TWI691599B - ３’-羥基染料木黃酮之製備方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種3’-羥基染料木黃酮之製備方法，包含下列步驟。構築一基因重組微生物，其表達酪胺酸酶。進行一反應基質配製步驟，所述反應基質包含硼酸鹽、抗壞血酸和染料木黃酮。接著於反應基質中接種所述基因重組微生物進行一生物轉換反應步驟，以獲得一生物轉換物質。再於生物轉換物質中加入鹽酸溶液進行一終止反應步驟，以獲得一反應液，其中反應液包含3’-羥基染料木黃酮。藉此，本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法可以大量製備高純度的3’-羥基染料木黃酮。

Description

3’-羥基染料木黃酮之製備方法

本發明係關於一種含氧有機化合物之製備方法，特別是指一種3’-羥基染料木黃酮之製備方法。

染料木黃酮為大豆異黃酮的一種主要活性因子，具有多種生理功能。染料木黃酮在結構上與哺乳動物的雌激素-雌二醇相似，具有雌激素的活性基團-二酚羥基，因此染料木黃酮具有類雌激素活性等多種生理活性，例如可以預防骨質疏鬆、改善更年期綜合症、預防癌症(例如乳腺癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌和皮膚癌)、預防阿茲海默症、延緩衰老作用、改善經期不適、降低膽固醇和調節血脂。

3’-羥基染料木黃酮為染料木黃酮的衍生物，異黃酮結構上的改變常會造成化合物的生物活性具有顯著變化。例如染料木黃酮(genistein)在30μM~60μM濃度時會促進黑色素細胞加速生成黑色素，然而經過生物轉換後之3’-羥基染料木黃酮卻具有低劑量、高效能之皮膚美白效果，與其生物轉換之前驅物具有相反之特性。另有研究指出，3’-羥基染料木黃酮具有抑制T47D致瘤性乳腺上皮細胞 生長的活性，以及抑制HIV-1整合酶(HIV-1 integrase)、抗發炎和保肝等活性。

然而，3’-羥基染料木黃酮的低生產率仍是阻礙其運用於保健食品或醫藥產品的主要因素。目前雖有方法可以用以製備得到3’-羥基染料木黃酮，但其產量仍然有限，且所製備而得的3’-羥基染料木黃酮的純度不高。因此如何開拓出更佳方法以提高3’-羥基染料木黃酮的產量和純度，遂成為目前相關產業的發展方向。

本發明之一態樣是在提供一種3’-羥基染料木黃酮之製備方法，包含以下步驟。構築一基因重組微生物，係將一環狀重組質體轉形至一微生物表達系統中，以得到基因重組微生物，其中所述環狀重組質體包含如序列辨識編號1所示之酪胺酸酶(tyrosinase)基因。進行一反應基質配製步驟，其中所述反應基質包含最終濃度為400mM至600mM的硼酸鹽、最終濃度為10mM至40mM的抗壞血酸以及最終濃度為500ppm至2000ppm的染料木黃酮。進行一生物轉換反應步驟，係於反應基質中接種基因重組微生物，並於一生物轉換反應溫度和一生物轉換反應通氣量下以一生物轉換反應攪拌速度培養一生物轉換反應時間，以獲得一生物轉換物質。再進行一終止反應步驟，係於生物轉換物質中加入一鹽酸溶液，並於一終止反應溫度和一終止通氣量下 以一終止攪拌速度反應一終止反應時間，以獲得一反應液，其中所述反應液包含3’-羥基染料木黃酮。

依據前述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中所述微生物表達系統可為大腸桿菌(Escherichia coli)。

依據前述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中反應基質配製步驟可包含以下步驟。將染料木黃酮溶於二甲基亞碸，以得到一染料木黃酮溶液。將抗壞血酸溶於水，以得到一抗壞血酸溶液。將硼酸鹽溶於一熱水後，調整pH值達pH 8至pH 10，以得到一硼酸鹽溶液。再將染料木黃酮溶液和抗壞血酸溶液加入硼酸鹽溶液中，以得到所述反應基質。

