JP2023515537A - 単一分子生成物を単離する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、単一分子生成物を生成、単離、抽出、及び精製する材料及び方法を提供する。本発明は、高純度で、例えば、少なくとも８０重量％、好ましくは、少なくとも９５重量％以上の純度に微生物代謝産物を抽出する材料及び方法を提供する。具体的には、本発明は、高純度で、バイオサーファクタント及びポリケチドを単離又は抽出する材料及び方法を提供する。好ましくは、バイオサーファクタントは、ソホロ脂質（ＳＬＰ）である。

Description

関連出願を相互参照
本出願は、２０２０年２月２９日出願の米国仮出願第６２／９８３，６２１号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
微生物代謝産物は、一般に、微生物によって生成される小分子化合物であり、糖類、アミノ酸、及び脂質等の一次代謝産物と、バイオサーファクタント、ポリケチド、アルカロイド、フラボノイド、グリコシド、キノロン、テルペノイド、ペプチド、及び増殖因子等の二次代謝産物とを含む。一次微生物代謝産物は、微生物の生存に必須の化合物であり、一方、二次微生物代謝産物は、通常、医学及び農業における幅広い用途に使用することができる重要な生物活性機能を有する化合物である。例えば、多くの二次微生物代謝産物が、抗腫瘍薬、抗ウイルス薬及び抗菌薬として使用されている。
ポリケチドは、カルボニル基及びメチレン基を含有する化合物の大きな群である。ポリケチドは、抗生物質（例えば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ナイスタチン、アベルメクチン、スピラマイシン、及びテトラサイクリン）として、免疫抑制剤（例えば、タクロリムス、ラパマイシン、ラディシコール、及びポコニン）として、コレステロール低下剤（例えば、ロバスタチン）として、抗癌剤（例えば、ドキソルビシン）として、及び駆虫剤（例えば、アルベンダゾール、メベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、及びプラジカンテル）として、殺虫剤（例えば、スピノシンＡ）として、製薬業界において、一般的に使用されている。
エリスロマイシンは、多くの細菌感染症の治療に使用されてきた。エリスロマイシンにはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４種類があり、これらの４種類のエリスロマイシンは、異なる抗菌活性及び異なる活性濃度を有する。エリスロマイシンの主要で最も活性な型であるエリスロマイシンＡは、抗生物質及びアジトロマイシン、クラリスロマイシン、及びロキシスロマイシン等の他の抗生物質のための前駆体として製薬業界で使用されている。しかしながら、細菌Saccharopolyspora erythraeaを用いる標準的な方法によってエリスロマイシンＡを製造する場合、エリスロマイシンＢ、Ｃ及びＤは、得られた収率の最大３０％を構成する。従って、市販可能なポリケチド生成物、例えば、エリスロマイシンＡを得るために、微生物からそのような化合物を抽出及び精製する方法が求められている。
バイオサーファクタントは、微生物によって生成される表面活性物質の構造的に多様な群である。バイオサーファクタントは全て両親媒性物質である。それらは、極性（親水性）部分と非極性（疎水性）基の２つの部分を有する。両親媒性構造により、バイオサーファクタントは、例えば、疎水性の水不溶性物質の表面積を増加させ、そのような物質の水バイオアベイラビリティを増加させ、細菌細胞表面の特性を変化させることができる。
バイオサーファクタントはまた、水と油の間の界面張力を低減することもでき、従って、毛細管効果を超えて、閉じ込められた液体を移動させるのに必要な静水圧を低下させることができる。バイオサーファクタントは、界面に蓄積し、それによって、界面張力を低下させ、溶液中で凝集したミセル構造の形成をもたらす。ミセルの形成は、例えば、移動する水相中の油を集める物理的機構を提供する。バイオサーファクタントが、孔を形成し、生体膜を不安定化する能力はまた、例えば、有害物及び／又は微生物増殖を制御するための、抗菌剤、抗真菌剤、及び溶血剤としての使用を可能にする。
化学界面活性剤と同様に、バイオサーファクタントの特性は、親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）によって測定することができる。ＨＬＢは、界面活性分子の親水性部分及び親油性部分のサイズと強度のバランスである。安定なエマルジョンが形成されるためには、特定のＨＬＢ値が必要である。水／油及び油／水エマルジョンにおいて、表面活性分子の極性部分は水に配向し、非極性基は油に配向してするため、油相と水相の間の界面張力を低下させる。
糖脂質、リポペプチド、フラボ脂質リン脂質、脂肪酸エステル、リポタンパク質、リポ多糖－タンパク質複合体、及び多糖－タンパク質－脂肪酸複合体等の高分子量ポリマーをはじめとする、様々な種類のバイオサーファクタントが存在する。これらのバイオサーファクタントは、石油産業、農業、化粧品及び医薬品等の様々な産業で使用することができる。
特に、糖脂質は、炭水化物及び少なくとも１つの脂肪酸を含むバイオサーファクタントである。糖脂質には、例えば、ラムノ脂質（ＲＬＰ）、ラムノース－ｄ－リン脂質、トレハロース脂質、トレハロースジミコール酸塩、トレハロースモノミコール酸塩、マンノシルエリスリトール脂質（ＭＥＬ）、セロビオース脂質、ウスツラギン酸及び／又はソホロ脂質（ＳＬＰ）が含まれる。
ソホロ脂質は、グリコシドエーテル結合によって脂肪酸に連結された２つのグルコース分子からなるソホロースを含む糖脂質である。それらは、２つの一般的形態、すなわち、脂肪酸側鎖中のカルボキシル基及びソホロース部分が環状エステル結合を形成するラクトン形態と、エステル結合が加水分解される酸性形態又は直鎖状形態に分類される。これらの形態に加えて、脂肪酸側鎖中の二重結合の有無、炭素鎖の長さ、グリコシドエーテル結合の位置、糖部分のヒドロキシル基に導入されたアセチル基の有無、及び他の構造パラメータによって特徴付けられる多くの誘導体が存在する。
ラクトン型及び酸性ソホロ脂質は、異なる機能特性を有する。例えば、酸性ＳＬＰは、ラクトン型ＳＬＰよりも高いＨＬＢを有し、ラクトン型ＳＬＰは、酸性ＳＬＰよりも低いＨＬＢ及び高い表面張力低減特性を有する。さらに、酸性ＳＬＰは、遊離カルボン酸基のために、極めて水溶性である。ラクトン型ＳＬＰと酸性ＳＬＰとを異なる比率で組み合わせることは、例えば、エマルジョン液滴サイズ、粘度低減特性、及び表面／界面張力低減特性に影響を及ぼす。
ＳＬＰは、例えば、食品保存、生物医学、化粧品、バイオレメディエーション、重金属の修復、及び様々な家庭用洗浄製品の製造に使用することができる。ＳＬＰはまた、例えば、掘削、セメントスラリー、破砕、強化油回収、スケール形成防止、酸性化、原油の解乳化、腐食防止、油粘度減少、装置の洗浄、水攻法、及び／又は泡及び蒸気注入における石油産業に適用可能である。さらに、農業及び家畜生産において、ＳＬＰは、例えば、土壌改良剤、広域スペクトル生物農薬、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び抗菌剤、及び／又は栄養吸収を増強するための動物飼料への添加剤として使用することができる。
異なる長さの炭素鎖を有する糖及び／又は脂質及び脂肪酸を含む培養基質中での酵母細胞の発酵を使用して、様々なソホロ脂質を生成することができる。ＳＬＰを生成するのに広く認識されている１つに、酵母Starmerella bombicolaがある。典型的には、酵母が発酵中にラクトン型及び酸性ＳＬＰの両方を生成し、ＳＬＰの約６０～７０％はラクトン型を含み、残りは酸性型を含む。従って、現在の生成方法を用いて生成された標準ＳＬＰ生成物は、例えば、４～９とＨＬＢ値の範囲も狭いため、狭い用途でのみしか使用できない。
さらに、生物学的プロセスの性質のために、酵母培養培地から抽出できる純粋なＳＬＰの正確な濃度を標準化することは難しい。さらに、粗製形態ＳＬＰは、濁った外観及び望ましくない匂いを有している。従って、所望の濃度、外観及び／又は匂いの市販のＳＬＰ生成物を得るために、ＳＬＰを精製する必要があることが多い。しかしながら、培養バッチから高度に精製された形態のＳＬＰ（例えば、９５％超）、特に、酸性形態を得ることは、困難であり、費用がかかる。
エリスロマイシンＡの抽出及び精製のための従来の方法には、エリスロマイシン－イソチオシアネートの単離、エリスロマイシン塩基の調製及びエリスロマイシンＡの分離及び精製が含まれる。例えば、全ブロスは、アルカリ性ｐＨ、例えば、８．５～９．５に調整される必要がある。遠心分離によってバイオマスを除去した後、上清を濾過し、遠心分離による相分離のためにメチルイソブチルケトンと混合する。有機相を収集し、３０℃に加熱した後、イソチオシアン酸Ｎａ溶液を加え、混合物をｐＨ５．８に調整する。エリスロマイシン－イソチオシアネートは、穏やかに撹拌しながら１０℃に冷却することにより結晶化する。次いで、エリスロマイシン－イソチオシアネートを、濾過、洗浄及び乾燥プロセスの後に単離する。
エリスロマイシン塩基を調製するために、エリスロマイシン－イソチオシアネートを、ＮａＯＨ溶液を添加しながら３３℃で穏やかに撹拌しながらジクロロメタンに再懸濁し、ｐＨを９．５～１０．０に調整する。このような混合物に、濾過助剤（パーライト）及び活性炭を添加してから、濾過する。少量のジクロロメタンで洗浄した後、有機相を脱イオン水により、３３℃で緩慢に撹拌しながら抽出する。相分離後、水相は廃棄し、エリスロマイシンの濃度の増加した有機相により、マクロライドの析出を誘導する。析出したエリスロマイシンは、遠心分離又は濾過により回収し、ジクロロメタンで洗浄し、５０℃で乾燥するステップを続ける。得られた粗エリスロマイシン塩基を、脱イオン水に再懸濁し、５０～６０℃に加熱し、硫酸ラウリルと混合する。精製されたエリスロマイシン塩基は、遠心分離又は濾過の後、６０℃の脱イオン水で洗浄することによって得ることができる。次いで、エリスロマイシンＡを、２段階溶出クロマトグラフィーによって、マクロ多孔性樹脂ＳＰ８２５を用いて不純ＥＭから分離し、精製する。
ポリケチド及びバイオサーファクタントを含む高度に精製された化学物質を得るためには、初期回収、高度な装置及び方法の使用による精製を含むいくつかの方法を使用する必要があり、これはプロセスを、大規模で、高価で、高度に純粋な単一分子生成物を得る能力が限られたものにする。
従って、高純度を有し、かつ、任意で、工業規模の用途に適した、ポリケチド及びバイオサーファクタント等の小分子化合物を抽出するのに、安全で、費用効率が高く、環境に優しい方法が必要とされている。
本発明は、高純度で、微生物代謝産物を生成、単離、抽出及び精製する材料及び方法を提供する。具体的には、本発明は、微生物代謝産物を、例えば、少なくとも８０重量％、好ましくは、少なくとも９５重量％以上の純度に精製する材料及び方法を提供する。
本発明はまた、他の化合物又は細胞物質を実質的に含まない単一分子生成物を生成、抽出、及び精製する材料及び方法を提供する。精製又は単離された単一分子生成物は、例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９８重量％、又は少なくとも９９重量％、少なくとも９９．９重量％、又は少なくとも１００重量％の純度を有する。
一実施形態において、単一分子生成物は、微生物によって生成される単一の微生物代謝産物を含む。一実施形態において、微生物代謝産物は、糖類、アミノ酸、及び脂質等の一次代謝産物と、バイオサーファクタント、ポリケチド、脂肪酸エステル、アルカロイド、フラボノイド、グリコシド、キノロン、テルペノイド、ペプチド、及び増殖因子等の二次代謝産物とから選択される。さらなる実施形態において、微生物代謝産物は、バイオサーファクタント及びポリケチドから選択される。
一実施形態において、バイオサーファクタントは、糖脂質、リポペプチド、フラボ脂質、リン脂質、脂肪酸エステル、及びリポタンパク質、リポ多糖－タンパク質複合体、及び多糖－タンパク質－脂肪酸複合体等の高分子量ポリマーを含む。好ましくは、バイオサーファクタントは、炭水化物及び少なくとも１つの脂肪酸を含む糖脂質である。糖脂質としては、例えば、ラムノ脂質（ＲＬＰ）、ラムノース－ｄ－リン脂質、トレハロース脂質、トレハロースジミコール酸塩、トレハロースモノミコール酸塩、マンノシルエリスリトール脂質（ＭＥＬ）、セロビオース脂質、ウシラギ酸及び／又はソホロ脂質（ＳＬＰ）が挙げられる。
一実施形態において、ポリケチドは、カルボニル基及びメチレン基を含む化合物（β－ポリケトン）、好ましくは、カルボニル基及びメチレン基を交互に含む化合物を含む。ポリケチドとしては、これらに限られるものではないが、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ナイスタチン、アベルメクチン、スピラマイシン、テトラサイクリン、タクロリムス、ラパマイシン、ラディシコール、ポチコニン、ロバスタチン、ドキソルビシン、エモジン、アルベンダゾール、メベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、プラジカンテル及びスピノシンＡが挙げられる。
一実施形態において、本発明は、１つ以上の微生物代謝産物を高純度で単離／抽出する方法であって、
１）代謝産物生成微生物を培養して、液体発酵培地、微生物細胞及び１つ以上の微生物代謝産物を含む微生物培養ブロスを生成するステップと、
２）培養ブロスを、１つ以上の溶媒、好ましくは、例えば、酢酸エチル等の非極性溶媒と混合するステップと、
３）ステップ２）の混合物を遠心分離して、混合物中で相分離を引き起こし、非極性層、相間層、水層及び細胞層を分離するステップと、
４）非極性層、相間層、水層及び細胞層から選択される１つ以上の層を別々に収集するステップと、
５）ステップ４）の収集された１つ以上の層を独立して遠心分離し、１つ以上の収集された層から上清又は溶媒層のそれぞれを独立して収集するステップと、
６）例えば、蒸発によって、非極性層、相間層、水層、及び細胞層のそれぞれから１つ以上の微生物代謝産物を得るステップと
を含む、方法を提供する。
一実施形態において、水層を、ステップ４）で収集する。一実施形態において、本発明による方法は、ステップ４）で得られた水層から微生物代謝産物の単一分子生成物を精製、単離又は抽出するステップを提供する。好ましくは、水層から得られる微生物代謝産物は、親水性分子又は水溶性分子である。微生物代謝産物を得る方法は、上述のステップ５）から、例えば、ロータリーエバポレータを介して、収集した上清中の水分を蒸発させ、高純度で微生物代謝産物の単一分子生成物を得ることを含む。
一実施形態において、本発明による方法は、水層から微生物代謝産物の１つ以上の単一分子生成物を単離、抽出、取得及び／又は精製するステップも提供する。この方法は、上記のステップ４）及び／又は５）で収集した水層中の１つ以上の微生物代謝産物のそれぞれを得るために、非極性の増加した溶媒を用いる、複数の単離／抽出／精製サイクルを含む。一実施形態において、各単離／抽出／精製サイクルは、
ｉ）水層の蒸発生成物を得るステップと、
ｉｉ）水層の蒸発生成物を、溶媒、例えば、メタノール等のアルコールと混合するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの混合物を遠心分離し、上清又は溶媒層を収集するステップと、
ｉｖ）例えば、ロータリーエバポレータを用いて、溶媒を蒸発させることによって微生物代謝産物の単一分子生成物を得るステップと
を含み、
各サイクルは、前のサイクルで使用された溶媒よりも非極性である異なる溶媒を使用する。好ましくは、溶媒は、メタノール、エタノール、１－プロパノール、１－ブタノール、１－ヘキサノール、１－ヘプタノール、２－プロパノール、２－ブタノール、アセトン、及びクロロホルムの順で使用される。
一実施形態において、非極性層を、上述のステップ４）で収集する。一実施形態において、本発明による方法は、上述のステップ４）で得られた非極性層から微生物代謝産物の単一分子生成物を単離又は抽出するステップを提供する。微生物代謝産物を得る方法は、収集した上清又は溶媒層中の非極性溶媒を、上記のステップ５）から、例えば、ロータリーエバポレータを通して蒸発させ、微生物代謝産物の単一分子生成物を高純度で得ることを含む。
一実施形態において、本発明による方法はまた、上述のステップ５）で得られた非極性層から微生物代謝産物の１つ以上の単一分子産物を単離、抽出、取得、及び／又は精製するステップを提供する。本方法は、上述のステップ４）及び／又は５）で収集された非極性層中の１つ以上の微生物代謝産物のそれぞれを得るために、極性の増加した溶媒を使用する複数の単離／抽出／精製サイクルを含む。一実施形態において、各単離／抽出／精製サイクルは、
ｉ）非極性層の蒸発生成物を得るステップと、
ｉｉ）非極性層の蒸発生成物を、溶媒、例えば、クロロホルム等の非極性溶媒と混合するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの混合物を遠心分離し、上清又は溶媒層を収集するステップと、
ｉｖ）例えば、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を蒸発させることによって微生物代謝産物の単一分子生成物を得るステップとを含み、
各サイクルは、前のサイクルで使用された溶媒よりも極性が高い異なる溶媒を使用する。好ましくは、溶媒は、クロロホルム、アセトン、２－ブタノール、２－プロパノール、１－ヘプタノール、１－ヘキサノール、１－ブタノール、１－プロパノール、エタノール、及びメタノールの順で使用される。
一実施形態において、相間層を、上述のステップ４）で収集する。一実施形態において、本発明による方法は、上述のステップ４）で得られた相間層から微生物代謝産物の１つ以上の単一分子産物を抽出するステップをさらに提供する。本方法は、相間層の１つ以上の微生物代謝産物のそれぞれを得るために、極性の増加した溶媒を使用する、複数の抽出／精製サイクルを含む。一実施形態において、各抽出／精製サイクルは、
ｉ）相間層の蒸発生成物を得るステップと、
ｉｉ）相間層の蒸発生成物を、溶媒、例えば、クロロホルム等の非極性溶媒と混合するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの混合物を遠心分離し、上清又は溶媒層を収集するステップと、
ｉｉｉ）例えば、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を蒸発させることによって微生物代謝産物の単一分子生成物を得るステップとを含み、
各サイクルは、前のサイクルで使用された溶媒よりも極性が高い異なる溶媒を使用する。好ましくは、溶媒は、クロロホルム、アセトン、２－ブタノール、２－プロパノール、１－ヘプタノール、１－ヘキサノール、１－ブタノール、１－プロパノール、エタノール、及びメタノールの順で使用される。
一実施形態において、細胞層を、上述のステップ４）で収集する。一実施形態において、本発明による方法は、上述のステップ４）で得られた細胞層から微生物代謝産物の１つ以上の単一分子産物を単離／抽出するステップをさらに提供する。本方法は、細胞層の１つ以上の微生物代謝産物のそれぞれを得るために、非極性の増加した溶媒を使用する複数の単離／抽出／精製サイクルを含む。一実施形態において、各単離／抽出／精製サイクルは、
ｉ）細胞層の蒸発生成物を得るステップと、
ｉｉ）細胞層の蒸発生成物を、溶媒、例えば、メタノール等のアルコールと混合するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの混合物を遠心分離し、上清又は溶媒層を収集するステップと、
ｉｉｉ）例えば、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を蒸発させることによって微生物代謝産物の単一分子生成物を得るステップとを含み、
各サイクルは、前のサイクルで使用された溶媒よりも非極性である異なる溶媒を使用する。好ましくは、溶媒は、メタノール、エタノール、１－プロパノール、１－ブタノール、１－ヘキサノール、１－ヘプタノール、２－プロパノール、２－ブタノール、アセトン、及びクロロホルムの順で使用される。
利点を挙げると、本発明による方法によれば、微生物代謝産物、例えば、ＳＬＰ誘導体の、非常に高い純度、例えば、９５％、９８％又はそれ以上への精製を容易にする。さらに、本発明の方法及び装置は、微生物を生成し、それらの代謝産物を大規模に精製することによって、資本と労働コスト、同様に、環境影響及び健康被害を低減する。
本発明は、単一分子生成物を生成、抽出及び精製する材料及び方法を提供する。具体的には、本発明は、高純度、例えば、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９８重量％、少なくとも９９重量％、少なくとも９９．９重量％、又は少なくとも９９．９９重量％の純度で、微生物代謝産物を抽出する材料及び方法を提供する。利点を挙げると、本発明は、精製された微生物代謝産物の工業規模での生成に適しており、安全で環境に優しい材料及びプロセスを使用する。
本発明はまた、他の化合物又は細胞物質を実質的に含まない単一分子生成物を生成、抽出、及び精製する材料及び方法を提供する。精製又は単離された単一分子生成物は、例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９８重量％、又は少なくとも９９重量％、少なくとも９９．９重量％、又は少なくとも１００重量％の純度を有する。
一実施形態において、単一分子生成物は、微生物によって生成される単一の微生物代謝産物を含有する。一実施形態において、微生物代謝産物は、糖類、アミノ酸、及び脂質等の一次代謝産物と、バイオサーファクタント、ポリケチド、アルカロイド、フラボノイド、グリコシド、キノロン、テルペノイド、ペプチド、及び増殖因子等の二次代謝産物とから選択される。さらなる実施形態において、微生物代謝産物は、バイオサーファクタント及びポリケチドから選択される。
