CN106399181A - 布氏乳杆菌8‑2n及在制备苯乳酸中的应用 - Google Patents

布氏乳杆菌8‑2n及在制备苯乳酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种布氏乳杆菌8‑2N及在制备苯乳酸中的应用，以本发明提供的菌种为出发菌株，通过微生物发酵方法可以代谢合成苯乳酸；进而以发酵所得该菌株的菌体细胞为全细胞催化剂，以苯丙酮酸为关键底物，经微生物转化方法可以转化合成苯乳酸。本发明提供的菌株分离自传统泡菜，不仅生物安全性好，还具有很好的合成转化和产苯乳酸的能力，在常规MRS发酵培养液中生长较快，发酵周期适中；而其菌体细胞用于转化合成苯乳酸时，转化反应时间短，转化率高，转化液中苯乳酸浓度可达9g/L以上，转化率可达80～90％，具有较好的应用前景。

Description

布氏乳杆菌8-2N及在制备苯乳酸中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种苯乳酸的制备，特别涉及一株新菌株--布氏乳杆菌8-2N及在制备苯乳酸中的应用。
(二)背景技术
利用微生物发酵或转化合成制备化学品或生物化学品，通常具有制备条件温和、环境友好和合成路径较简便等优点，是近几年化工和生物领域的重要发展方向。
苯乳酸是一种具有广谱抗菌性的新型抑菌剂，可用于食品和药品的保藏；苯乳酸也是合成高分子材料的重要单体，还是合成抗血小板凝聚和心肌梗塞等药物的关键前体，因此，在食品工程、制药工程、化工和材料等许多领域有重要的应用前景。微生物法合成苯乳酸可以克服化学合成法中存在的诸如需要使用高毒溶剂、合成过程存在环境污染及产物中溶剂残留等局限性，是制备苯乳酸的新途径。
已报道的不少微生物菌株如植物乳杆菌、芽孢杆菌、干酪乳杆菌、白地霉菌、丙酸短棒菌、米根霉菌、荧光威克酵母菌以及基因工程菌等，都可以代谢合成苯乳酸。部分菌株以苯丙酮酸为前体底物，可转化合成苯乳酸。但是，现有的一些菌株在特定条件下存在潜在的生物安全性问题，而一些菌株在底物或产物浓度较低时就表现出明显的抑制，使苯乳酸转化产率低，浓度低，难以达到工业化生产要求。因此，需要探索既安全又具有很好合成转化能力的产苯乳酸新菌株。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株用于微生物合成和转化制备苯乳酸的布氏乳杆菌株，该菌株既有很好的生物安全性，又有很好的苯乳酸合成能力。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)8-2N，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 2015715，保藏时间：2015年11月30日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述布氏乳杆菌8-2N在制备苯乳酸中的应用，具体所述应用是将布氏乳杆菌8-2N经发酵培养获得的发酵液离心，获得上清液和菌体细胞，以菌体细胞为催化剂，以苯丙酮酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，于pH 8.0、100mM磷酸盐缓冲液中构成反应体系，在35～45℃条件下进行转化反应，反应完全后，获得转化反应液，分别将上清液和转化反应液分离纯化，获得所述苯乳酸。
进一步，所述反应体系中，菌体细胞用量为90～100g/L，所述苯丙酮酸加入量为10g/L，葡萄糖加入量为10-20g/L，优选17g/L。
进一步，所述转化反应时间为3-6h。
进一步，所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将布氏乳杆菌8-2N接种至斜面培养基，在25～35℃培养1～2d，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，无水乙酸钠5g/L，硫酸锰0.25g/L，硫酸镁0.58g/L，磷酸氢二钾2g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，吐温85g/L，琼脂23g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在20～35℃培养12～24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，无水乙酸钠5g/L，硫酸锰0.25g/L，硫酸镁0.58g/L，磷酸氢二钾2g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，吐温85g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1-5％的接种量接种至发酵培养基，在20-35℃培养36-72h，将发酵液离心，收集湿菌细胞；所述发酵液培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，无水乙酸钠5g/L，硫酸锰0.25g/L，硫酸镁0.58g/L，磷酸氢二钾2g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，吐温85g/L，琼脂23g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
本发明所述上清液或转化反应液的分离纯化方法为公知方法，如离子交换层析分离。
通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的菌株既有很好的生物安全性，又有很好的合成转化和产苯乳酸的能力。本发明的菌株分离自传统的发酵食品泡菜，生物安全性好；同时，本发明的菌株在常规MRS发酵培养液中可以很好的生长，其发酵周期适中；而其菌体细胞用于转化合成苯乳酸时，转化反应迅速，转化率高，在优化转化条件下，转化率可达80～90％。
(2)本发明提供的菌株，可以在发酵过程代谢合成苯乳酸；其菌体分离后作为全细胞催化剂，进一步可以将苯丙酮酸前体转化合成为苯乳酸；最大限度地发挥利用了菌株的发酵和转化能力，发酵液中苯乳酸浓度可达0.01～0.02g/L，转化液中苯乳酸浓度可达9g/L以上，有较好的应用前景。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1、菌株筛选
本发明从中国传统泡菜中进行菌株分离筛选，将一定量泡菜汁液于无菌水中稀释，在含有碳酸钙的固体培养基(组成：葡萄糖20g，蛋白胨10g，柠檬酸氢二胺2g，无水乙酸钠5g，硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2g，酵母膏5g，牛肉膏10g，吐温85g，琼脂23g，碳酸钙34g，去离子水1L，pH值自然)上进行初筛，温度30℃，静置培养，时间24～72h；选取过氧化氢阴性的单一菌落，接种于液体培养基(组成：葡萄糖20g，蛋白胨10g，柠檬酸氢二胺2g，无水乙酸钠5g，硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2g，酵母膏5g，牛肉膏10g，吐温85g，琼脂23g，去离子水1L，pH值自然)中，30℃静置培养24h；复筛多次，得到一株用于微生物合成和转化制备苯乳酸的布氏乳杆菌株8-2N。
2、菌株鉴定
菌株8-2N生理生化特征：菌株8-2N为革兰氏阳性、短杆、无芽孢、过氧化氢酶阴性、非严格厌氧、化能异养。
菌株8-2N的16S rDNA序列为SEQ ID NO.1所示。
结合菌株生理生化特征及16S rDNA序列，与GreenGenes16S rRNA基因数据库进行比对，将菌株8-2N鉴定为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，命名为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)8-2N，已于2015年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 2015715。
实施例2
(1)斜面培养：将布氏乳杆菌8-2N接种至斜面培养基，在25℃培养2d，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，柠檬酸氢二胺2g，无水乙酸钠5g，硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2g，酵母膏5g，牛肉膏10g，吐温85g，琼脂23g，去离子水1L，pH值自然。
(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在20℃培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，柠檬酸氢二胺2g，无水乙酸钠5g，硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2g，酵母膏5g，牛肉膏10g，吐温85g，去离子水1L，pH值自然。
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至约1L发酵培养基，在20℃培养72h，将发酵液离心，获得1L上清液和3g湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，柠檬酸氢二胺2g，无水乙酸钠5g，硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2g，酵母膏5g，牛肉膏10g，吐温85g，去离子水1L，pH值自然。
实施例3
(1)斜面培养：将布氏乳杆菌8-2N接种至斜面培养基，在35℃培养1d，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，柠檬酸氢二胺2g，无水乙酸钠5g，硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2g，酵母膏5g，牛肉膏10g，吐温85g，琼脂23g，去离子水1L，pH值自然。
(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在35℃培养12h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，柠檬酸氢二胺2g，无水乙酸钠5g，硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2g，酵母膏5g，牛肉膏10g，吐温85g，去离子水1L，pH值自然。
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至约0.5L发酵培养基，在35℃培养36h，将发酵液离心，获得0.5L上清液和1.6g湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，柠檬酸氢二胺2g，无水乙酸钠5g，硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2g，酵母膏5g，牛肉膏10g，吐温85g，去离子水1L，pH值自然。
实施例4
取实施例2所得湿菌体0.9g，做为全细胞催化剂，取含0.17g葡萄糖和0.1g苯丙酮酸的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH 8.0)为底物构成反应体系10mL，转化3小时，温度45℃，除去菌体，得到含有苯乳酸的生物转化液；
用高效液相色谱对实施例2所得上清液和含有苯乳酸的生物转化液进行检测。检测分析条件为：Agilent 1260infinity液相色谱系统，DAD二极管阵列检测器(G1315D)，Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，预柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6mm×12.5mm，5μm)；流动相A：水+0.05％三氟乙酸，流动相B：甲醇+0.05％三氟乙酸(B)；梯度洗脱：0～20min时候B由10％线性递增为100％，20～23min保持100％，23～25min线性下降为10％；流动相流量1mL/min，检测波长210nm，柱温30℃。所得上清液相中苯乳酸含量约0.01g/L；所得转化液中苯乳酸含量9.1g/L，转化收率80％。
实施例5
取实施例3所得湿菌体0.5g，做为全细胞催化剂，取含0.09g葡萄糖和0.05g苯丙酮酸的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH 8.0)为底物构成反应体系5mL，转化6小时，温度35℃，除去菌体，得到含有苯乳酸的生物转化液；
用高效液相色谱对所述上清液和含有苯乳酸的生物转化液进行检测。所得发酵液液相中苯乳酸含量约0.02g/L；所得转化液中苯乳酸含量9.2g/L，转化收率90％。