依據前述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中生物轉換反應溫度可為40℃至60℃。生物轉換反應通氣量可為2L/min至5L/min，且生物轉換反應攪拌速度可為250rpm至350rpm。生物轉換反應時間可為60分鐘至90分鐘。

依據前述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中鹽酸溶液的最終濃度可為100mM至200mM。

依據前述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中終止反應溫度可為40℃至60℃。終止反應通氣量可為2L/min至5L/min，且終止反應攪拌速度可為250rpm至350rpm。終止反應時間可為5分鐘至15分鐘。

依據前述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，可更包含一萃取步驟，係於所述反應液中加入乙酸乙酯，並以一震盪轉速重複震盪一震盪時間3次。

依據前述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中反應液與乙酸乙酯的體積比可為1：1至1.5：1。

依據前述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中震盪轉速可為200rpm至300rpm，且每次震盪時間可為2分鐘至20分鐘。

藉此，本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，以基因工程微生物進行3’-羥基染料木黃酮的轉換，其製備方法可進行大規模工業化的生產，因可控制起始產物、生物轉換反應條件等生產製程，使所生產的3’-羥基染料木黃酮品質穩定且純度高，故可解決3’-羥基染料木黃酮低生產率的問題。

100‧‧‧3’-羥基染料木黃酮之製備方法

110、120、130、140‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示本發明一實施方式之3’-羥基染料木黃酮之製備方法之步驟流程圖；第2圖繪示本發明之基因重組微生物之菌粉量產統計圖；第3圖繪示以本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法所製得的3’-羥基染料木黃酮配製液態原料的產量統計圖； 第4圖繪示含有10%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料穩定性的分析結果圖；以及第5圖繪示含有20%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料穩定性的分析結果圖。

[3’-羥基染料木黃酮之製備方法]

請參照第1圖，其係依照本發明一實施方式之3’-羥基染料木黃酮之製備方法100的步驟流程圖。第1圖中，3’-羥基染料木黃酮之製備方法100包含步驟110、步驟120、步驟130與步驟140。

步驟110為構築一基因重組微生物，係將一環狀重組質體轉形至一微生物表達系統中，以得到基因重組微生物，其中所述環狀重組質體包含如序列辨識編號1所示之酪胺酸酶(tyrosinase)基因。較佳地，所述微生物表達系統可為大腸桿菌(Escherichia coli)。

步驟120為進行一反應基質配製步驟，其中所述反應基質包含最終濃度為400mM至600mM的硼酸鹽、最終濃度為10mM至40mM的抗壞血酸以及最終濃度為500ppm至2000ppm的染料木黃酮。較佳地，反應基質配製步驟可包含以下步驟。將染料木黃酮溶於二甲基亞碸，以得到一染料木黃酮溶液。將抗壞血酸溶於水，以得到一抗壞血酸溶液。將硼酸鹽溶於一熱水後，調整pH值達pH 8至pH 10，以得到一硼酸鹽溶液。再將染料木黃酮溶液和抗壞血酸溶液加入硼酸鹽溶液中，以得到所述反應基質。

步驟130為進行一生物轉換反應步驟，係於反應基質中接種基因重組微生物，並於一生物轉換反應溫度和一生物轉換反應通氣量下以一生物轉換反應攪拌速度培養一生物轉換反應時間，以獲得一生物轉換物質。較佳地，生物轉換反應溫度可為40℃至60℃。生物轉換反應通氣量可為2L/min至5L/min，且生物轉換反應攪拌速度可為250rpm至350rpm。生物轉換反應時間可為60分鐘至90分鐘。

步驟140為進行一終止反應步驟，係於生物轉換物質中加入一鹽酸溶液，並於一終止反應溫度和一終止通氣量下以一終止攪拌速度反應一終止反應時間，以獲得一反應液，其中所述反應液包含3’-羥基染料木黃酮。較佳地，鹽酸溶液的最終濃度可為100mM至200mM。終止反應溫度可為40℃至60℃。終止反應通氣量可為2L/min至5L/min，且終止反應攪拌速度可為250rpm至350rpm。終止反應時間可為5分鐘至15分鐘。

此外，3’-羥基染料木黃酮之製備方法100可更包含一萃取步驟，係於所述反應液中加入乙酸乙酯，並以一震盪轉速重複震盪一震盪時間3次。較佳地，反應液與乙酸乙酯的體積比可為1：1至1.5：1。震盪轉速可為200rpm至300rpm，且每次震盪時間可為2分鐘至20分鐘。

茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀 的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。

[試驗例] 一、構築基因重組微生物

於本試驗例中，先構築環狀重組質體。所使用的表達載體為pETDuet-1^TM載體(購自Novagen)，而內插子(insert)為如序列辨識編號1所示之酪胺酸酶(tyrosinase)基因，其係源自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)之基因體。試驗上利用如序列辨識編號2所示的正向引子和如序列辨識編號3所示的反向引子對巨大芽孢桿菌BCRC 10608菌株(購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心)進行基因擴增，其中正向引子設計有限制酶NcoI辨認位置(NcoI：CCATGG)序列，以及反向引子設計有限制酶SacI辨認位置(SacI：GAGCTC)序列。將擴增出的酪胺酸酶基因進行定序，並將內插子片段選殖(clone)至經NcoI/SacI截切後的pETDuet-1^TM載體，得到構築完成之環狀重組質體pETDuet-BmTYR。再將環狀重組質體pETDuet-BmTYR至大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株(購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心)，以形成基因重組微生物。轉形的方式可以包含但不限定以氯化鈣處理等化學方式或電穿孔等物理方式進行。

二、製備3’-羥基染料木黃酮 2.1.製備基因微生物菌粉

將前述構築完成的基因重組微生物活化後，各挑一單一菌落分別培養於兩瓶100mL的LB培養基(含有100μg/mL氨苄青黴素)中，以37℃和180rpm的條件培養至隔天。將兩瓶共200mL的種菌加入含有5L的LB培養基(含有100μg/mL氨苄青黴素)的發酵槽中，以30-40℃、100-200rpm和2-5L/min通氣量的條件進行培養。待細菌密度生長至光密度值(OD₆₀₀)達0.6至1時，加入5mL的0.1mM IPTG，並持續以18℃和180rpm的條件培養24小時，以誘發酪胺酸酶基因表現。收集發酵液並分別倒入四個離心瓶，以離心力4500rpm於4℃下離心15分鐘後，去除上清液，再倒入剩餘發酵液，並將前次沉澱菌體沖散，再以離心力4500rpm於4℃下離心15分鐘，反覆至發酵液全數離心完畢。以少量PBS沖散沉澱菌體，再補滿PBS，以離心力4500rpm於4℃下離心15分鐘，去除上清液後。再加入少量PBS沖散沉澱菌體，集中成兩瓶離心瓶，再補滿PBS，以離心力4500rpm於4℃下離心15分鐘，去除上清液以得到沉澱的細胞團塊。最後各以150mL沖散沉澱的細胞團塊，分裝50mL離心管，斜放冰至-80℃冰箱，隔天進行凍乾。凍乾約4至5天，確定完成後，秤其重量並扣除空管重，得到菌粉乾重。

請參照第2圖和下表一，為本發明之基因重組微生物之菌粉量產統計圖，其為依據前述步驟量產本發明之基因重組微生物之菌粉5次的統計結果。第2圖和表一的結果 顯示，以前述方法所製備的菌粉，每次的產量皆可達12克以上，所得到的基因重組微生物之菌粉將後續用以進行生物轉換反應。此外，若欲測試菌粉的酪胺酸酶活性，可以取10mg的菌粉，以1mL PBS回溶，並稀釋十倍，得1mg/mL的菌液。取100μL的1mg/mL菌液，加入900μL的2.5mM L-Dopa(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)，搖兩下均勻後，以紫外線-可見光分光光度計於波長470nm偵測個反應中多巴色素(dopachrome)生成的情況，再將所獲得之數據回乘以10，等於每1mg的菌粉反應5分鐘含有的酪胺酸酶活性。由表一的結果顯示，以前述方法所製備的菌粉，每次所產的菌粉其酪胺酸酶活性皆可達5.0以上，可進一步用以轉換為3’-羥基染料木黃酮。

2.2.實施例

製備3’-羥基染料木黃酮時，所使用的基因重組微生物為試驗例2.1所製備的基因重組微生物之菌粉，接著進行反應基質配製步驟，所述反應基質包含最終濃度為400mM至600mM的硼酸鹽、最終濃度為10mM至40mM的抗壞血酸以及最終濃度為500ppm至2000ppm的染料木黃 酮。配製反應基質時先分別將染料木黃酮溶於二甲基亞碸以得到一染料木黃酮溶液，以及將抗壞血酸溶於水以得到一抗壞血酸溶液。將硼酸鹽溶於一熱水後，調整pH值達pH 8至pH 10，較佳地，調整pH值達pH 9，以得到一硼酸鹽溶液。再將染料木黃酮溶液和抗壞血酸溶液加入硼酸鹽溶液中，以得到所述反應基質。於本試驗中共有7個實施例，實施例1至實施例7的硼酸鹽的最終濃度、抗壞血酸的最終濃度、染料木黃酮的最終濃度以及反應基質的總體積如表二所示。

將配製好的反應基質進行生物轉換反應步驟，係於反應基質中接種基因重組微生物，並於40℃至60℃的生物轉換反應溫度和2L/min至5L/min的生物轉換反應通氣量下以250rpm至350rpm的生物轉換反應攪拌速度培養60分鐘至90分鐘的生物轉換反應時間，以獲得一生物轉換物質。實施例1至實施例7的所加入菌粉的濃度、生物轉換反應時間、生物轉換反應攪拌速度以及生物轉換反應通氣量如表三所示，而生物轉換反應溫度較佳地為50℃。

再將所獲得的生物轉換物質進行終止反應，係於生物轉換物質中加入鹽酸溶液，並於40℃至60℃的終止反應溫度和2L/min至5L/min的終止通氣量下以250rpm至350rpm的終止攪拌速度反應5分鐘至15分鐘的終止反應時間，以獲得一反應液，其中所述反應液包含3’-羥基染料木黃酮。較佳地，鹽酸溶液的最終濃度可為100mM至200mM。終止反應溫度可為50℃，終止反應通氣量可為3L/min，且終止反應攪拌速度可為280rpm。實施例1至實施例7的所加入鹽酸溶液的濃度和體積以及終止反應時間如表四所示。

為得到高純度的3’-羥基染料木黃酮，可進一步地對反應液進行萃取步驟，係將前述反應液中加入乙酸乙酯，其中反應液與乙酸乙酯的體積比可為1：1至1.5：1，並以200rpm至300rpm的震盪轉速重複震盪2分鐘至20分鐘的震盪時間3次，以得到萃取液。實施例1至實施例7的所加入乙酸乙酯的體積、震盪轉速以及震盪時間如表五所示。

萃取液可進一步進行減壓濃縮，將萃取液以減壓濃縮機進行濃縮，先裝至2L茄形濃縮瓶進行濃縮，剩餘量約1L時，以500mL茄形濃縮瓶濃縮至全乾，並用刮勺刮下裝入20mL樣品瓶保存。剩餘殘留的3’-羥基染料木黃酮乾粉，以100mL的乙酸乙酯溶解後裝入血清瓶中保存於-20℃，累積數次後再進行濃縮。

將減壓濃縮之粗萃乾粉秤重並記錄產量，並將1mg的粗萃粉末溶於1mL的甲醇中，以HPLC進行純度分析並記錄於紀錄表中。請參照表六，為實施例1至實施例7的產量和純度。

表六的結果顯示，本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法所製備出的3’-羥基染料木黃酮產量高達6.64g至14.06g，且製備出的3’-羥基染料木黃酮的純度可以高達71.55%至99.30%。顯示本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法可以製備高產量和高純度的3’-羥基染料木黃酮。

2.3.比較例

本試驗例中將試驗例2.1所製備的基因重組微生物之菌粉以不同的製備條件製備3’-羥基染料木黃酮以作為比較例。比較例與實施例的差別在於培養時反應基質的總體積以及生物轉換反應步驟的條件，其餘步驟、條件以及所使用的基因重組微生物與實施例相同。比較例之3’-羥基染料木黃酮之製備方法包含以下步驟：進行反應基質配製步驟，所述反應基質包含最終濃度為500mM的硼酸鹽、最終濃度為10mM至20mM的抗壞血酸以及最終濃度為1000ppm的染料木黃酮，反應基質的配製順序與實施例相同。於本試驗中共有6個比較例，比較例1至比較例6的硼酸鹽的最 終濃度、抗壞血酸的最終濃度、染料木黃酮的最終濃度以及反應基質的總體積如表七所示。

