CN104178538A - 一种选择性生产槐糖脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种选择性生产槐糖脂的方法，步骤：(1)取拟威克酵母(CGMCC NO.3798)接种于培养基上，活化培养24～48小时，得活化的拟威克酵母；(2)将活化的拟威克酵母接种于种子培养基中，100～200r/min培养20～28h，得拟威克酵母种子液；(3)按照体积比4～6％的接种量，将拟威克酵母种子液接种到不同发酵培养基中，160r/min培养144～168小时，得发酵液，发酵液经分离、纯化，即得内酯型或酸型槐糖脂。本发明能有效的人工控制选择性生产内酯型槐糖脂或酸型槐糖脂，大大简化分离工艺，降低分离成本。
Description
技术领域
本发明涉及槐糖脂的生产领域，具体地说是通过控制发酵培养基中金属离子的种类生产不同类型槐糖脂的方法。
背景技术
槐糖脂是一类由酵母菌产生的糖脂类生物表面活性剂，是所有生物表面活性剂中产量最高的一种。槐糖脂本身无毒、无嗅、无味，对人体皮肤无刺激作用，并且能够在自然界完全、快速地被微生物降解掉，不会对环境造成污染和破坏。因而与化学合成的表面活性剂相比，具有良好的生物相容性、可降解性、环境友好等许多优点，可以替代化学表面活性剂应用在石油开采、土壤修复、生物冶金、化妆品、食品、医药等许多领域。
发酵结束后，发酵液中的槐糖脂是内酯型和酸型的混合物。内酯型和酸型二者结构的不同造成了生物学活性和理化特性的不同。内酯型槐糖脂溶解度小，以结晶或油状形式存在，易于分离，抗菌、抗肿瘤、抗炎症反应效果好；而酸型溶解度大，发泡和乳化性能好。这些特性决定了二者的应用领域不同，如果能够人工控制选择性生产槐糖脂的类型，将会大大简化分离工艺，降低分离成本。
近年来，对槐糖脂生产方法的研究已有许多文献报道，比如采用不同的碳源、氮源、控制不同pH等，总槐糖脂的产量都大大提高。中国专利文献CN101886047A(申请号：201010191707.7)公开了一株拟威克酵母菌株，能够产生槐糖脂，但是产量有限，不能满足市场要求。
目前，通过控制发酵培养基中金属离子的种类选择性生产槐糖脂研究和开发未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种选择性生产槐糖脂的方法。
本发明的技术方案如下：
一种选择性生产槐糖脂的方法，步骤如下：
(1)取拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y2A CGMCC NO.3798)接种于培养基上，28～32℃活化培养24～48小时，得活化的拟威克酵母；
(2)将步骤(1)制得的活化的拟威克酵母接种于种子培养基中，28～32℃、100～200r/min培养20～28h，得拟威克酵母种子液；
(3)按照体积比4～6％的接种量，将步骤(2)制得的拟威克酵母种子液接种到发酵培养基中，28～32℃、160r/min培养144～168小时，得发酵液，发酵液经分离、纯化，即得槐糖脂；
当所述的发酵培养基为发酵培养基A时，得内酯型槐糖脂；发酵培养基A的组分如下：葡萄糖75～85g/L，油酸60～80mL/L，硫酸铵3～5g/L，KH2PO40.8～1.2g/L，Na2HPO4·12H2O0.8～1.2g/L，酵母粉1.5～3.5g/L，MgSO4·7H2O0.4～0.6g/L，pH5.5～6.5，水定容；
当所述的发酵培养基为发酵培养基B时，得酸型槐糖脂；发酵培养基B的组分如下：葡萄糖75～85g/L，油酸60～80mL/L，硫酸铵3～5g/L，KH2PO40.8～1.2g/L，Na2HPO4·12H2O0.8～1.2g/L，酵母粉1.5～3.5g/L，FeSO4·7H2O0.04～0.06g/L，pH5.5～6.5，水定容。
根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的培养基为斜面培养基，组分如下：葡萄糖18～22g/L，酵母粉8～12g/L，蛋白胨18～22g/L，琼脂粉18～22g/L，蒸馏水定容。
根据本发明，优选的，步骤(2)中所述的种子培养基组分如下：葡萄糖18～22g/L，酵母粉8～12g/L，蛋白胨18～22g/L，蒸馏水定容。
根据本发明，优选的，步骤(3)中当所述的发酵培养基为发酵培养基A时，所述分离纯化步骤为：5000r/min转速离心分离10分钟，沉淀，向沉淀中加入0.5倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取，萃取液40℃减压干燥；
当所述的发酵培养基为发酵培养基B时，所述分离纯化步骤为：5000r/min转速离心分离10分钟，弃沉淀，向上清液中加入0.5倍发酵液体积的乙醇萃取，萃取液40℃减压干燥；
根据本发明，优选的，步骤(3)中发酵培养基A的组分如下：
葡萄糖80g/L，油酸60mL/L，硫酸铵5g/L，KH2PO41g/L，Na2HPO4·12H2O1g/L，酵母粉3g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH6，水定容；
优选的，步骤(3)中发酵培养基B的组分如下：
