺伝子に対する発現抑制効果について検証した。
前述のように、BCR-ABLキメラ遺伝子は、フィラデルフィア染色体を有する患者で見出されるCMLやALLの原因遺伝子とみなされており、本発明のBCR-ABL-siRNAが機能亢進型のBCR-ABL遺伝子の発現のみを特異的に抑制することができれば、フィラデルフィア染色体を有する患者でCMLやALLに対する効果的な予防剤又は治療剤となり得る。
Ph転座におけるBCR遺伝子の切断点は、Major-BCR(下流:M-BCR)とminor-BCR(上流:m-BCR)の二箇所に集中していることが知られているが、慢性好中球性白血病/本態性血小板血症では、さらに下流のμ-BCR(p230)の関与が報告されている。それぞれp210BCR/ABL(M-BCR切断点)、p190BCR/ABL(m−BCR切断点)、p230BCR/ABL(μ-BCR切断点)の蛋白が生じ、このうちp210BCR/ABLはCMLのほぼ全例及びPh陽性ALLに、p190BCR/ABLはPh陽性ALLの残り半数の患者に認められる。
上記M-BCRを切断点とするBCR−ABLキメラ遺伝子については、その変異遺伝子産物(変異mRNA)上で、野生型ABL遺伝子と野生型BCL遺伝子のそれぞれに対して図12−1A、及び13−1Aにおいて矢頭で示した位置に相当する箇所が本明細書に記載の不連続接合点に相当する。この不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第1及び第2基準塩基として、実施例1と同様の方法によりBCR-ABL-siRNAの設計し、調製した。
レポーター遺伝子発現プラスミドの構築、変異部位を含む合成オリゴDNAの設計、レポーター遺伝子発現プラスミドへの挿入、選定方法については、実施例1の「(3)レポーター遺伝子発現プラスミドの構築」に記載の方法に準じた。使用した合成オリゴDNAの具体的な塩基配列を表10に示す。
実施例1の「(4)細胞培養」に記載の方法に準じた。
実施例1の「(5)トランスフェクション及びレポーターアッセイ」に記載の方法に準じた。
BCR-ABLキメラ遺伝子に対する各BCR-ABL-siRNAの結果を図12−1B及び図13−1Bに示す。各BCR-ABL-siRNAの該遺伝子に対する特異的発現抑制効果を評価するためには、BCR-ABLキメラ遺伝子と二つの野生型遺伝子(ABL遺伝子とBCR遺伝子)に対して評価しなければならない。そのため、各BCR-ABL-siRNAの標的遺伝子特異的発現抑制効果をBCR-ABLキメラ遺伝子と野生型ABL遺伝子(図12−1B)、そしてBCR-ABLキメラ遺伝子と野生型BCR遺伝子(図13−1B)の組み合わせで評価した。また前記と同様に、各図において、非標的の野生型ABL又はBCR遺伝子と、標的のBCR-ABLキメラ遺伝子のルシフェラーゼ活性を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
前記実施例1でEGFRのdel(L747-E749)-A750P変異又はdel(E746-A750)変異に対してそれぞれ特異的な発現抑制を示したEGFR−siRNA、及び変異型EGFRを発現する非小細胞肺癌に対して有効とされる抗癌剤ゲフィチニブを用いて、それぞれの細胞増殖及び細胞生存活性に対する影響について検証した。
(1)細胞培養
解析には、EGFRのdel(L747-E749)-A750P変異及びdel(E746-A750)変異を有するヒト非小細胞肺癌由来株化細胞であるPC3細胞及びPC9細胞、及び対照用に野生型EGFRを有するヒトHeLa細胞を用いた。PC3細胞の培養は、前記「実施例2:(1)」と、またHeLa細胞の培養は、前記「実施例1:(4)」と同様に行った。PC9細胞は、10%ウシ胎仔血清(FBS;Invitrogen社)含有のRPMI-1640培養液(Wako社)を用いて、5% CO2下で37℃にて培養した。
培養したPC3細胞、PC9細胞及びHeLa細胞を、トリプシン消化によって分散させた後、遠心(120G、5分間)によって回収し、96ウェル培養プレートにて細胞培養(細胞密度:約1×105個/cm2)を行った。24時間後、終濃度0、10-3、10-2、10-1、100及び101μMのゲフィチニブ(商品名:イレッサ;アストラゼネカ社)に曝露し、3日後に細胞生存活性を測定した。
前記「実施例2:(2)」と同様の方法で、EGFR-siRNAの細胞導入を行った。具体的には、前記(1)の培養液で培養したPC3細胞をトリプシン消化によって分散させた後、遠心(120G、5分間)によって回収し、約1×106個の細胞を、終濃度100、50、25、10、5、1及び0nMのEGFR-siRNA(si747/49-3D19)又はRNAiを誘導しないsiRNA(siControl; QIAGEN社)を含む100μLのエレクトロポレーションバッファ(Amaxa Cell Line Nucleofector Solution V、Amaxa社)にて懸濁した。添付されたプロトコールに従ってエレクトロポレーション(プログラム:U-005, 遺伝子導入システムNucleofector, Amaxa社)を行い、前記siRNAを細胞に導入した。「実施例2:(1)」に記載の培地で培養し、3日後に細胞生存活性を測定した。
前記(1)96ウェル培養プレートにて細胞培養(細胞密度:約1×105個/cm2)を行った。終濃度100、50、25、10、5、1及び0nMのEGFR-siRNA (si746/50-4D19)及びRNAiを誘導しないsiRNA(siControl; QIAGEN社)を、リポフェクタミン2000(Invitrogen社)を用いてPC9細胞に導入した。トランスフェクション法は、添付されたプロトコールに従った。培養3日後に細胞生存活性を測定した。
前記「実施例3;3.細胞増殖及び生存活性評価(1)」と同様の方法で評価した。
(1)細胞増殖及び生存活性に対するゲフィチニブの影響
ゲフィチニブによる各細胞の細胞増殖及び生存活性の結果を図23A〜Cに示す。図23Aは、del(L747-E749)-A750P変異を有するPC3細胞の、図23Bは、del(E746-A750)変異を有するPC9細胞の、図23CはHeLa細胞の結果である。各図は、それぞれ無処置の細胞における細胞生存活性を100%としたときの相対値を示している。
EGFR-siRNAによる各細胞の細胞増殖及び生存活性結果を図24A〜Cに示す。
細胞レベルで検証したEGFR-siRNAの効果を個体レベルで検証した。
ヌードマウスの皮下にPC3細胞を移植し、マウス皮下腫瘍モデルを作出し、そのモデルマウスを用いてEGFR-siRNA投与による腫瘍成長阻害効果を検証した。
(i)細胞培養
前記「実施例2:(1)」と同様の方法でPC3細胞を培養した。
培養したPC3細胞を、トリプシン消化によって分散させた後、遠心(120G、5分間)によって回収し、血清及び抗生物質不含の培養液(RPMI-1640、Wako社)で再懸濁し、細胞数1×107cells/mLに調製した。この細胞懸濁液と、BDマトリゲル基底膜マトリックス(ベクトン・ディッキンソン社)を等量混ぜ合わせ、細胞数5×106cells/mLに調製した。これを、免疫不全モデルのヌードマウス(5週齢、BALB/cAJcl-nu/nu、日本クレア株式会社)の右側腹部に100μL(0.5×106cells)で皮下投与した。
(i)EGFR-siRNAの調製と投与
アテロコラーゲンを主成分とする核酸デリバリー媒体であるAteloGene(登録商標) Local Use(株式会社 高研)と、実施例1〜3でPC3細胞に対して効果的な細胞増殖抑制効果を示したsi747/49-3D19、又はsi747/49(A)-8D19との複合体を調製した。調製法は、添付されたプロトコールに従い、EGFR-siRNA(si747/49-3D19、又はsi747/49(A)-8D19)の終濃度は、0.1mg/mLとした。対照実験としてRNAiを誘導しないsiRNA(siControl; QIAGEN社)も同様に調製し、siRNAを含まないアテロコラーゲン液も調製した。
PC3細胞を移植して1週間後(6週齢)に腫瘍径より腫瘍体積を算出し、約50mm3に達した腫瘍に対して、前記で調製した3つのサンプル、すなわちsiRNA不含のアテロコラーゲン溶液、siControl及びEGFR-siRNAの20μg/200μL溶液を、それぞれ1.0mg/kg体重で腫瘍に直接単回投与した。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した。
(iii)siRNA投与後の経過観察
siRNA等の投与3週目(9週齢)(図25A、si747/49-3D19;図28A、si747/49(A)-8D19)に、前記計算式により腫瘍体積を測定し、さらに腫瘍を取り出して(図25B、si747/49-3D19;図28B、si747/49(A)-8D19)、湿重量を計測した。
EGFR-siRNAの投与による腫瘍体積の時間経過を図26(si747/49-3D19投与)、図29(si747/49(A)-8D19投与)に、摘出した腫瘍の湿重量を図27(si747/49-3D19投与)、図30(si747/49(A)-8D19投与)に、それぞれ示す。EGFR-siRNA(si747/49-3D19、又はsi747/49(A)-8D19)を投与した個体群は、アテロコラーゲン溶液のみ及びsiControlを投与した個体群と比較して、皮下腫瘍の肥大が有意に抑制されることが示された。さらに、腫瘍の湿重量もそれらと比較して有意に低下していた。
上述の実施例で立証したように、本発明のEGFR-siRNAは変異型のEGFR遺伝子のみを特異的に発現抑制するのに対して、従来のsiRNAは野生型及び変異型のEGFR遺伝子を区別せず両者を強く発現抑制する。そこで、本発明のEGFR-siRNAと従来のsiRNAをマウス個体に投与した場合の副作用の有無について検証した。
ICRマウス(雄、10週齢)の腹腔内に各種siRNAを投与した。実験群は、siRNAを投与しないアテロコラーゲン溶液のみの群(siRNAなし)と、RNAiを誘導しないsiRNA(siControl; QIAGEN社)、変異型EGFR遺伝子を特異的に発現抑制するsi747/49-3D19、及びマウス生体内で発現している内在性野生型EGFR遺伝子を発現抑制するsiEgfrをぞれぞれ投与した、計4群である。これらは、前記実施例7と同様の方法で調製し、マウス腹腔内に投与した。なお、本実施例で設計し、使用したsiEgfrの具体的な塩基配列を表11に示す。
図31に結果を示す。血漿中の全ビリルビン(A)、直接ビリルビン(B)、間接ビリルビン(C)、及びアルカリホスファターゼ(D)の量に関して、siRNAなし群及びsiControl投与群と比較すると、内在性野生型EGFR遺伝子を発現抑制するsiEgfr投与群では、有意な上昇が観察された。一方、本発明のEGFR-siRNA(si747/49-3D19)投与群では、有意な変化は観察されなかった。この血中パラメーターの有意な上昇は、siEgfrの投与によって内在性野生型EGFRの発現が抑制されたことに起因し、変化した血中パラメーターのデータから肝胆道系の障害が惹起されたことが示唆された。また、内在性野生型EGFR遺伝子が肝細胞の再生に必要であることから(Natarajan et al., 2007, Proc Natl Acad Sci U S A., Vol. 104: 17081-17086)、まとめると、内在性野生型EGFR遺伝子の発現抑制は重篤な副作用をひき起こす危険性があることが示唆された。それに対して、本発明のEGFR-siRNAの投与は、血中パラメーターに全く影響せず、内在性野生型EGFR遺伝子の発現にほとんど影響を及ぼさないことが立証された。この結果は、本発明のEGFR-siRNAが、従来のEGFR-siRNAとは異なり、上記のような肝胆道系の障害等の副作用を生じる危険性がないか、又は極めて低いことを示唆している。これにより、本発明の優性変異遺伝子の発現抑制剤のRNA干渉技術の有用性が立証された。
Claims (23)
- ASPスコア値が0.4以上であるRNAi分子を有効成分として含む、優性変異遺伝子の発現抑制剤であって、
前記ASPスコアは、以下の式から算出され、
ASPスコア=[(対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比)−(対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比)]×(1−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比)
(式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である)
前記RNAi分子が
標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する16〜30塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ
前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって4〜15番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、
前記遺伝子発現抑制剤。 - ASPスコア値が0.4以上であるRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分として含む、優性変異遺伝子の発現抑制剤であって、
前記ASPスコアは、
以下の式から算出され、
ASPスコア=[(対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比)−(対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比)]×(1−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比)
(式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である)
前記RNAi分子が
標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する16〜30塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ
前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって4〜15番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、
前記遺伝子発現抑制剤。 - RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、請求項1又は2に記載の抑制剤。
- RNAi分子がsiRNAである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抑制剤。
- RNAi分子がshRNAである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抑制剤。