將配製好的反應基質進行生物轉換反應步驟，係於反應基質中接種基因重組微生物，並於50℃的生物轉換反應溫度下以220rpm的生物轉換反應攪拌速度培養90分鐘的生物轉換反應時間，以獲得一生物轉換物質。比較例1至比較例6的所加入菌粉的濃度、生物轉換反應時間以及生物轉換反應攪拌速度如表八所示。

再將所獲得的生物轉換物質進行終止反應，係於生物轉換物質中加入鹽酸溶液，並於50℃的終止反應溫度以220rpm的終止攪拌速度反應10分鐘的終止反應時間，以獲得一反應液，其中所述反應液包含3’-羥基染料木黃酮。比較例1至比較例6的所加入鹽酸溶液的濃度和體積以及終止反應時間如表九所示。

比較例同樣對反應液進行萃取步驟，係將前述反應液中加入乙酸乙酯，並以250rpm的震盪轉速重複震盪2分鐘至3分鐘的震盪時間3次，以得到萃取液。比較例1至比較例6的所加入乙酸乙酯的體積、震盪轉速以及震盪時間如表十所示。

再將比較例1至比較例7的萃取液進行減壓濃縮，將減壓濃縮之粗萃乾粉秤重和記錄產量，並將1mg的粗萃粉末溶於1mL的甲醇中，以HPLC進行純度分析並記 錄於紀錄表中。請參照表十一，為比較例1至比較例6的產量和純度。

表十一的結果顯示，比較例之3’-羥基染料木黃酮之製備方法所製備出的3’-羥基染料木黃酮僅具有0.26g至2.29g的3’-羥基染料木黃酮，且製備出的3’-羥基染料木黃酮的純度僅有21.21%至35.11%。與試驗例2.2比較，本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法不僅可以顯著地提高產量為6.64g至14.06g，並可以顯著地提高所製得的3’-羥基染料木黃酮純度達71.55%至99.30%。

2.4.配製液態原料

於本試驗例中進一步將以本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法所製得的3’-羥基染料木黃酮配製液態原料，後續可作為化妝品之用。試驗上分別配製含有10%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料以及20%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料。其中含有10%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料為10g的3’-羥基染料木黃酮溶於90g的丙二醇(propanediol)中，含有20%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料為20g的3’-羥基染料木黃酮溶於80g的丙二醇中。製 備液態原料時先將丙二醇加熱至80℃後，加入3’-羥基染料木黃酮，加入攪拌5分鐘至10分鐘至3’-羥基染料木黃酮完全溶解，即完成液態原料的製備。製備完成的液態原料經過濾後進行真空除泡後，避光保存於室溫。

請參照第3圖，為以本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法所製得的3’-羥基染料木黃酮配製液態原料的產量統計圖，其為試驗5次的統計結果。第3圖的結果顯示，本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法所製得的3’-羥基染料木黃酮製備液態原料，每次的產量皆可達100克以上，顯示本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法具有製備高產量之液態原料的潛力。

本試驗例進一步測試所配製的液態原料於不同的溫度下的穩定性，試驗上分別將含有10%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料和含有20%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料放置於-10℃至45℃的環境下，並分別於第1、3、7、22、42和57天測定液態原料中3’-羥基染料木黃酮的含量。

請參照第4圖和第5圖，第4圖繪示含有10%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料穩定性的分析結果圖，第5圖繪示含有20%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料穩定性的分析結果圖，其中變溫為於高溫、室溫及低溫輪流放置。結果顯示，含有20%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料，不論在-10℃至45℃的環境下，觀察至第57天液態原料中3’-羥基染料木黃酮的穩定度仍超過100%，顯示含有20%的 3’-羥基染料木黃酮的液態原料可以穩定地存放於-10℃至45℃的環境下。而含有10%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料，雖於45℃的環境下至第57天其穩定度低於100%，但穩定度仍高於80%。而於-10℃至25℃的環境下，觀察至第42天液態原料中3’-羥基染料木黃酮的穩定度仍超過100%，顯示含有10%的3’-羥基染料木黃酮的液態原料可以穩定地存放於-10℃至25℃的環境下。