葡萄糖80g/L，油酸60mL/L，硫酸铵5g/L，KH2PO41g/L，Na2HPO4·12H2O1g/L，酵母粉3g/L，FeSO4·7H2O0.05g/L，pH6，水定容。
本发明是通过控制发酵培养基中金属离子的种类，使得发酵结束后发酵液中酸型槐糖脂或者内酯型槐糖脂占绝对优势。具体地说就是在发酵基本培养基中添加Fe2+生产酸型槐糖脂，添加Mg2+生产内酯型槐糖脂。
本发明的有益效果：
1、本发明能有效的人工控制选择性生产内酯型槐糖脂或酸型槐糖脂，大大简化分离工艺，降低分离成本。
2、本发明操作简单、易于控制。
附图说明
图1为本发明实施例1-2发酵结束后发酵液的状态图。
其中，A：内酯型槐糖脂发酵液；B：酸型槐糖脂发酵液。
图2为本发明实施例1-2发酵液中内酯型槐糖脂和酸型槐糖脂的含量。
(□总槐糖脂；■内酯型槐糖脂，■酸型槐糖脂)
A：内酯型槐糖脂发酵液；B：酸型槐糖脂发酵液
具体实施方式
下面通过实施例对本发明内容作进一步的说明，但不限于此。
实施例1、内酯型槐糖脂的生产，步骤如下：
(1)取拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y2A CGMCC NO.3798)，在斜面培养基上30℃培养24小时，得活化的拟威克酵母；
所述斜面培养基组分如下：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉20g/L，蒸馏水定容；
(2)将步骤(1)制得的活化拟威克酵母接种于300mL三角瓶装50mL种子培养基，30℃，摇床160r/min振荡培养24h，得拟威克酵母种子液；
所述种子培养基组分如下：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，蒸馏水定容；
(3)按照体积比5％的接种量，将步骤(2)制得的拟威克酵母种子液接种到发酵培养基A中，30℃、160r/min培养168小时，得发酵液，发酵液5000r/min离心10分钟、沉淀、向沉淀中加入0.5倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取，萃取液40℃减压干燥，即得内酯型槐糖脂；
所述的发酵培养基A组分如下：葡萄糖80g/L，油酸60mL/L，硫酸铵5g/L，KH2PO41g/L，Na2HPO4·12H2O1g/L，酵母粉3g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH6.0，水定容；
实施例2、酸型槐糖脂的生产，步骤如下：
(1)取拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y2A CGMCC NO.3798)，在斜面培养基上30℃培养24小时，得活化的拟威克酵母；
所述斜面培养基组分如下：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉20g/L，蒸馏水定容；
(2)将步骤(1)制得的活化拟威克酵母接种于300mL三角瓶装50mL种子培养基，30℃，摇床160r/min振荡培养24h，得拟威克酵母种子液；
所述种子培养基组分如下：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，蒸馏水定容；
(3)按照体积比5％的接种量，将步骤(2)制得的拟威克酵母种子液接种到发酵培养基B中，30℃、160r/min培养168小时，得发酵液；发酵液5000r/min离心10分钟、弃沉淀、上清液用0.5倍发酵液体积的乙醇萃取，萃取液40℃减压干燥，即得酸型槐糖脂；
所述的发酵培养基B组分如下：葡萄糖80g/L，油酸60mL/L，硫酸铵5g/L，KH2PO41g/L，Na2HPO4·12H2O1g/L，酵母粉3g/L，FeSO4·7H2O0.05g/L，pH6.0，水定容。
实施例3、内酯型槐糖脂的生产，步骤如下：
(1)取拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y2A CGMCC NO.3798)，在斜面培养基上28℃培养48小时，得活化的拟威克酵母；
所述斜面培养基组分如下：葡萄糖18g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨18g/L，琼脂粉18g/L，蒸馏水定容；
(2)将步骤(1)制得的活化拟威克酵母接种于300mL三角瓶装50mL种子培养基，28℃，摇床100r/min振荡培养20h，得拟威克酵母种子液；
所述种子培养基组分如下：葡萄糖18g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨18g/L，蒸馏水定容；
(3)按照体积比4％的接种量，将步骤(2)制得的拟威克酵母种子液接种到发酵培养基A中，28℃、160r/min培养168小时，得发酵液；发酵液5000r/min离心10分钟、沉淀、向沉淀中加入0.5倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取，萃取液40℃减压干燥，即得内酯型槐糖脂；