一実施形態において、バイオサーファクタントは、糖脂質、リポペプチド、フラボ脂質、リン脂質、及び脂肪酸エステル、ならびにリポタンパク質、リポ多糖－タンパク質複合体、及び多糖－タンパク質－脂肪酸複合体等の高分子量ポリマーを含む。好ましくは、バイオサーファクタントは、炭水化物及び少なくとも１つの脂肪酸を含む糖脂質である。糖脂質には、例えば、ラムノ脂質（ＲＬＰ）、ラムノース－ｄ－リン脂質、トレハロース脂質、トレハロースジミコール酸塩、トレハロースモノミコール酸塩、マンノシルエリスリトール脂質（ＭＥＬ）、セロビオース脂質、ウシラギ酸及び／又はソホロ脂質（ＳＬＰ）が含まれる。より好ましくは、バイオサーファクタントはＳＬＰである。
ソホロ脂質は、例えば、Starmerellaクレードの様々な酵母によって生成される糖脂質バイオサーファクタントである。ＳＬＰは、長鎖ヒドロキシ脂肪酸に結合した二糖類ソホロースからなる。それらは、１７－Ｌ－ヒドロキシオクタデカン水酸基又は１７－Ｌ－ヒドロキシ－Δ９－オクタデセン水酸基にβ－グリコシド結合した部分的にアセチル化された２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－Ｄ－グルコピラノース単位を含むことができる。ヒドロキシ脂肪酸は、一般に、１６又は１８個の炭素原子であり、１つ以上の不飽和結合を含有する。さらに、ソホロース残基は、６位及び／又は６'位でアセチル化される。脂肪酸カルボキシル基は、４"位で遊離（酸性又は直鎖状形態）又は内部エステル化（ラクトン形態）される。S. bombicolaは、S. bombicolaラクトンエステラーゼと呼ばれる特異的酵素を生成し、これが直鎖状ＳＬＰのエステル化を触媒してラクトン型ＳＬＰを生成する。
ＳＬＰの構造及び組成に起因して、これらのバイオサーファクタントは、優れた表面及び界面張力低減特性、同様に、他の有益な生化学的特性を有し、これは、大規模工業及び農業用途、化粧品、家庭用製品、健康、医療及び薬学分野、ならびに油及びガス回収等の用途における化学界面活性剤の代替物として有用である。
いくつかの実施形態において、本発明は、高純度脂肪酸エステル、例えば、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、脂肪酸イソプロピルエステル、脂肪酸ブチルエステル、及び／又は脂肪酸ヘキシルエステルの生成に有用である。
一実施形態において、ポリケチドは、カルボニル基及びメチレン基を含有する化合物（β－ポリケトン）、好ましくは、カルボニル基及びメチレン基を交互に含む化合物である。ポリケチドとしては、これらに限られるものではないが、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ナイスタチン、アベルメクチン、スピラマイシン、テトラサイクリン、タクロリムス、ラパマイシン、ラディシコール、ポチコニン、ロバスタチン、ドキソルビシン、エモジン、アジトロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、アルベンダゾール、メベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、プラジカンテル及びスピノシンＡが挙げられる。
好ましい実施形態において、ポリケチドは、以下の構造を有するエリスロマイシンである。
Figure 2023515537000001
 式中、Ｒａは、ＯＨ又はＨであり、Ｒｂは、ＣＨ３又はＨである。具体的には、ポリケチドは、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ又はＤから選択される。
選択された定義
本明細書で使用される場合、「ソホロ脂質」、「ソホロ脂質分子」、「ＳＬＰ」又は「ＳＬＰ分子」という用語は、例えば、酸性（直鎖状）ＳＬＰ（ＡＳＬ）及びラクトン型ＳＬＰ（ＬＳＬ）を含む、ＳＬＰ分子の全ての形態及びその異性体を含む。さらに、モノアセチル化ＳＬＰ、ジアセチル化ＳＬＰ、エステル化ＳＬＰ、様々な疎水性鎖長を有するＳＬＰ、脂肪酸－アミノ酸複合体が結合したＳＬＰ、及び本開示に記載される他のものが含まれる。
本明細書で使用される場合、「微生物ベースの組成物」への言及は、微生物又は他の細胞培養物の増殖の結果として生成された成分を含む組成物を意味する。従って、微生物ベースの組成物は、微生物自体及び／又は微生物増殖の副産物を含む。微生物は、栄養状態、胞子形成、菌糸形成、任意の他の形成の繁殖体、又はこれらの混合物であってもよい。微生物は、プランクトンであっても、バイオフィルム形態であっても、又は両方の混合物であってもよい。増殖副産物は、例えば、代謝産物、細胞膜成分、発現タンパク質、及び／又は他の細胞成分である。微生物は、無傷であっても溶解されていてもよい。微生物は、組成物中に存在してもよく、又は組成物から除去されてもよい。微生物は、微生物ベースの組成物中に、それらが増殖したブロスと共に存在することができる。細胞は、例えば、組成物１ミリリットル当たり、少なくとも１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、又はそれ以上のＣＦＵの濃度で存在する。
本発明はさらに、所望の結果を達成するために実際に適用される生成物である「微生物ベースの生成物」を提供する。微生物ベースの生成物は、単に、微生物培養プロセスから採取された微生物ベースの組成物である。あるいは、微生物ベースの生成物は、添加されたさらなる成分を含んでいてもよい。これらの追加の成分は、例えば、安定剤、緩衝剤、適切な担体、例えば、水、塩溶液、又は任意の他の適切な担体、さらなる微生物増殖を支援するための添加栄養素、非栄養素増殖促進剤、例えば、植物ホルモン、及び／又は微生物及び／又はそれが適用される環境中の組成物の追跡を容易にする薬剤を含むことができる。また、微生物ベースの生成物は、微生物ベースの組成物の混合物を含む。また、微生物ベースの生成物は、濾過、遠心分離、溶解、乾燥、精製等のような、しかしこれらに限定されない、何らかの方法で処理された微生物ベースの組成物の１つ以上の成分を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「採取された」は、増殖容器から微生物ベースの組成物の一部又は全部を取り出すことを指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」又は「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質又は有機化合物、例えば、小分子（例えば、以下に記載されるもの）は、それが天然に関連する細胞物質等の他の化合物を実質的に含まない。精製された又は単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、天然に存在する状態において、それに隣接する遺伝子又は配列を含まない。精製された又は単離されたポリペプチドは、天然に存在する状態において、それに隣接するアミノ酸又は配列を含まない。単離された微生物株は、天然に存在する環境から株が除去されることを意味する。従って、単離された株は、例えば、生物学的に純粋な培養物として、又は担体と会合した胞子（又は株の他の形態）として存在する。
特定の実施形態において、精製された化合物は、目的の化合物の少なくとも６０重量％である。好ましくは、調製物は、目的の化合物の少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも９０重量％、最も好ましくは、少なくとも９８重量％である。例えば、精製された化合物は、所望の化合物の少なくとも８０重量％、８５重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％、９９．９重量％、９９．９９重量％又は１００重量％（ｗ／ｗ）である。純度は、任意の適切な標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ）分析によって測定される。
「代謝産物」は、代謝によって生成される任意の物質、又は特定の代謝プロセスに関与するのに必要な物質を指す。代謝産物は、代謝の出発物質、中間体、又は最終生成物である有機化合物である。代謝産物の例としては、これらに限られるものではないが、酵素、酸、溶媒、アルコール、タンパク質、ビタミン、ミネラル、微量元素、アミノ酸、バイオポリマー、ポリケチド及びバイオサーファクタントが挙げられる。
本明細書で提供される範囲は、その範囲内の全ての値について簡潔に記したものと理解される。例えば、１～２０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群からの任意の数、組み合わせ、又は部分範囲、同様に、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、及び１．９等の前述の整数間にある全ての１０進値を含むと理解される。部分範囲に関して、範囲のいずれかの終点から延びる「ネストされた部分範囲」が具体的に考えられる。例えば、１～５０の例示的な範囲のネストされた部分範囲は、一方向に１～１０、１～２０、１～３０、及び１～４０、又は他方向に５０～４０、５０～３０、５０～２０、及び５０～１０を含む。
本明細書で使用される場合、「減少」とは負の変化を意味し、「増加」とは正の変化を意味し、変化は、プラス又はマイナス０．００１％、０．０１％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。
本明細書で使用される場合、「界面活性剤」は、２つの液体間又は液体と固体の間の表面張力（又は界面張力）を低下させる化合物を意味する。界面活性剤は、例えば、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、及び／又は分散剤として作用する。「バイオサーファクタント」は、生細胞によって生成される界面活性物質である。
本明細書で使用される場合、「ブロス」、「培養ブロス」、又は「発酵ブロス」は、少なくとも栄養素及び微生物細胞を含む培養培地を指す。
別途必要としない限り、「発酵」、「発酵プロセス」又は「発酵反応」等の語句は、本明細書で使用される場合、プロセスの増殖期及び生成物生合成相の両方が包含されるものとする。
本明細書で使用される場合、「リアクター」、「バイオリアクター」、又は「発酵リアクター」という用語は、１つ以上の容器及び／又は塔又は配管配置からなる発酵装置を含む。そのようなリアクターの例としては、これらに限られるものではないが、連続撹拌タンクリアクター（ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクター（ＩＣＲ）、トリックルベッドリアクター（ＴＢＲ）、バブルカラム、ガスリフト発酵槽、スタティックミキサー、又は気液接触に適したその他の容器や装置が挙げられる。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、第１の増殖リアクター及び第２の発酵リアクターを含んでもよい。このように、バイオリアクター又は発酵反応への基質の添加に言及する場合、適宜、これらのリアクターのいずれか又は両方への添加を含むものとする。
本明細書で使用される場合、「組換え微生物」は、親微生物と比較したときに、意図的な遺伝子改変を受けた微生物である。「遺伝子改変」は、広く解釈されるものとし、例えば、核酸の挿入、欠失又は置換を含む。