Claims (6)

1.布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)8-2N，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 2015715，保藏时间：2015年11月30日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述布氏乳杆菌8-2N在制备苯乳酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用是将布氏乳杆菌8-2N经发酵培养获得的发酵液离心，获得上清液和菌体细胞，以菌体细胞为催化剂，以苯丙酮酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，于pH 8.0、100mM磷酸盐缓冲液中构成反应体系，在35～45℃条件下进行转化反应，反应完全后，获得转化反应液，分别将上清液和转化反应液分离纯化，获得所述苯乳酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应体系中，湿菌体用量为90～100g/L，所述苯丙酮酸加入量为10g/L，葡萄糖加入量为10～20g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化反应时间为3-6h。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将布氏乳杆菌8-2N接种至斜面培养基，在25～35℃培养1～2d，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，无水乙酸钠5g/L，硫酸锰0.25g/L，硫酸镁0.58g/L，磷酸氢二钾2g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，吐温85g/L，琼脂23g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在20～35℃培养12～24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，无水乙酸钠5g/L，硫酸锰0.25g/L，硫酸镁0.58g/L，磷酸氢二钾2g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，吐温85g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1-5％的接种量接种至发酵培养基，在20-35℃培养36-72h，将发酵液离心，收集湿菌细胞；所述发酵液培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，无水乙酸钠5g/L，硫酸锰0.25g/L，硫酸镁0.58g/L，磷酸氢二钾2g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，吐温85g/L，琼脂23g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
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