所述的发酵培养基A组分如下：葡萄糖75g/L，油酸60mL/L，硫酸铵3g/L，KH2PO40.8g/L，Na2HPO4·12H2O0.8g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，pH5.5，水定容。
实施例4、酸型槐糖脂的生产，步骤如下：
(1)取拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y2A CGMCC NO.3798)，在斜面培养基上32℃培养24小时，得活化的拟威克酵母；
所述斜面培养基组分如下：葡萄糖22g/L，酵母粉12g/L，蛋白胨22g/L，琼脂粉22g/L，蒸馏水定容；
(2)将步骤(1)制得的活化拟威克酵母接种于300mL三角瓶装50mL种子培养基，32℃，摇床200r/min振荡培养28h，得拟威克酵母种子液；
所述种子培养基组分如下：葡萄糖22g/L，酵母粉12g/L，蛋白胨22g/L，蒸馏水定容；
(3)按照体积比6％的接种量，将步骤(2)制得的拟威克酵母种子液接种到发酵培养基B中，32℃、160r/min培养144小时，得发酵液；发酵液5000r/min离心10分钟、弃沉淀、上清液用0.5倍发酵液体积的乙醇萃取，萃取液40℃减压干燥，即得酸型槐糖脂；
所述的发酵培养基B组分如下：葡萄糖85g/L，油酸80mL/L，硫酸铵5g/L，KH2PO41.2g/L，Na2HPO4·12H2O1.2g/L，酵母粉3.5g/L，FeSO4·7H2O0.06g/L，pH6.5，水定容。
Claims (7)
1.一种选择性生产槐糖脂的方法，步骤如下：
(1)取拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y2A CGMCC NO.3798)接种于培养基上，28～32℃活化培养24～48小时，得活化的拟威克酵母；
(2)将步骤(1)制得的活化的拟威克酵母接种于种子培养基中，28～32℃、100～200r/min培养20～28h，得拟威克酵母种子液；
(3)按照体积比4～6％的接种量，将步骤(2)制得的拟威克酵母种子液接种到发酵培养基中，28～32℃、160r/min培养144～168小时，得发酵液，发酵液经分离、纯化，即得槐糖脂；
当所述的发酵培养基为发酵培养基A时，得内酯型槐糖脂；发酵培养基A的组分如下：葡萄糖75～85g/L，油酸60～80mL/L，硫酸铵3～5g/L，KH2PO40.8～1.2g/L，Na2HPO4·12H2O0.8～1.2g/L，酵母粉1.5～3.5g/L，MgSO4·7H2O0.4～0.6g/L，pH5.5～6.5，水定容；
当所述的发酵培养基为发酵培养基B时，得酸型槐糖脂；发酵培养基B的组分如下：葡萄糖75～85g/L，油酸60～80mL/L，硫酸铵3～5g/L，KH2PO40.8～1.2g/L，Na2HPO4·12H2O0.8～1.2g/L，酵母粉1.5～3.5g/L，FeSO4·7H2O0.04～0.06g/L，pH5.5～6.5，水定容。
2.根据权利要求1所述的选择性生产槐糖脂的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的培养基为斜面培养基，组分如下：葡萄糖18～22g/L，酵母粉8～12g/L，蛋白胨18～22g/L，琼脂粉18～22g/L，蒸馏水定容。
3.根据权利要求1所述的选择性生产槐糖脂的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的种子培养基组分如下：葡萄糖18～22g/L，酵母粉8～12g/L，蛋白胨18～22g/L，蒸馏水定容。
4.根据权利要求1所述的选择性生产槐糖脂的方法，其特征在于，步骤(3)中当所述的发酵培养基为发酵培养基A时，所述分离纯化步骤为：5000r/min转速离心分离10分钟，沉淀，向沉淀中加入0.5倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取，萃取液40℃减压干燥。
5.根据权利要求1所述的选择性生产槐糖脂的方法，其特征在于，步骤(3)中当所述的发酵培养基为发酵培养基B时，所述分离纯化步骤为：5000r/min转速离心分离10分钟，弃沉淀，向上清液中加入0.5倍发酵液体积的乙醇萃取，萃取液40℃减压干燥。
6.根据权利要求1所述的选择性生产槐糖脂的方法，其特征在于，步骤(3)中发酵培养基A的组分如下：
葡萄糖80g/L，油酸60mL/L，硫酸铵5g/L，KH2PO41g/L，Na2HPO4·12H2O1g/L，酵母粉3g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH6，水定容。
7.根据权利要求1所述的选择性生产槐糖脂的方法，其特征在于，步骤(3)中发酵培养基B的组分如下：
葡萄糖80g/L，油酸60mL/L，硫酸铵5g/L，KH2PO41g/L，Na2HPO4·12H2O1g/L，酵母粉3g/L，FeSO4·7H2O0.05g/L，pH6，水定容。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141203 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |