CN109234295A - 一种微生物体内基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法 - Google Patents

一种微生物体内基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物内基于脂肪酸代谢途径三个中间产物为前体分子合成信息素脂肪醇乙酸酯的方法，其步骤为：首先通过微生物中高表达脂酰‑ACP还原酶AAR、羧酸还原酶CAR、脂酰‑CoA还原酶FAR及醛还原酶AHR，分别得到可还原脂酰‑ACP、脂肪酸或脂酰‑CoA产脂肪醇的工程菌。最后在产脂肪醇工程菌中高表达醇乙酰基转移酶ATF1，用于催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成信息素脂肪醇乙酸酯。本发明可实现由葡萄糖到脂肪醇乙酸酯的微生物转化，为大规模的生物合成脂肪醇乙酸酯提供了一个可行道路。

Description

一种微生物体内基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及改造微生物代谢途径，从单糖直接合成信息素脂肪醇乙酸酯的方法。
背景技术
1、昆虫性信息素，又称性外激素(人工合成用于防治害虫的又称为性引诱剂)，是由同种昆虫某一性别个体的特殊器官分泌于体外，能被同种异性个体的感受器所接受，并使其产生相应行为反应或生理效应(如觅偶、定向求偶、交配等)的微量化学物质。至今，已鉴定出约2000种昆虫性信息素，大多数性信息素为各种脂肪醇乙酸酯分子。目前已有少数昆虫性信息素实现了化学全合成。由于应用昆虫性信息素进行害虫监测和防治具有高效、无毒、无污染、不伤害天敌昆虫等优点，国内外学者十分重视对昆虫性信息素的研究和应用。
2、昆虫性信息素是昆虫本身的产物，因此其最大的优点就是使用非常安全，害虫不产生抗性、灵敏度高、用量少、专属性强、不污染环境、对天敌无害甚或有利，对生态环境的干扰小、不造成破坏。目前昆虫性信息素被用于虫情检测、大量诱捕、干扰交配、配合治虫、害虫检疫、区分近缘种等方面。但由于绝大多数的种类的昆虫性信息素还未能实现商品化生产，限制了其更广泛的应用。
3、目前已商品化的性信息素均为通过化学法合成。化学法合成性信息素需涉及到多个反应步骤导致合成成本较高。通过生物技术手段，实现微生物发酵单糖合成各种性信息素，可有效的降低成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物体内基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法，在微生物内构建一条由单糖转化到脂肪醇乙酸酯的代谢途径。
为实现上述目的，本发明提供了在大肠杆菌合成脂肪醇乙酸酯的方法，合成示意图如图1所示，主要步骤为：
(1)构建基于脂肪酸为前体分子产脂肪醇乙酸酯工程菌
将来自Mycobacterium marinum菌的羧酸还原酶CAR基因和酿酒酵母醇乙酰基转移酶ATF1基因，重组到载体pET28a(+)上，得到载体pDY10。将来自大肠杆菌的醛还原酶AHR及硫酯酶‘TESA基因、枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp基因，重组到载体pBBR1MCS1上，得到载体pDY09。将上述两个载体同时转入到大肠杆菌中，实现上述五个基因在大肠杆菌中的高量表达，得到大肠杆菌工程菌株GDY4。表达‘TESA用于水解脂酰-ACP产生脂肪酸，表达CAR用于催化脂肪酸还原为脂肪醛，表达Sfp用于活化CAR酶，表达AHR用于随后催化脂肪醛还原形成脂肪醇，表达ATF1用于最终催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。脂肪酸和乙酸辅酶A均可由大肠杆菌发酵单糖合成，为此上述构建的GDY4工程菌可有效的将单糖转化为脂肪醇乙酸酯。
相应的，还可以通过(2)构建基于脂酰-ACP为前体分子产脂肪醇乙酸酯工程菌将来自Synechococcus elongates菌的脂酰-ACP还原酶AAR基因、大肠杆菌的醛还原酶AHR基因和酿酒酵母醇乙酰基转移酶ATF1基因，重组到载体pET28a(+)上，得到载体pDY05。将该载体转入到大肠杆菌中，实现上述三个基因在大肠杆菌中的高量表达，得到大肠杆菌工程菌株GDY2。表达AAR用于催化脂酰-ACP还原为脂肪醛，表达AHR用于随后催化脂肪醛还原形成脂肪醇，表达ATF1用于最终催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。脂酰-ACP和乙酸辅酶A均可由大肠杆菌发酵单糖合成，为此上述构建的GDY2工程菌可有效的将单糖转化为脂肪醇乙酸酯。
相应的，还可以通过(3)构建基于脂酰-ACP和脂酰-COA为前体分子产脂肪醇乙酸酯工程菌
将来自Marinobacter aquaeolei菌的脂酰-CoA还原酶FAR基因和酿酒酵母醇乙酰基转移酶ATF1基因，重组到载体pET28a(+)上，得到载体pDY12。将该载体转入到大肠杆菌中，实现上述两个基因在大肠杆菌中的高量表达，得到大肠杆菌工程菌株GDY6。表达FAR用于催化脂酰-ACP和脂酰-COA还原为脂肪醇，表达ATF1用于最终催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。脂酰-ACP、脂酰-COA和乙酸辅酶A均可由大肠杆菌发酵单糖合成，为此上述构建的GDY6工程菌可有效的将单糖转化为脂肪醇乙酸酯。
本发明的优点是在大肠杆菌引入外源基因构建一条合成脂肪醇乙酸酯的代谢途径，最终实现以单糖为原料合成脂肪醇乙酸酯的目的，不需要通过过多的化学合成反应，减少化学合成过程中有毒物质的释放，也减少了合成成本。同时，由于大肠杆菌生长速度快，遗传操作技术成熟，且发酵过程不会对环境造成污染破坏。
附图说明
图1.生物合成脂肪醇乙酸酯路径图。ATF1：醇乙酰基转移酶(alcoholacetyltransferase)来自S.cerevisiae菌；AAR：脂酰-ACP还原酶(fatty acyl-ACPreductase)来自S.elongates菌；CAR：羧酸还原酶(carboxylic acid reductase)来自M.marinum菌；FAR：脂酰-CoA还原酶(fatty acyl-CoAreductase)来自M.aquaeolei菌；AHR：醛还原酶(aldehyde reductase)来自E.coli菌；FadD：脂酰-CoA合酶(fatty acyl-CoAsynthetase)来自E.coli；'TesA：去除信号肽的硫酯酶(a truncated fatty acyl-ACPthioesterase)来自E.coli菌.
图2.基于脂酰-ACP为前体分子合成脂肪醇或脂肪醇乙酸酯的大肠杆菌工程菌GDY1和GDY2发酵产物GC-MS检测结果。1号峰代表内标碳十五脂肪酸甲酯(MethylPentadecanoate),2号峰代表碳十五脂肪醇内标(Pentadecanol),3号峰代表碳十六脂肪醇乙酸酯(Hexadecanolacetate ester)，4号峰代表碳十六脂肪醇(Hexadecanol)，5号峰代表Δ9-碳十八烯脂肪醇乙酸酯(9-Octadecen-1-ol acetate ester)，6号峰代表Δ9-碳十八烯脂肪醇(9-Octadecen-1-ol alcohol)。
图3.基于脂肪酸为前体分子合成脂肪醇或脂肪醇乙酸酯的大肠杆菌工程菌GDY3和GDY4发酵产物GC-MS检测结果。1号峰为碳十二脂肪醇乙酸酯(Dodecanol acetateester)，2号峰为碳十二脂肪醇(Dodecanol)，3号峰为Δ9-碳十二烯醇(9-Dodecanol-1-ol)，4号峰为碳十四脂肪醇乙酸酯(Tetradecanol acetate ester)，5号峰为碳十五脂肪酸甲酯内标(MethylPentadecanoate)，6号峰为碳十四脂肪醇(Tetradecanol)，7号峰为Δ9-碳十四烯醇(9-Tetradecen-1-ol)，8号峰为碳十五醇内标(Pentadecanol)，9号峰为Δ9-碳十六烯醇乙酸酯(9-Hexadecen-1-ol acetate ester)，10号峰为碳十六脂肪醇(Hexadecanol)，11号峰为Δ9-碳十六烯脂肪醇(9-Hexadecen-1-ol)，12号峰为Δ9-碳十八烯醇乙酸酯(9-Octadecen-1-olacetate ester)，13号峰为Δ9-碳十八烯醇(9-Octadecen-1-ol)。
图4.基于脂酰-ACP和脂酰-CoA为前体分子合成脂肪醇或脂肪醇乙酸酯的大肠杆菌工程菌GDY5和GDY6发酵产物GC-MS检测结果。1号峰为碳十四脂肪醇乙酸酯(Tetradecanol acetate ester)，2号峰为碳十五脂肪酸甲酯内标(MethylPentadecanoate)，3号峰碳十四脂肪醇(Tetradecanol)，4号峰为Δ9-碳十四烯醇(9-Tetradecen-1-ol)，5号峰为碳十五醇内标(Pentadecanol)，6号峰为碳十六脂肪醇乙酸酯(Hexadecanol acetate ester)，7号峰为Δ9-碳十六烯醇乙酸酯(9-Hexadecen-1-olacetate ester)，8号峰为碳十六脂肪醇(Hexadecanol)，9号峰为Δ9-碳十六烯脂肪醇(9-Hexadecen-1-ol)，10号峰为Δ9-碳十八烯醇乙酸酯(9-Octadecen-1-ol acetate ester)，11号峰为Δ9-碳十八烯醇(9-Octadecen-1-ol)。
具体实施方式
本发明的目的通过以下措施来达到：
1、在微生物体内表达AAR和AHR基因，用于催化脂肪酸合成途径中间体脂酰-ACP还原为脂肪醇。表达ATF1基因用于催化脂肪醇和乙酰辅酶A两个底物合成脂肪醇乙酸酯。
2、在微生物体内表达‘TESA用于水解脂酰-ACP产生脂肪酸，表达CAR用于催化脂肪酸还原为脂肪醛，表达Sfp用于活化CAR酶，表达AHR用于随后催化脂肪醛还原形成脂肪醇，表达ATF1用于最终催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。
3、在微生物体内表达FAR用于催化脂酰-ACP和脂酰-COA还原为脂肪醇，表达ATF1用于最终催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。
4、本发明的三个工程菌，其细胞生长快速，能够利用单糖为唯一碳源合成脂肪醇乙酸酯。
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1构建基于脂酰ACP为前体分子产脂肪醇乙酸酯大肠杆菌工程菌(图1所示)
构建产脂肪醇工程菌
1、利用引物AAR-XbaI(GTATCTAGAAAGAGGAGATATAATGTTCGGTCTTATCGGTCATCTC)和AAR-SpeI-BamHI(TGTGGATCCACTAGTTCAAATTGCCAATGCCAAGG)PCR扩增来自Synechococcuselongates菌的AAR基因，随后将扩增的片段以XbaI和BamHI插入到pET28a(+)中得到载体pDY01。利用引物AHR-XbaI(ATATCTAGAAAGAGGAGATATAATGTCGATGATAAAAAGCTATGCCG)和AHR-SpeI-BamHI(GTAGGATCCACTAGTTCAAAAATCGGCTTTCAACACCAC)PCR扩增来自大肠杆菌的AHR基因，利用XbaI和BamHI插入到pET28a(+)中得到载体pDY02。利用XbaI和XhoI双酶切pDY01得到AAR表达框，将其插入以SpeI和XhoI双酶切的载体pDY02上，得到重组载体pDY03。
A)、将重组载体pDY03导入大肠杆菌GM1655中，得到GDY1工程菌。该工程菌实现了AAR和AHR基因的高表达。表达AAR酶用于催化脂肪酸合成中间体脂酰-ACP还原为脂肪醛醛，表达AHR酶用于催化脂肪醛还原为脂肪醇。
构建产脂肪醇乙酸酯工程菌
1、利用引物ATF1-XbaI(GGATCTAGAAACTTTAAGAAGGAGATATAATGAATGAAATCGATGAGAAAAATCAGG)and ATF1-SpeI-SacI(GATGAGCTCACTAGTCTAAGGGCC TAAAAGGAGAGCTTTGTAA)PCR扩增来自酿酒酵母菌的ATF1基因，随后将扩增的片段以XbaI和SacI双酶切插入到pET28a(+)载体中，得到载体pDY04。以XbaI和XhoI双酶切载体pDY03，得到AAR和AHR表达框，将其插入以SpeI和XhoI双酶切的载体pDY04上，得到重组载体pDY05。
2、将重组载体pDY05导入大肠杆菌GM1655中，得到GDY2工程菌。该工程菌实现了AAR、AHR和ATF1基因的高表达。表达AAR酶用于催化脂肪酸合成中间体脂酰-ACP还原为脂肪醛醛，表达AHR酶用于催化脂肪醛还原为脂肪醇醇，表达ATF1用于催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。
实施例2构建基于脂肪酸为前体分子产脂肪醇乙酸酯大肠杆菌工程菌(图1所示)
构建产脂肪醇工程菌
1、利用引物CAR-XbaI(ATATCTAGAAAGAGGAGATATAATGTCGCCAATCACGCGTGA)和CAR-SpeI-BamHI(AGAGGATCCACTAGTTCAGAGCAGGCCGAGTAGGC)PCR扩增来自Mycobacteriummarinum菌的CAR基因，随后将扩增的片段以XbaI和BamHI插入到pET28a(+)中得到载体pDY06。利用引物'TesA-SacI(AGATGAGCTCATGGCGGACACGTTATTGATTCTGG)和'TesA-SpeI(TGTACTAGTTTATGAGTCATGATTTACTAAAGGCTGC)PCR扩增来自大肠杆菌的'TesA基因，随后将扩增的片段以SacI和SpeI双酶切插入到pBBR1MCS1中得到载体pDY07。利用引物AHR-BamHI(ACTGGATCCAAGAAGGAGATATAATGTCGATGATAAAAAGCTATGCCG)和AHR-XhoI(TGTCTCGAGTCAAAAATCGGCTTTCAACACCAC)PCR扩增来自大肠杆菌的AHR基因,随后将扩增的片段以BamHI和XhoI双酶切插入到载体pDY07，得到载体pDY08。利用引物Sfp-XhoI(TTCCTCGAGAAGAAGGAGATATAATGAAGATTTACGGAATTTATATGGACCG)和Sfp-ApaI(ACAGGGCCCTTATAAAAGCTCTTCGTACGAGACCATTG)PCR扩增来自Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168菌的Sfp基因，随后将扩增的片段以XhoI和ApaI双酶切插入到载体pDY08，得到载体pDY09。
2、将重组载体pDY06和pDY09导入大肠杆菌GM1655中，得到GDY3工程菌。该工程菌实现了CAR、AHR、Sfp和'TesA基因的高表达。表达‘TesA用于水解脂酰-ACP产生脂肪酸，表达CAR用于催化脂肪酸还原为脂肪醛，表达Sfp用于活化CAR酶，表达AHR用于随后催化脂肪醛还原形成脂肪醇。
构建产脂肪醇乙酸酯工程菌
1、以XbaI和XhoI双酶切载体pDY06，得到CAR表达框，将其插入以SpeI和XhoI双酶切的载体pDY04上，得到重组载体pDY10。
2、将重组载体pDY10和pDY09导入大肠杆菌GM1655中，得到GDY4工程菌。该工程菌实现了CAR、AHR、Sfp、'TesA和ATF1基因的高表达。表达‘TesA用于水解脂酰-ACP产生脂肪酸，表达CAR用于催化脂肪酸还原为脂肪醛，表达Sfp用于活化CAR酶，表达AHR用于随后催化脂肪醛还原形成脂肪醇，表达ATF1用于催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。
实施例3构建基于脂酰ACP和脂酰-CoA为前体分子产脂肪醇乙酸酯大肠杆菌工程菌(图1所示)
构建产脂肪醇工程菌
1、利用引物FAR-XbaI(CAATCTAGAAAGAGGAGATATAATGGCAATACAGCAGGTACATCAC)和FAR-SpeI-BamHI(CGAGGATCCACTAGTTCAGGCAGCTTTTTTGCGCT)PCR扩增来自M.aquaeolei菌的FAR基因，随后将扩增的片段以XbaI和BamHI插入到pET28a(+)中得到载体pDY11。
2、将重组载体pDY11导入大肠杆菌GM1655中，得到GDY5工程菌。该工程菌实现了FAR基因的高表达。表达FAR酶用于催化脂肪酸合成中间体脂酰-ACP和脂酰-CoA直接还原为脂肪醇醇。
构建产脂肪醇乙酸酯工程菌
1、以XbaI和XhoI双酶切载体pDY11，得到FAR表达框，将其插入以SpeI和XhoI双酶切的载体pDY04上，得到重组载体pDY12。
2、将重组载体pDY12导入大肠杆菌GM1655中，得到GDY6工程菌。该工程菌实现了FAR、和ATF1基因的高表达。表达FAR酶用于催化脂肪酸合成中间体脂酰-ACP和脂酰-CoA直接还原为脂肪醇醇，表达ATF1用于催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。
实施例4大肠杆菌工程菌生产脂肪醇或脂肪醇乙酸酯的发酵实验
1、将30度过夜培养的大肠杆菌工程菌，接种到50ml M9发酵培养基中(包含2％葡萄糖)。
2、培养24小时后收集菌体，超声波破细胞，利用乙酸乙酯萃取产物。
3、利用旋转蒸发仪将溶剂乙酸乙酯旋干，再用正己烷溶解产物。
4、GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)检测经正己烷溶解的样品.