- 優性変異遺伝子における変異が塩基の欠失、塩基の挿入、スプライス部位を破壊し得る塩基の置換、遺伝子の重複、遺伝子の転座、及び染色体の逆位からなる一群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抑制剤。
- 優性変異遺伝子が機能獲得型である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抑制剤。
- 優性変異遺伝子が疾患の発症に関与する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抑制剤。
- 疾患が悪性新生物である、請求項8に記載の抑制剤。
- 悪性新生物が非小細胞肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型EGFR遺伝子であるか、悪性新生物が大腸癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型CTNNB1遺伝子であるか、悪性新生物が胃癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型CDH1遺伝子であるか、悪性新生物が乳癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型BRCA1遺伝子若しくは変異型BRCA2遺伝子であるか、悪性新生物が多腺性自己免疫性内分泌不全症I型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型AIRE遺伝子であるか、悪性新生物が自己免疫性リンパ増殖症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型TNFRSF6/APT1/FAS遺伝子であるか、悪性新生物が慢性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がBCR-ABLキメラ遺伝子であるか、悪性新生物がバーキットリンパ腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がc-myc-IgH-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が未分化型大細胞リンパ腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がNPM-ALK-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEML4-ALK-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が隆起性皮膚線維肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPDGFB-COL1A1キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が先天性線維肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がETV6-NTRK3キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が低悪性線維粘液肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がFUS-CREB3L2キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が骨外性粘液型軟骨肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEWS-CHNキメラ遺伝子であるか、悪性新生物がユーイング肉腫若しくは線維形成性小細胞腫瘍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEWSR1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が胞巣型横紋筋肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSYT遺伝子若しくはSSX遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が炎症性筋線維芽細胞性腫瘍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がALK遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が脂肪肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCHOP遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、又は悪性新生物が軟部明細胞肉腫若しくは悪性線維性組織球腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がATF1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子である、請求項9に記載の抑制剤。
- 悪性新生物が非小細胞肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型EGFR遺伝子である、請求項10に記載の抑制剤。
- RNAi分子のセンス鎖領域が、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、59、61、63、65、67、129、131、133、135、137、139、141、143又は145で示されるヌクレオチドからなる、請求項11に記載の抑制剤。
- 悪性新生物が慢性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がBCR-ABLキメラ遺伝子である、請求項10に記載の抑制剤。
- RNAi分子のセンス鎖領域が、配列番号97、99、101、103、105、107、109、111又は113で示されるヌクレオチドからなる、請求項13に記載の抑制剤。
- 疾患がヒト常染色体優性変異疾患である、請求項8に記載の抑制剤。
- ヒト常染色体優性変異疾患が先天性夜盲症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がRHO遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が難聴遺伝子領域DFNA2で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNQ4遺伝子若しくはGJB遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がワールデンブルグ症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMITF遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が非症候性難聴で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がDIAPH1/DFNA1遺伝子若しくはPOU4F3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTNNT2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