綜上所述，本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，以基因工程微生物進行3’-羥基染料木黃酮的轉換，其製備方法可進行大規模工業化的生產，因可控制起始產物、生物轉換反應條件等生產製程，使所製得的3’-羥基染料木黃酮品質穩定且純度高，故可解決3’-羥基染料木黃酮低生產率的問題。此外，所製得的3’-羥基染料木黃酮可進一步配製高產量的液態原料，且所配製的液態原料具有高穩定性，是以本發明之3’-羥基染料木黃酮之製備方法所製得的3’-羥基染料木黃酮可應用於化妝品組合物、生醫藥組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物上，具有運用於生醫保健市場之潛能。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

<110> 佐登妮絲國際股份有限公司

<120> 3’-羥基染料木黃酮之製備方法

<160> 3

<210> 1

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 酪胺酸酶基因

<400>

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 正向引子

<400>

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 反向引子

<400>

100‧‧‧3’-羥基染料木黃酮之製備方法

110、120、130、140‧‧‧步驟

Claims (7)

1. 一種3’-羥基染料木黃酮之製備方法，包含：構築一基因重組微生物，係將一環狀重組質體轉形至一微生物表達系統中，以得到該基因重組微生物，其中該環狀重組質體包含如序列辨識編號1所示之酪胺酸酶(tyrosinase)基因，其中該微生物表達系統為一大腸桿菌系統；進行一反應基質配製步驟，其中該反應基質包含最終濃度為400mM至600mM的硼酸鹽、最終濃度為10mM至40mM的抗壞血酸以及最終濃度為500ppm至2000ppm的染料木黃酮，且該反應基質的總體積為2500mL至4000mL；進行一生物轉換反應步驟，係於該反應基質中接種0.8mg/mL至1.4mg/mL的該基因重組微生物，並於一生物轉換反應溫度和一生物轉換反應通氣量下以一生物轉換反應攪拌速度培養一生物轉換反應時間，以獲得一生物轉換物質，其中該生物轉換反應溫度為40℃至60℃，該生物轉換反應通氣量為2L/min至5L/min，該生物轉換反應攪拌速度為250rpm至350rpm，且該生物轉換反應時間為60分鐘至90分鐘；以及進行一終止反應步驟，係於該生物轉換物質中加入一鹽酸溶液，並於一終止反應溫度和一終止通氣量下以一終止攪拌速度反應一終止反應時間，以獲得一反應液，其中該終止反應溫度為40℃至60℃，該終止反應通氣量為2L/min至5L/min，該終止反應攪拌速度為250rpm至350 rpm，該終止反應時間為5分鐘至15分鐘，且該反應液包含該3’-羥基染料木黃酮。
2. 如申請專利範圍第1項所述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中該微生物表達系統為大腸桿菌(Escherichia coli)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中該反應基質配製步驟包含：將該染料木黃酮溶於二甲基亞碸，以得到一染料木黃酮溶液；將該抗壞血酸溶於水，以得到一抗壞血酸溶液；將該硼酸鹽溶於一熱水後，調整pH值達pH 8至pH 10，以得到一硼酸鹽溶液；以及將該染料木黃酮溶液和該抗壞血酸溶液加入該硼酸鹽溶液中，以得到該反應基質。
4. 如申請專利範圍第1項所述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中該鹽酸溶液的最終濃度為100mM至200mM。
5. 如申請專利範圍第1項所述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，更包含一萃取步驟，係於該反應液中加入乙酸乙酯，並以一震盪轉速重複震盪一震盪時間3次。
6. 如申請專利範圍第5項所述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中該反應液與該乙酸乙酯的體積比為1：1至1.5：1。
7. 如申請專利範圍第5項所述之3’-羥基染料木黃酮之製備方法，其中該震盪轉速為200rpm至300rpm，且該震盪時間為2分鐘至20分鐘。

Images