实验结果：如图2所示大肠杆菌工程菌GDY1和GDY2可分别直接利用葡萄糖基于脂酰-ACP为前体分子合成各种脂肪醇或脂肪醇乙酸酯；如图3所示大肠杆菌工程菌GDY3和GDY4可分别直接利用葡萄糖基于脂肪酸为前体分子合成各种脂肪醇或脂肪醇乙酸酯；如图4所示大肠杆菌工程菌GDY5和GDY6可分别直接利用葡萄糖基于脂酰-ACP和脂酰-CoA为前体分子合成各种脂肪醇或脂肪醇乙酸酯。

Claims (5)

1.一种微生物体内基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法，其特征在于基于脂肪酸为前体分子产脂肪醇乙酸酯：
将羧酸还原酶CAR基因和醇乙酰基转移酶ATF1基因、醛还原酶AHR及硫酯酶‘TESA基因、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp基因，重组到载体上；将上述载体转入到微生物中，实现上述五个基因在微生物中的高量表达，得到工程菌株；表达‘TESA用于水解脂酰-ACP产生脂肪酸，表达CAR用于催化脂肪酸还原为脂肪醛，表达Sfp用于活化CAR酶，表达AHR用于随后催化脂肪醛还原形成脂肪醇，表达ATF1用于最终催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯，脂肪酸和乙酸辅酶A均可由微生物发酵单糖合成，为此上述构建的工程菌可有效的将单糖转化为脂肪醇乙酸酯。
2.根据权利要求1所述的一种微生物体内基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法，其特征在于，所述醛还原酶AHR基因具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码；所述醛还原酶AHR基因具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
所述醇乙酰基转移酶ATF1基因具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列编码；所述醇乙酰基转移酶ATF1基因具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；
任选地，所述羧酸还原酶CAR基因具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列编码；所述羧酸还原酶CAR基因具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；
所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp基因具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列编码；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp基因具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；
所述硫酯酶‘TESA基因具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列编码；所述硫酯酶TE基因具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种微生物体内基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法，其特征在于，所述微生物为细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒或酵母中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种微生物体内基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法，其特征在于：所述微生物包含编码醇乙酰基转移酶ATF1基因的核酸序列；所述编码醇乙酰基转移酶ATF1基因的核酸序列利用乙酰辅酶A和醇类化合物生成脂肪醇乙酸酯；所述醇类化合物为碳源子数大于5但小于30的饱和一元醇和不饱和一元醇。
5.根据权利要求1所述的一种微生物体内基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法，其特征在于：所述单糖为葡萄糖、半乳糖、果糖或甘油中的任意一种。
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