「親微生物」は、本発明の組換え微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物は、天然に存在するもの（すなわち、野生型微生物）であってもよいし、以前に改変されたもの（すなわち、組換え微生物）であってもよい。本発明の組換え微生物は、親微生物において所望のレベルまで発現又は過剰発現されなかった１つ以上のタンパク質／酵素を発現又は過剰発現するように改変されてもよく、又は代謝産物の生産性の増加を示すように改変されてもよい。
「有する」又は「含有する」と同義である「含む」という移行句は、包括的又はオープンエンドであり、追加の非記載の構成要件又は方法ステップを排除しない。対照的に、「からなる」という移行句は、請求項に指定されていない任意の構成要件、ステップ、又は成分を排除する。「から実質的になる」という移行句は、請求項の範囲を、特定の材料又はステップ及び請求項に記載された発明の「基本的かつ新規な特徴に本質的に影響を及ぼさないもの」に限定する。「含む」という用語の使用は、記載された構成要件「からなる」又は「から実質的になる」他の実施形態を意図する。
具体的に述べられていないか、又は内容から明らかでない限り、本明細書で使用される「又は」という用語は、包括的であると理解される。具体的に述べられていないか、又は内容から明らかでない限り、本明細書で使用される「１つの」、「及び」、「その」という用語は、単数形又は複数形であると理解される。
具体的に述べられていないか、又は内容から明らかでない限り、本明細書で使用される「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内と理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解することができる。内容から他に明らかでない限り、本明細書に提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
本明細書に記載される可変の任意の定義における化学基の列挙は、任意の１つの基又は列挙された基の組み合わせとして、可変の定義を含む。本明細書中の可変又は態様の実施形態の列挙は、その実施形態を任意の単一の実施形態として、あるいは任意の他の実施形態又はその一部と組み合わせて含む。
本明細書に引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
微生物
本発明による微生物は、例えば、細菌、酵母、真菌又は多細胞生物である。本発明に従って利用される微生物は、天然、又は遺伝的に改変された微生物である。例えば、微生物は、特定の特徴を示すために特定の遺伝子で形質転換される。また、微生物は、所望の株の突然変異体であってもよい。本明細書で使用される場合、「変異体」は、親微生物の株、遺伝的変異体又はサブタイプを意味し、変異体は、親微生物と比較して１つ以上の遺伝的変異（例えば、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失、重複、フレームシフト突然変異又は反復膨張）を有する。変異体を作製する手順は、微生物学技術分野において周知されている。例えば、ＵＶ突然変異誘発及びニトロソグアニジンは、この目的のために広く使用されている。
一実施例において、微生物は、グラム陽性及びグラム陰性細菌を含む細菌である。これらの細菌は、これらに限られるものではないが、例えば、Saccharopolyspora erythraea、Escherichia coli、Rhizobium（例えば、Rhizobium japonicum、Sinorhizobium meliloti、Sinorhizobium fredii、Rhizobium leguminosarum biovar trifolii及びRhizobium etli）、Bradyrhizobium（例えば、Bradyrhizobium japanicum及びB. parasponia）、Bacillus（例えば、Bacillus subtilis、Bacillus firmus、Bacillus laterosporus、Bacillus megaterium、Bacillus amyloliquifaciens）、Azobacter（例えば、Azobacter vinelandii及びAzobacter chroococcum）、Arhrobacter（例えば、Agrobacterium radiobacter）、Pseudomonas（例えば、Pseudomonas chlororaphis subsp. Aureofaciens（Kluyver））、Azospirillium（例えば、Azospirillumbrasiliensis）、Azomonas、Derxia、Beijerinckia、Nocardia、Klebsiella、Clavibacter（例えば、C. xyli subsp. xyli及びC. xyli subsp. cynodontis）、cyanobacteria、Pantoea（例えば、Pantoea agglomerans）、Sphingomonas（例えば、Sphingomonas paucimobilis）、Streptomyces（例えば、Streptomyces griseochromogenes、Streptomyces qriseus、Streptomyces cacaoi、Streptomyces aureus及びStreptomyces kasugaenis）、Streptoverticillium（例えば、Streptoverticillium rimofaciens）、Ralslonia（例えば、Ralslonia eulropha）、Rhodospirillum（例えば、Rhodospirillum rubrum）、Xanthomonas（例えば、Xanthomonas campestris）、Erwinia（例えば、Erwinia carotovora）、Clostridium（例えば、Clostridium bravidaciens及びClostridium malacusomae）及びそれらの組み合わせである。
好ましい実施形態において、微生物は、任意の酵母又は真菌である。本発明による使用に適した酵母及び真菌種の例としては、限定されるものではないが、Acaulospora、Aspergillus、Aureobasidium（例えば、A. pullulans）、Blakeslea、Candida（例えば、C. albicans、C. apicola）、Cryptococcus、Debaryomyces（例えば、D. hansenii）、Entomophthora、Fusarium、Hanseniaspora（例えば、H. uvarum）、Hansenula、Issatchenkia、Kluyveromyces、Mortierella、Mucor（例えば、M. piriformis）、Meyerozyma（例えば、M. guilliermondii）、Penicillium、Phythium、Phycomyces、Pichia（例えば、P. anomala、P. guilliermondii、P. occidentalis、P. kudriavzevii）、Pseudozyma（例えば、P. aphidis）、Rhizopus、Saccharomyces（S. cerevisiae、S. boulardii sequela、S. torula）、Starmerella（例えば、S. bombicola）、Torulopsis、Thraustochytrium、Trichoderma（例えば、T. reesei、T. harzianum、T. virens）、Ustilago（例えば、U. maydis）、Wickerhamomyces（例えば、W. anomalus）、Williopsis及びZygosaccharomyces（例えば、Z. bailii）が挙げられる。
好ましい態様において、微生物は、例えば、Starmerella spp.酵母及び／又はCandida spp.酵母、例えば、Starmerella (Candida) bombicola、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、Candida stellate及び／又はCandida kuoiである。特定の実施形態において、微生物は、Starmerella bombicola、例えば、ＡＴＣＣ２２２１４株である。
好ましい実施形態において、ソホロ脂質生成酵母は、Starmerella bombicola、又はStarmerella及び／又はCandidaクレードの他の部類である。例えば、S.bombicola株ＡＴＣＣ２２２１４を、本発明の方法に従って使用することができる。
方法
本発明は、高純度で微生物代謝産物を生成、単離、抽出及び精製する材料及び方法を提供する。具体的には、本発明は、微生物代謝産物を、例えば、少なくとも８０重量％、好ましくは、少なくとも９５重量％以上の純度に精製する材料及び方法を提供する。
本発明はまた、生合成混合物から単一分子生成物を生成、単離、抽出、取得及び精製する材料及び方法を提供する。単一分子生成物は、他の化合物又は細胞物質を実質的に含まない。精製又は単離された単一分子生成物は、例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９８重量％、又は少なくとも９９重量％、少なくとも９９．９重量％、又は少なくとも１００重量％の純度を有する。
一実施形態において、高純度で微生物代謝産物を抽出する方法は、代謝産物生成微生物を培養して、液体発酵培地、細胞、及び１つ以上の微生物代謝産物を含む微生物培養ブロスを生成し、培養物から単一の微生物代謝産物を抽出することを含む。特定の実施形態において、２つ以上の微生物代謝産物が微生物によって生成され、２つ以上の微生物代謝産物のそれぞれを、高純度で培養物から抽出することもできる。
本発明は、選択的分子分離を提供する。特定の実施形態において、目的の代謝産物は、厳密に親水性又は疎水性ではなく、代わりに、より親水性又は疎水性の傾向を有する両親媒性という特徴を持つ。このように、分子の混合物は、わずかに異なる疎水性／親水性を有する成分を有する溶液で処理して、目的の分子は、他の成分に比して、最も好ましい特性を有する成分となる。複数のサイクルの過程が繰り返されると、そのプロセスによって、好適な溶媒中に存在する単一分子が得られる。
一実施形態において、本方法は、発酵リアクターに液体栄養培地を充填し、目的の１つ以上の微生物代謝産物、例えば、ソホロ脂質生成酵母を生成する微生物をリアクターに接種して微生物培養物を生成し、１つ以上の微生物代謝産物、例えば、ＳＬＰ、エリスロマイシン及び／又は脂肪酸イソプロピルエステルの生成に好ましい条件下で微生物培養物を培養することを含む。
本発明に従って使用される微生物増殖容器は、工業的使用のための任意の発酵槽又は培養リアクターである。一実施形態において、容器は、ｐＨ、酸素、圧力、温度、撹拌機シャフト出力、湿度、粘度、及び／又は微生物密度及び／又は代謝産物濃度等の培養プロセスにおける重要な因子を測定するために、機能的制御／センサを有している、又は接続されていてもよい。
さらなる実施形態において、容器は、容器内の微生物の増殖（例えば、細胞数及び増殖期の測定）を監視することもできる。あるいは、計数、純度測定、代謝産物濃度、及び／又は可視油レベルモニタリングのために、容器から試料を採取してもよい。例えば、一実施形態において、サンプリングは２４時間毎に行うことができる。
本方法による微生物の接種材料は、好ましくは、任意の公知の発酵方法を用いて調製することができる、所望の微生物の細胞及び／又は繁殖体を含む。接種物は、所望であれば、水及び／又は液体増殖培地と予め混合しておく。
特定の実施形態において、培養方法は、液体増殖培地中で浸漬発酵を利用する。一実施形態において、液体増殖培地は、炭素源を含む。炭素源は、グルコース、デキストロース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、及び／又はマルトース等の炭水化物、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、及び／又はピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール、及び／又はグリセロール等のアルコール、キャノーラ油、大豆油、米ぬか油、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、ゴマ油、及び／又は亜麻仁油等の油脂、粉末糖蜜等である。これらの炭素源は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。好ましい実施形態において、親水性炭素源、例えば、グルコース、及び疎水性の炭素源、例えば、油又は脂肪酸が使用される。
一実施形態において、液体増殖培地は、窒素源を含む。窒素源は、例えば、酵母エキス、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素樹脂、及び／又は塩化アンモニウムである。これらの窒素源は、単独で、又は２種以上の組み合わせで使用することができる。
一実施形態において、１つ以上の無機塩もまた、液体増殖培地に含まれてもよい。無機塩は、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸一カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び／又は炭酸ナトリウムを含むことができる。これらの無機塩は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
一実施形態において、微生物の増殖因子及び微量栄養素が培地に含まれる。これは、それらが必要とするビタミンの全てを生成することができない微生物を増殖させる場合に特に好ましい。鉄、亜鉛、銅、マンガン、モリブデン及び／又はコバルトのような微量元素を含む無機栄養素もまた、培地に含まれる。さらに、ビタミン、必須アミノ酸、タンパク質及び微量元素の供給源は、例えば、トウモロコシ粉、ペプトン、酵母エキス、ジャガイモエキス、ビーフエキス、大豆エキス、バナナピールエキス等、又は精製された形態で含まれる。各種アミノ酸、例えば、タンパク質の生合成に有用な各種アミノ酸もまた含まれる。
培養方法は、増殖培養物に酸素化をさらに提供することができる。一実施形態は、低酸素含有空気を除去し、酸素化空気を導入するために、空気の緩慢な動きを利用する。酸素化空気は、液体の機械的撹拌のためのインペラ、及び液体中への酸素の溶解のために液体に気体の気泡を供給するための空気スパージャーを含む機構によって毎日補充される周囲空気であってもよい。特定の実施形態において、溶存酸素（ＤＯ）レベルは、空気飽和の約２５％～約７５％、約３０％～約７０％、約３５％～約６５％、約４０％～約６０％、又は約５０％に維持される。
いくつかの実施形態において、培養方法は、培養プロセスの前及び／又は間に、液体培地に、追加の酸及び／又は抗菌剤を添加することをさらに含んでいてもよい。抗菌剤又は抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン）は、培養物を汚染から保護するために使用される。しかしながら、いくつかの実施形態において、酵母培養物によって生成される代謝産物は、培養物の汚染を防止するのに十分な抗菌効果を提供する。
一実施形態において、接種前に、液体培養培地の成分を、任意で、滅菌することができる。一実施形態において、液体増殖培地の滅菌は、液体培養培地の成分を、約８５～１００℃の温度で水中に入れることで行える。一実施形態において、滅菌は、１：３（ｗ／ｖ）の比率で、１～３％の過酸化水素に成分を溶解することによって行える。
一実施形態において、培養に使用される装置は、滅菌されている。リアクター／容器のような培養装置は、滅菌ユニット、例えば、オートクレーブから分離されてもよいが、接続されてもよい。また、培養装置は、接種を開始する前に、インサイチュで滅菌する滅菌ユニットを有してもよい。ガスケット、開口部、チューブ、及び他の機器部品には、例えば、イソプロピルアルコールを噴霧することができる。空気は、当該技術分野で公知の方法によって滅菌することができる。例えば、周囲空気を、容器内に導入される前に、少なくとも１つのフィルタに通過させることができる。他の実施形態において、培地は、低温殺菌されてもよく、又は、任意で、全く熱が加えられなくてもよく、ｐＨ及び／又は低水分活性の使用は、望ましくない微生物増殖を制御するために利用される。
培養物のｐＨは、目的の微生物に適したものとする。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約２．０～約１０．０、約２．０～約９．５、約２．０～約９．０、約２．０～約８．５、約２．０～約８．０、約２．０～約７．５、約２．０～約７．０、約３．０～約７．５、約４．０～約７．５、約５．０～約７．５、約５．５～約７．０、約６．５～約７．５、約３．０～約５．５、約３．２５～約４．０、又は約３．５である。緩衝液、及び炭酸塩やリン酸塩等のｐＨレギュレータを使用して、ｐＨを好ましい値付近に安定化させてもよい。特定の実施形態において、塩基溶液を使用して、培養物のｐＨを好ましいレベル、例えば、１５％～３０％、又は２０％～２５％のＮａＯＨ溶液に調整する。塩基溶液は、必要に応じてｐＨを調整するために、増殖培地に含める、及び／又は培養中に発酵リアクターに供給することができる。
一実施形態において、培養方法は、約５°～約１００℃、約１５°～約６０℃、約２０°～約５０℃、約２０°～約４５℃、約２５°～約４０℃、約２５°～約３７℃、約２５°～約３５℃、約３０°～約３５℃、約２４°～約２８℃、又は約２２°～約２５℃で実施される。一実施形態において、培養は、一定温度で連続的に実施することができる。別の実施形態において、培養は、変化する温度で行ってもよい。
本発明によれば、微生物は、所望の効果、例えば、所望の量の細胞バイオマス又は所望の量の微生物代謝産物等の１つ以上の微生物増殖副産物の生成を達成するのに十分な時間、発酵システム中でインキュベートすることができる。微生物によって生成される微生物増殖副産物は、微生物中に保持される、及び／又は増殖培地中に分泌される。バイオマス含量は、例えば、５ｇ／ｌ～１８０ｇ／ｌ以上、又は１０ｇ／ｌ～１５０ｇ／ｌである。
特定の実施形態において、酵母培養物の発酵が約１００～１５０時間、又は約１１５～約１２５時間、又は約１２０時間行われる。いくつかの実施形態において、培地中のグルコース及び／又は油濃縮物を使いつくすと、発酵サイクルが終了する。いくつかの実施形態において、発酵サイクルの終了は、微生物が微量のＳＬＰを消費し始めた時点と判断される。
一実施形態において、本発明は、１つ以上の微生物代謝産物を高純度で単離／抽出／精製する方法を提供し、この方法は、
１）代謝産物生成微生物を培養して、微生物培養液を生成するステップと、
２）培養ブロスを、１つ以上の溶媒、好ましくは、非極性溶媒と混合するステップと、
３）ステップ２）の混合物を遠心分離して、混合物中で相分離を引き起こし、溶媒層（例えば、非極性層）、相間層、水層及び細胞層を分離する、ステップと、
４）溶媒層（例えば、非極性層）、相間層、水層及び細胞層から選択される１つ以上の層を別々に収集するステップと、
５）収集された層のそれぞれを独立して遠心分離し、１つ以上の収集された層から上清又は溶媒層のそれぞれを独立して収集するステップと、
６）例えば、蒸発によって、非極性層、相間層、水層、及び細胞層のそれぞれから１つ以上の微生物代謝産物を得るステップとを含む。
一実施形態において、本方法は、培養ブロスを、１つ以上の非極性溶媒と混合することを含む。本発明の溶媒としての非極性化学物質の例としては、これらに限られるものではないが、酢酸エチル、ポリエチレングリコール、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ペンタン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、シクロヘキサン、ヘプタン、二硫化炭素、ｐ－キシレン、ベンゼン、エーテル、メチルｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ジエチルアミン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、クロロベンゼン、アニソール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、安息香酸エチル、ジメトキシエタン、ジグリム、酢酸メチル、四塩化炭素、３－ペンタノン、１，１－ジクロロエタン、フタル酸ジ－ｎ－ブチル、シクロヘキサノン、及びピリジンが挙げられる。好ましくは、非極性溶媒は、酢酸エチルである。
一実施形態において、培養ブロスを、溶媒、好ましくは、非極性溶媒と、１：１０（ｖ／ｖ）～１０：１（ｖ／ｖ）、１：５（ｖ／ｖ）～５：１（ｖ／ｖ）、及び１：２（ｖ／ｖ）～２：１（ｖ／ｖ）の比率で混合する。具体的には、培養ブロスを、例えば、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２：９、２：７、２：５、２：３、３：８、３：７、３：５、３：４、３：２、４：９、４：７、４：５、５：９、５：８、５：７、５：６、５：４、５：３、５：２、６：７、６：５、７：９、７：８、７：６、７：５、７：４、７：３、７：２、８：９、８：７、８：５、８：３、９：８、９：７、９：５、９：４又は９：２の比率で、非極性溶媒と混合する。好ましくは、培養ブロスを、１：１の比率で非極性溶媒と混合する。
一実施形態において、培養ブロスを、溶媒、好ましくは、非極性溶媒と、少なくとも０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２４、３０、３６、４２、４８、５４、又は６０時間混合する。好ましくは、培養ブロスを、溶媒、好ましくは、非極性溶媒と少なくとも２４時間混合する。
次いで、培養ブロスと溶媒との混合物を、混合物中で相分離を引き起こすのに十分な時間、速度で遠心分離する。好ましくは、混合物を、３０分間、１００００ｇで遠心分離する。その結果、非極性溶媒層、相間層、水相層及び細胞層が形成される。非極性層、相間層、水相層及び細胞層は、別々に収集される。
一実施形態において、非極性層及び水層を、それぞれ別々に収集し、析出に十分な時間、速度で遠心分離する。非極性層及び水層のそれぞれについての速度及び／又は時間は、同じであっても異なっていてもよい。好ましい実施形態において、非極性層及び水層を、それぞれ３０分間、１００００ｇで遠心分離する。非極性層及び水層のそれぞれから上清又は溶媒層を収集する。非極性層からの沈殿物は、前に収集された相間層と組み合わされ、一方、水層からの沈殿物は、前に収集された細胞層と組み合わされる。
一実施形態において、本方法は、例えば、ロータリーエバポレータを使用して、水層の収集された上清を蒸発させることによって、微生物代謝産物の単一分子生成物を得ることを含む。
本発明によれば、ロータリーエバポレータの温度は、例えば、約４℃～約６０℃、約１０℃～約６０℃、約１５℃～約５５℃、約２０℃～約５０℃、約２０℃～約４５℃、約２５℃～約４５℃、約３０℃～約４５℃、又は約３５℃～約４５℃の範囲である。好ましくは、ロータリーエバポレータの温度条件は、生成物の分解を防ぐために４５℃以下である。
本発明によれば、ロータリーエバポレータの圧力は、例えば、約１ｍｂａｒ～１ｂａｒ、約２ｍｂａｒ～９００ｍｂａｒ、約２ｍｂａｒ～８００ｍｂａｒ、約２ｍｂａｒ～７００ｍｂａｒ、約２ｍｂａｒ～６００ｍｂａｒ、約５ｍｂａｒ～５００ｍｂａｒ、約５ｍｂａｒ～４００ｍｂａｒ、約５ｍｂａｒ～３００ｍｂａｒ、約５ｍｂａｒ～２００ｍｂａｒ、約５ｍｂａｒ～１００ｍｂａｒ、約５ｍｂａｒ～１００ｍｂａｒ、約５ｍｂａｒ～９０ｍｂａｒ、約５ｍｂａｒ～８０ｍｂａｒ、約５ｍｂａｒ～７０ｍｂａｒ、約５ｍｂａｒ～６０ｍｂａｒ、又は約５ｍｂａｒ～５０ｍｂａｒの範囲である。
本発明によれば、遠心分離に使用される相対遠心力（ｒｃｆ）又は加速度は、例えば、約１０００ｇ～約１００００００ｇ、約１０００ｇ～約５０００００ｇ、約１０００ｇ～約２０００００ｇ、約１０００ｇ～約１０００００ｇ、約１０００ｇ～約５００００ｇ、約１０００ｇ～約２００００ｇ、約１０００ｇ～約１００００ｇ、約２０００ｇ～約２００００ｇ、約５０００ｇ～約２００００ｇ、約１００００ｇ～約２００００ｇ、又は約１０００ｇ～約１５０００ｇの範囲である。
本発明によれば、遠心分離の時間は、例えば、約１分～約３６０分、約１分～約３００分、約５分～約２４０分、約１０分～約２１０分、約１０分～約１８０分、約１５分～約１５０分、約１５分～約１２０分、約１５分～約９０分、約１５分～約６０分、約１５分～約４５分、又は約２０分～約３０分の範囲である。好ましくは、各遠心分離は、約１５分間～約４５分間行われる。より好ましくは、各遠心分離は、３０分間行われる。
一実施形態において、水層を、上述のステップ４）で収集する。一実施形態において、本発明は、ステップ４）で得られた水層から微生物代謝産物の単一分子生成物を単離／抽出／精製する方法を提供する。好ましくは、水層から得られた微生物代謝産物は、親水性分子又は水溶性分子である。微生物代謝産物を得る方法は、例えば、ロータリーエバポレータを介して、上述のステップ５）から収集された上清中の水分を蒸発させ、微生物代謝産物の単一分子生成物を高純度で得ることを含む。
一実施形態において、本発明による方法はまた、水層から微生物代謝産物の１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の単一分子生成物を単離、抽出、取得、及び／又は精製するステップも提供する。この方法は、上記のステップ４）及び／又は５）で収集された水層中の微生物代謝産物のそれぞれを得るために、非極性の増加した溶媒を使用する複数の単離／抽出／精製サイクルを含む。一実施形態において、各単離／抽出／精製サイクルは、
ｉ）水層の蒸発生成物を得るステップと、
ｉｉ）水層の蒸発生成物を、溶媒、例えば、メタノール等のアルコールと混合するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの混合物を遠心分離し、上清又は溶媒層を収集するステップと、
ｉｖ）例えば、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を蒸発させることによって、微生物代謝産物の単一分子生成物を得るステップとを含み、
各サイクルは、前のサイクルで使用された溶媒よりも非極性である異なる溶媒を使用する。好ましくは、溶媒は、メタノール、エタノール、１－プロパノール、１－ブタノール、１－ヘキサノール、１－ヘプタノール、２－プロパノール、２－ブタノール、アセトン、及びクロロホルムの順で使用される。
一実施形態において、本発明の方法は、微生物代謝産物の得られた生成物を精製して、他の化合物、例えば、カラメル化グルコース等のグルコースを除去するさらなるステップを含む。本方法は、上記のように、水層からの蒸発生成物を、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％のアルコールと混合し、水層からの蒸発生成物とアルコールとの混合物を遠心分離し、上清を収集し、ロータリーエバポレータを使用して収集された上清中のアルコールを蒸発させることによって単一分子生成物を得ることをさらに含む。
一実施形態において、水層からの蒸発生成物を、１：１０（ｖ／ｖ）～１０：１（ｖ／ｖ）、１：５（ｖ／ｖ）～５：１（ｖ／ｖ）、及び１：２（ｖ／ｖ）～２：１（ｖ／ｖ）の比率でアルコールと混合する。具体的には、水層からの蒸発生成物を、例えば、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：１：１、１：３、１：２、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２：５、２：３、３：５、３：４又は３：２の比率でアルコールと混合する。好ましくは、水層からの蒸発生成物を、１：１の比率でアルコールと混合する。
一実施形態において、水層からの蒸発生成物を、室温で、又はより高い収率のために、それより低い温度でアルコールと混合する。例示的な温度は、約４℃～約３０℃、約５℃～約２５℃、約１０℃～約２５℃、約１５℃～約２５℃、約２０℃～約２５℃、又は約２２℃～約２５℃である。一実施形態において、混合は、一定温度で連続的に実施される。別の実施形態において、混合は、変化する温度で行ってもよい。
一実施形態において、水層からの蒸発生成物を、少なくとも０．５、１、５、１０、１５、２０、２４、３０、３６、４２、４８、５４、又は６０時間、アルコールと混合する。好ましくは、水層からの蒸発生成物を、アルコールと２４時間混合する。
利点を挙げると、水層からの蒸発生成物をアルコールと混合することにより、アルコールに溶解しない化合物を除去することができ、一方、本発明の微生物代謝産物の単一分子生成物はアルコールに溶解することができる。
一実施形態において、水層からの蒸発生成物とアルコールとの混合物を、アルコールに溶解しない化合物を沈殿させるのに十分な速度、時間で、遠心分離する。好ましくは、その混合物を３０分間、１００００ｇで遠心分離する。上清、すなわち、アルコール層と、沈殿物を別々に収集する。次いで、収集された上清中のアルコールを、ロータリーエバポレータを用いて蒸発させることによって、単一分子生成物を得る。
一実施形態において、本発明による「アルコール」としては、これらに限られるものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ヘキサデカノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、及びマンニトールが挙げられる。
いくつかの実施形態において、アルコール層からの蒸発生成物中に２つ以上の微生物代謝産物が存在する。このような蒸発生成物を、別の溶媒、例えば、水層からの蒸発生成物と混合するために使用されるアルコールよりも非極性であるアルコールと混合することができる。より非極性の化合物のみが分解されるため、例えば、３０分、１００００ｇで遠心分離を行うと、溶けにくい化合物が析出により分離されることになる。より非極性の層がさらに蒸発することによって、単一分子のみを含有する生成物が得られる。
特定の実施形態において、メタノールを水層からの蒸発生成物と混合して、メタノール層から蒸発生成物を得る。次いで、メタノール層のそのような生成物を、例えば、メタノールよりも非極性であり、２つ以上の微生物代謝産物の中でより非極性である化合物を溶解する１００％エタノールと混合することができる。例えば、モノアセチル化及びジアセチル化直鎖状ＳＬＰの両方がメタノール層からの蒸発生成物中に存在する場合、そのような生成物を、１００％エタノールと混合すると、最初に、より非極性の生成物、すなわち、ジアセチル化直鎖状ＳＬＰを溶解する。従って、ジアセチル化直鎖状ＳＬＰのみがエタノールに溶解する。このような生成物を遠心分離すると、モノアセチル化直鎖状ＳＬＰが析出され、一方、ジアセチル化直鎖状ＳＬＰは、エタノール層の上清から得られる。このようなエタノール層のさらなる蒸発によって、ジアセチル化直鎖状ＳＬＰのみを含有する生成物が得られる。
いくつかの実施形態において、水層からの蒸発生成物中に２つ以上の微生物代謝産物が存在する。上記のステップは、生成物を、異なる溶媒と、それらの非極性を増加させることによって混合することによって、繰り返すことができる。溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、１－ブタノール、１－ヘキサノール、１－ヘプタノール、２－プロパノール、２－ブタノール、アセトン、クロロホルムの順で使用される。
一実施形態において、非極性層を、上述のステップ４）で収集する。一実施形態において、本発明による方法は、上述のステップ４）で得られた非極性層から微生物代謝産物の単一分子生成物を単離／抽出するステップを提供する。微生物代謝産物を得る方法は、収集された上清又は溶媒層中の非極性溶媒を、上記のステップ５）から、例えば、ロータリーエバポレータを介して蒸発させ、微生物代謝産物の単一分子生成物を高純度で得ることを含む。
一実施形態において、本発明による方法はまた、上述のステップ５）で得られた非極性層から微生物代謝産物の１つ以上の単一分子産物を単離、抽出、取得、及び／又は精製するステップも提供する。本方法は、上述のステップ４）及び／又は５）で収集された非極性層中の１つ以上の微生物代謝産物のそれぞれを得るために、極性の増加した溶媒を使用する複数の単離／抽出／精製サイクルを含む。一実施形態において、各単離／抽出／精製サイクルは、
ｉ）非極性層の蒸発生成物を得るステップと、
ｉｉ）非極性層の蒸発生成物を、溶媒、例えば、クロロホルム等の非極性溶媒と混合するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの混合物を遠心分離し、上清又は溶媒層を収集するステップと、
ｉｖ）例えば、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を蒸発させることによって微生物代謝産物の単一分子生成物を得るステップとを含み、
各サイクルは、前のサイクルで使用された溶媒よりも極性が高い異なる溶媒を使用する。好ましくは、溶媒は、クロロホルム、アセトン、２－ブタノール、２－プロパノール、１－ヘプタノール、１－ヘキサノール、１－ブタノール、１－プロパノール、エタノール、及びメタノールの順で使用される。
一実施形態において、非極性層から単一分子生成物を得る方法は、例えば、ロータリーエバポレータを用いて、非極性層の収集した上清を蒸発させることにより、非極性層から蒸発生成物を得て、非極性層の蒸発生成物を、例えば、クロロホルムのような第２の極性でない溶媒と混合して、混合物を、例えば、３０分、１００００ｇで遠心分離して、上下層を生成し、上下層を別々に収集し、上下層を蒸発させて、単一分子生成物を得る方法である。下層は、その内容物を分析するために蒸発させることもできる。
一実施形態において、非極性層からの蒸発生成物を、１：１０（ｖ／ｖ）～１０：１（ｖ／ｖ）、１：５（ｖ／ｖ）～５：１（ｖ／ｖ）、及び１：２（ｖ／ｖ）～２：１（ｖ／ｖ）の比率で、クロロホルム等の第２の非極性溶媒と混合する。具体的には、非極性層からの蒸発生成物を、第２の非極性溶媒、例えば、クロロホルムと、例えば、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２：５、２：３、３：５、３：４、又は３．２の比率で混合する。好ましくは、非極性層からの蒸発生成物を、１：１の比率で第２の非極性溶媒と混合する。
一実施形態において、非極性層からの蒸発生成物を、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２４、３０、３６、４２、４８、５４、又は６０時間、第２の非極性溶媒と混合する。好ましくは、水層からの蒸発生成物をアルコールと２４時間混合する。
いくつかの実施形態において、２つ以上の微生物代謝産物が、非極性層からの蒸発生成物中に存在する。次いで、上層の蒸発生成物を、より極性の化合物のみが溶解するように、第２の非極性溶媒より極性の高い別の溶媒と混合することができる。例えば、クロロホルムを第２の非極性溶媒として使用する場合、上層の蒸発生成物を、次いで、例えば、クロロホルムよりも極性の高い溶媒であるアセトンと混合する。いくつかの実施形態において、下層の蒸発生成物もこのように処理することができる。例えば、３０分、１００００ｇでの遠心分離後、上清を収集して蒸留し、単一分子生成物を得て、溶けにくい化合物は析出によって分離される。
特定の実施形態において、上記のステップは、蒸発生成物を、異なる溶媒と混合することによって、極性を増加させることによって、繰り返すことができる。溶媒は、例えば、クロロホルム、アセトン、２－ブタノール、２－プロパノール、１－ヘプタノール、１－ヘキサノール、１－ブタノール、１－プロパノール、エタノール、メタノールの順で使用される。
一実施形態において、相間層を、上述のステップ４）で収集する。一実施形態において、本方法は、非極性又は水層に入ることができない異なる分子の混合物を含む単一分子生成物を相間層から得ることをさらに含む。本発明によれば、相間層から単一分子生成物を得るステップは、例えば、ロータリーエバポレータを用いて相間層から蒸発生成物を得るステップと、相間層の蒸発生成物を、クロロホルム等の無極性溶媒と混合するステップと、混合物を、例えば、３０分間、１００００ｇで遠心分離するステップと、単一分子生成物を収集するステップとを含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の微生物代謝産物は、相間層中に存在する。相間層は、本発明による非極性層として処理することができる。非極性層から単一分子生成物を抽出する上述のステップは、蒸発生成物を、高い極性の異なる溶媒と混合することによって、微生物代謝産物のそれぞれが抽出されるまで繰り返すことができる。溶媒は、例えば、クロロホルム、アセトン、２－ブタノール、２－プロパノール、１－ヘプタノール、１－ヘキサノール、１－ブタノール、１－プロパノール、エタノール、メタノールの順で使用される。
一実施形態において、細胞層を、上述のステップ４）で収集する。一実施形態において、本発明による方法は、細胞層から単一分子生成物を得ることをさらに含む。細胞層は、細胞及びタンパク質を含む。細胞層は、本発明による水層と同様に処理することができる。水層から単一分子生成物を抽出する上述のステップは、蒸発生成物を、非極性の増大した異なる溶媒と混合することによって、微生物代謝産物のそれぞれが抽出されるまで、繰り返すことができる。溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、１－ブタノール、１－ヘキサノール、１－ヘプタノール、２－プロパノール、２－ブタノール、アセトン、クロロホルムの順で使用される。
特定の実施形態において、本発明の方法は、廃棄物を最小～ゼロに抑え、それによって、下水及び廃水システムに排出される、及び／又は埋立地に廃棄される発酵廃棄物の量を低減するように実施される。さらに、これは、単一の発酵サイクルから、全体的な微生物代謝産物生成を増加させつつ、達成することができる。
微生物代謝産物の除去及び精製後に培養物から収集された細胞バイオマスは、典型的には不活性化され、廃棄される。しかしながら、これらに限られるものではないが、土壌改良剤、家畜飼料サプリメント、油井処理、及び／又はスキンケア製品を含む様々な目的のために、本方法は、細胞バイオマスを収集し、生存又は不活性な形態でそれを使用することをさらに含むことができる。細胞バイオマスは直接使用することができ、又は意図する用途に特有の添加剤と混合することができる。
低い毒性及び生分解性の特性と組み合わせて、ＳＬＰ等の微生物代謝産物は、例えば、改善されたバイオレメディエーション、マイニング、及び石油及びガス生産、廃棄物廃棄及び処理、家畜及び他の動物の健康増進、防腐剤及び／又は乳化剤等の食品添加物、化粧品添加物、ならびに植物の健康増進及び生産性増進を含む多くの状況での使用に有利である。
一実施形態において、本発明は、１つ以上の精製微生物代謝産物を含む組成物を生成する方法をさらに提供する。特定の実施形態において、本発明は、精製ソホロ脂質（ＳＬＰ）組成物の生成方法を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、本方法に従って生成される組成物を提供する。組成物は、精製微生物代謝産物、例えば、ＳＬＰ、及び水を含む。好ましい実施形態において、組成物中の水の割合は、約１体積％～５０体積％、約５体積％～５０体積％、約１０体積％～４０体積％、好ましくは、約２０体積％～３０体積％である。
一実施形態において、組成物の精製ＳＬＰは、精製親水性ＳＬＰを含む。特定の実施形態において、組成物は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．９％の純度を有するＳＬＰを含む。
特定の実施において、組成物の精製されたＳＬＰは、例えば、直鎖状、モノアセチル化直鎖状、及び／又はジアセチル化直鎖状ソホロ脂質である。特定の実施形態において、組成物は、２つ以上の精製ＳＬＰ分子を含む。一実施形態において、組み合わせた組成物は、各精製ＳＬＰを一緒に組み合わせることによって得られる。
いくつかの実施形態において、組成物は、使用するまで容器に保管することができる。保管期間は短いことが好ましい。従って、保管期間は、６０日未満、４５日未満、３０日未満、２０日未満、１５日未満、１０日未満、７日未満、５日未満、３日未満、２日未満、１日未満、又は１２時間未満である。
本発明による組成物には、特定の使用のために必要に応じて、さらなる成分、例えば、ソホロリピジン組成物を添加することができる。添加剤は、例えば、緩衝剤、担体、同一又は異なる施設で生成された他の微生物ベースの組成物、粘度調整剤、保存剤、微生物増殖のための栄養素、植物増殖のための栄養素、溶媒、追跡剤、殺虫剤、除草剤、動物飼料、食品及び意図される用途に特定の他の成分である。
一実施形態において、組成物は、例えば、表面洗浄剤、食器洗剤又は洗濯クリーナー等の家庭用又は工業用洗浄組成物又はクリーナー中の活性成分として及び／又はアジュバントとして使用することができる。
一実施形態において、組成物は、例えば、ローション、クリーム、シャンプー、マスク、ジェル、メークアップ又は軟膏等の化粧品組成物中の活性成分として及び／又はアジュバントとして使用することができる。
一実施形態において、組成物は、例えば、土壌改良剤、殺虫剤、除草剤、生物刺激剤、葉面処理剤又は肥料等の農業組成物中の活性成分及び／又はアジュバントとして使用することができる。
一実施形態において、組成物は、例えば、仕上流体、掘削流体、破砕流体、洗浄処理、ワックス分散剤又は阻害剤、酸性化流体、粘度調整剤、乳化剤又は脱乳化剤等の石油及びガス産業用組成物中の活性成分として、及び／又はアジュバントとして使用することができる。
一実施形態において、組成物は、動物及び／又はヒトのための健康増進、栄養及び／又は治療用組成物、例えば、医薬、サプリメント、水和増強剤、食品もしくは飲料、又はプロバイオティック組成物中の活性成分として、及び／又はアジュバントとして使用することができる。
従来技術による微生物バイオサーファクタント、ポリケチド、及び／又は他の代謝産物の培養は、多段階を必要とする複雑で、時間及び資源を消費するプロセスである。利点を挙げると、本発明の方法は、複雑な設備又は高いエネルギー消費を必要とせず、従って、微生物及びそれらの代謝産物を大規模に生成するための資本コスト及び労働コストを低減する。さらに、本発明の方法及び装置は、微生物代謝産物を大規模に精製するための資本コスト及び労働コストを低減する。
実施例
本発明及びその多くの利点のより大きな理解は、例示として与えられる以下の実施例から得ることができる。以下の実施例は、本発明の方法、用途、実施形態及び変形のいくつかを例示するものである。それらは、本発明を限定するものとしない。本発明に関して、多数の変更及び修正を行うことができる。
実施例１－直鎖状ＳＬＰの生成及び精製のためのStarmerella bombicolaの培養
ステンレス鋼発酵リアクターは、ＳＬＰの生成に使用される。リアクターは、約１５０ガロンの水を含み、その中に、デキストロース（２５～１５０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（１～１０ｇ／Ｌ）、キャノーラ油（２５ｍｌ／Ｌ～１１０ｍｌ／Ｌ）及び尿素（０．５～５ｇ／Ｌ）を含む培地が添加される。
リアクターは、培養物の連続撹拌及び混合のための混合装置を含む。培地を含むリアクターは、リアクター及び増殖培地を滅菌するために、１００℃で約６０分間蒸気処理される。
次いで、リアクターを冷却する。リアクターが約３５℃に達したら、細菌汚染を防止するために抗生剤を培地に添加する。抗生物質組成物は、４ＬのＤＩ水に溶解した３００ｇのストレプトマイシン及び２０ｇのオキシテトラサイクリンを含む。他のリアクターチューブ及び開口部にイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を噴霧して、それらを滅菌する。
小規模リアクターは、Starmerella bombicola接種物培養物を増殖させるために使用される。培養物を、小規模リアクター中で２６～２８℃で少なくとも４２～４８時間増殖させる。