が家族性肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMYBPC3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が心尖部肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTNNI3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がシャルコー・マリー・トゥース病1A型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPMP22遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がシャルコー・マリー・トゥース病1B型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMPZ遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がQT延長症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNQ1遺伝子若しくはKCNH2遺伝子若しくはSCN5A遺伝子若しくはANK2遺伝子若しくはKCNE1遺伝子若しくはKCNE2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子若しくはCAV3遺伝子若しくはSCN48遺伝子若しくはAKAP9遺伝子若しくはANTA1遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がQT短縮症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNH2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がブルガタ症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSCN5A遺伝子若しくはGPD1L遺伝子若しくはCACNA1C遺伝子若しくはCACNB2B遺伝子若しくはSCN1B遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がカテコラミン誘発性多形性心室頻拍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がRYR2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が心伝導障害で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSCN5A遺伝子若しくはSCN1B遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が筋萎縮性側索硬化症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTDP43遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がヌーナン症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPTPN11遺伝子であるか、又はヒト常染色体優性変異疾患が低カルシウム血症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCaR遺伝子である、請求項15に記載の抑制剤。
- 疾患が筋硬直性ジストロフィーで、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がDMPK遺伝子であるか、疾患が脊髄性筋萎縮症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSMN1遺伝子であるか、疾患が先天性筋無力症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCHRNE遺伝子であるか、疾患が前頭側頭葉型痴呆症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMAPT遺伝子であるか、又は疾患が成長ホルモン単独欠損症II型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がGH1遺伝子である、請求項8に記載の抑制剤。
- 請求項1〜17のいずれか一項に記載の抑制剤を有効成分として少なくとも一つ含有する医薬組成物。
- センス鎖領域が、配列番号83又は85で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び/又はそのヌクレオチドをコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクター、並びに/あるいはセンス鎖領域が、配列番号89で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び/又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分としてさらに含有する、請求項11又は12に従属する請求項18に記載の医薬組成物。
- センス鎖領域が、配列番号89で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び/又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む、点突然変異型EGFR遺伝子発現抑制剤。
- 転写産物上に不連続接合点を有する優性変異遺伝子の発現を選択的に抑制するRNAi分子の設計方法であって、
(a)該転写産物上の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第1及び第2基準塩基として設定する工程、
(b)前記転写産物において、前記第2基準塩基に対応する塩基から下流側に向かって4〜15番目の塩基がRNAiセンス鎖の3’末端塩基に対応するように設定する工程、
(c)前記優性変異遺伝子において、その転写産物の第1及び第2基準塩基を含む連続する16〜30塩基を含む塩基配列をRNAiセンス鎖領域として設定する工程、
(d)設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域として設定する工程
を含む、前記設計方法。 - (e)ASPスコア値が0.4以上あるRNAi分子を選別する工程をさらに含む、請求項21に記載の設計方法であって、
ASPスコアは、以下の式から算出される、前記設計方法。
ASPスコア=[(対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比)−(対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比)]×(1−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比)
(式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である) - RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、請求項21又は22に記載の設計方法。
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