ステンレススチール発酵リアクターが３０℃に達したら、約２５Ｌの接種培養物を接種する。
発酵
発酵温度は、２３～２８℃に保たれる。約２２～２６時間後、培養物のｐＨを、２０%ＮａＯＨを用いて、約３．０～４．０、又は約３．５に設定する。発酵リアクターは、ｐＨを３．５に保つようｐＨを監視し、塩基を投与するために使用されるポンプを制御するコンピュータを含む。約６～７日間の培養（１２０時間＋／１時間）の後、バッチは採取の準備が整う。
抽出・精製
培養ブロスを遠心分離してラクトン型ＳＬＰ及び細胞を除去し、酢酸エチルと１：１の比率で少なくとも２４時間混合する。その後、混合物を３０分間、１００００ｇで遠心分離する。形成される非極性層、相間層、及び水相層は、別々に収集される。
非極性層及び水層をそれぞれ、３０分間、１００００ｇで再度遠心分離する。非極性層及び水層のそれぞれの上清を別々に収集し、ロータリーエバポレータを用いて蒸発させる。ロータリーエバポレータの温度は、好ましくは、生成物の分解を引き起こさないように、４５℃以下である。
水層の蒸発生成物は、オレイン酸テールを有する直鎖状モノアセチル化ＳＬＰ及びいくらかの残留カラメル化グルコースのみを含有する。グルコースは、ほとんどメタノールに不溶であるので、この生成物を１００％メタノールと混合する。このような反応は、室温で、又は高い収率のためには低い温度で実施することができる。３０分間、１００００ｇで遠心分離する前に、溶液を２４時間混合する。遠心分離後、グルコースは沈殿し、廃棄される。メタノール層を収集し、ロータリーエバポレータを用いて蒸発させる。蒸発生成物は、単一分子生成物、すなわち、直鎖状モノアセチル化ＳＬＰを含有する。
実施例２－イソプロピル脂肪酸エステルの生成及び精製
Meyerozyma guilliermondiiを用いて、脂肪酸エステルを生成する。１５０ガロンの滅菌脱イオン水及び増殖培地を有する発酵リアクターに、M. guilliermondii酵母細胞を接種して、酵母培養物を生成する。増殖培地は、以下を含む。
Figure 2023515537000002
ストレプトマイシン３００ｇ及びオキシテトラサイクリン２０ｇを含む４Ｌ溶液を、発酵リアクターに添加する。発酵の最初の２２～２４時間前に、ＨＣｌ水溶液を用いてｐＨを５．５に調整する。加温し、２４℃に維持し、発酵中、ｄＯ２は約３５％～約６５％に維持する。
発酵の最初の２２～２６時間後、２０％ＮａＯＨを含む塩基水溶液をリアクターに供給して、ｐＨを約６．９５～約７．０５に自動的に調整及び維持する。大豆油量のためのサンプリングは、発酵中に毎日行う。いくつかの脂肪酸エステルを含有する泡が、発酵プロセスを通して連続的に収集される。
全発酵時間は約９４～約９８時間である。サイクル終了後、酵母培養物をタンクに入れ、２４時間静置する。脂肪酸エステルを含む上層が形成され、下層の水層から分離される。
イソプロピルアルコールを脂肪酸エステル層に添加し、収集容器中で約１時間混合する。容器を約２４時間静置した後、脂肪酸エステル上層と下層が形成される。下層は除去され、廃棄される。発酵中に収集された任意の泡を残りの脂肪酸エステル層と混合して、粗イソプロピルエステル溶液を生成する。
粗イソプロピルエステル溶液は、イソプロピルオレイン酸／リノール酸／パルミチン酸エステル、同じく、いくつかの遊離脂肪酸エステル及び残留オレイン酸／リノール酸／パルミチン酸を含有する。この粗溶液を１０％ヘキサノールと１：１の比率で２４時間混合する。混合物を３０分間、１００００ｇで遠心分離する。純粋なイソプロピルパルミチン酸エステルは、溶液中の他の化合物よりも極性が高いので、ヘキサノール相に抽出される。イソプロピルパルミチン酸エステル（純度９８％まで）を含有する生成物は、ヘキサノールを蒸発させることによって得られる。
本明細書に記載した実施例及び実施形態は例示のみを目的とし、当業者にはそれらを考慮した様々な修正又は変更が示唆され、それらは本明細書の趣旨及び範囲内に含まれるものとする。
本明細書で言及又は引用した全ての特許、特許出願、仮出願、及び刊行物はそれらが本明細書の明白な開示と矛盾しない限り、その図面及び表を含む全体が参照により本明細書に援用される。

Claims (26)

  1. １つ以上の微生物代謝産物を高純度で抽出する方法であって、
    １）代謝産物生成微生物を培養して、液体発酵培地、微生物細胞及び１つ以上の微生物代謝産物を含む微生物培養ブロスを生成するステップと、
    ２）前記培養ブロスを非極性溶媒と混合するステップと、
    ３）ステップ２）の混合物を遠心分離して、前記混合物中で相分離を引き起こし、非極性層、相間層、水層及び細胞層を分離するステップと、
    ４）前記非極性層、前記相間層、前記水層及び前記細胞層から選択される１つ以上の層を別々に収集するステップと、
    ５）ステップ４）の１つ以上の収集された層を独立して遠心分離し、１つ以上の収集された層から１つ以上の上清を独立して収集するステップと、
    ６）蒸発によって１つ以上の微生物代謝産物を得るステップと
    を含む、方法。
  2. 前記代謝産物生成微生物は、酵母である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記酵母は、Starmerella bombicola又はMeyerozyma guilliermondiiである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記非極性溶媒は、酢酸エチルである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記培養液及び前記非極性溶媒を、１：１０～１０：１の比率で混合する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記培養ブロス及び前記非極性溶媒を、１：１の比率で混合する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記高純度は、少なくとも９５％である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記微生物代謝産物は、ソホロ脂質（ＳＬＰ）である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ＳＬＰは、ジアセチル化直鎖状ＳＬＰ及び／又はモノアセチル化直鎖状ＳＬＰを含む親水性ＳＬＰである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記水層を、ステップ４）で収集する、請求項１に記載の方法。
  11. ｉ）前記水層の蒸発生成物を得るステップと、
    ｉｉ）前記水層の蒸発生成物とアルコールを混合するステップと、
    ｉｉｉ）ステップｉｉ）の混合物を遠心分離し、アルコール層を収集するステップと、
    ｉｖ）前記アルコールを蒸発させることによって前記微生物代謝産物を得るステップと
    を含む、前記水層から１つ以上の微生物代謝産物を単離することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記アルコールは、メタノール又はエタノールである、請求項１に記載の方法。
  13. 前記非極性層を、ステップ４）で収集する、請求項１に記載の方法。
  14. ｉ）前記非極性層の蒸発生成物を得るステップと、
    ｉｉ）前記非極性層の蒸発生成物をクロロホルムと混合するステップと、
    ｉｉｉ）ステップｉｉ）の混合物を遠心分離し、上層を収集するステップと、
    ｉｖ）蒸発によって前記微生物代謝産物を得るステップと
    によって、前記非極性層から１つ以上の微生物代謝産物を精製することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記方法は、非極性の増加した溶媒を用いる複数の精製サイクルを含む、１つ以上の微生物代謝産物のそれぞれを前記水層から精製することをさらに含み、
    各サイクルは、
    ｉ）前記水層の蒸発生成物を得るステップと、
    ｉｉ）前記水層の蒸発生成物を溶媒と混合するステップと、
    ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの混合物を遠心分離し、前記溶媒層を収集するステップと、
    ｉｖ）前記溶媒を蒸発させることによって微生物代謝産物を得るステップと
    を含み、
    各サイクルは、前のサイクルで使用された溶媒よりも非極性である異なる溶媒を使用する、請求項１０に記載の方法。
  16. 前記複数の精製サイクルにおける前記溶媒は、メタノール、エタノール、１－プロパノール、１－ブタノール、１－ヘキサノール、１－ヘプタノール、２－プロパノール、２－ブタノール、アセトン、及びクロロホルムの順で使用される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記方法は、極性の増加した溶媒を使用する複数の精製サイクルを含む、前記１つ以上の微生物代謝産物のそれぞれを前記非極性層から精製することをさらに含み、
    各サイクルは、
    ｉ）前記非極性層の蒸発生成物を得るステップと、
    ｉｉ）前記非極性層の蒸発生成物を溶媒と混合するステップと、
    ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの混合物を遠心分離し、前記溶媒層を収集するステップと、
    ｉｖ）前記溶媒を蒸発させることによって前記微生物代謝産物を得るステップと
    を含み、
    各サイクルは、前のサイクルで使用された溶媒よりも極性が高い異なる溶媒を使用する、請求項１３に記載の方法。
  18. 前記複数の精製サイクルにおける溶媒は、クロロホルム、アセトン、２－ブタノール、２－プロパノール、１－ヘプタノール、１－ヘキサノール、１－ブタノール、１－プロパノール、エタノール、及びメタノールの順で使用される、請求項１７に記載の方法。
  19. 請求項１に記載の方法によって生成された組成物であって、少なくとも９５％の純度を有する精製ＳＬＰと５０％未満の割合の水とを含む、組成物。
  20. 水の割合は、２０％～３０％である、請求項１９に記載の組成物。
  21. 精製親水性ＳＬＰを含む、請求項１９に記載の組成物。
  22. 家庭用又は工業用洗浄組成物又は洗剤中の活性成分及び／又はアジュバントとして使用される、請求項１９に記載の組成物。
  23. 化粧品組成物中の活性成分及び／又はアジュバントとして使用される、請求項１９に記載の組成物。
  24. 農業用組成物中の活性成分及び／又はアジュバントとして使用される、請求項１９に記載の組成物。
  25. 油井処理流体中の活性成分及び／又はアジュバントとして使用される、請求項１９に記載の組成物。
  26. 動物及び／又はヒトのための健康増進、栄養及び／又は治療用組成物中の活性成分及び／又はアジュバントとして使用される、請求項１９に記載の組成物。
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