JP7498448B2 - ＳＮＨＧ１２遺伝子に由来するｎｃＲＮＡの発現抑制剤を有効成分とするがん増殖抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ：ｓｎｏＲＮＡ）の一つである、ＳＮＨＧ１２遺伝子に由来するｎｃＲＮＡの発現を抑制する化合物を有効成分とする新規ながん増殖抑制剤、更にはがんの治療剤に関する。

小胞体ストレス（ＥＲストレス）は、糖尿病、神経変性疾患、脳卒中、ウイルス感染、心臓疾患等の多くの病気の原因となっている。これまでの成果から、慢性的な小胞体ストレスが、黒色皮膚がん、多発的骨髄腫、乳癌、肝細胞癌などの多種の癌種に顕著に見出されている。小胞体ストレスは、小胞体膜に局在する３つのシグナル変換因子（ＰＥＲＫ、ＩＲＥＩ、ＡＴＦ６）が引き金になって起きる３つのシグナル経路で特徴付けられている（非特許文献１）。これらの因子には分子シャペロンであるＢｉＰが結合していて通常は不活性になっている。ＥＲストレスが起きると、これらの因子からＢｉＰが脱離し、その後、これらの因子の立体構造が変化して活性化し、それぞれのシグナル経路でシグナル情報を伝達して行く。 特にＰＥＲＫに基づくシグナル情報は、がんの生存と増殖を助長することが知られている。最近の研究では、ＰＥＲＫに基づくシグナル情報がｌｎｃＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ、＞２００ｂｐ）の発現と関連していることが明らかにされており、例えばｌｎｃＲＮＡのＭａｌａｔＩは、ＰＥＲＫのシグナル情報で発現すると報告されており、このＭａｌａｔＩは、がんの増殖と転移を助長するｌｎｃＲＮＡであることが知られている（非特許文献１）。従って、がん細胞でＰＥＲＫのシグナル情報を受けて発現するｌｎｃＲＮＡは、がんの悪性化を助長するものであると考えられる。 また、がん細胞でＰＥＲＫのシグナル情報を受けて発現すると考えられるｌｎｃＲＮＡとして、ＳＮＨＧ１２遺伝子に由来するｓｎｈｇ１２（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ ｈｏｓｔ ｇｅｎｅ １２）がある。ｌｎｃＲＮＡであるｓｎｈｇ１２は、乳癌、骨肉腫、肝細胞癌などの癌に顕著に発現していることが知られており、このｌｎｃＲＮＡの発現亢進は、癌の大きさに密接に関係し、癌のステージを悪化させると共に、大腸がん患者の５年生存率を悪化させていることが報告されている（非許文献２）。

また、ｓｎｈｇ１２は、脳腫瘍グリオーマ細胞の増殖と転移を促進することが明らかとなっている（非特許文献３）。また、ｓｎｈｇ１２は、Ｎｏｔｃｈシグナル経路を調節することによって細胞増殖および転移を調節することから、ｓｎｈｇ１２の発現が増加すると、鼻咽頭癌の予後不良を予測できると報告されている（非特許文献４）。しかしながら、ｓｎｈｇ１２の作用機序の報告が多く（非特許文献５）、ｓｎｈｇ１２の発現抑制によるがん治療については、ほとんど報告されていない状況である。

ＹＩＷＥＮ ＢＵ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３１：２０８８－２０９６，２０１６ Ｈｅｎｇ Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｕｎｅ ２０１７：１－１１ Ｌｅｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０１８ Ｓｅｐ；５３（３）：１３７４－１３８４． Ｌｉｕ ＺＢ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ２０１８ Ｎｏｖ ４． ｄｏｉ： １０．３２３３／ＣＢＭ－１８１８７３． Ｐｅｉ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，Ｖｏｌ．８，（Ｎｏ．４８），ｐｐ：８４０８６－８４１０１

本発明は、がん細胞の生体内での定着、増殖を抑制する、新たな作用機序のがんの治療剤を提供することを目的とする。

本発明者は、がん細胞で起こる小胞体ストレスに対応して発現するｌｎｃＲＮＡの研究を鋭意検討してきた。そして、図１のようにＳＮＨＧ１２遺伝子が各種のがん細胞で高発現することを見出した。 更に本発明者がＳＮＨＧ１２遺伝子に由来するｌｎｃＲＮＡの中で、ｓｎｈｇ１２に着目して検討を進めたところ、ｓｎｈｇ１２が高発現するがん患者では、患者生存率が低いことを見出した。図２～５に示されるように、膵臓がん、肺がん、腎がん、グリオーマがんの担癌患者の場合、ｓｎｈｇ１２が高発現のがん患者は、ｓｎｈｇ１２が低発現のがん患者と比較して、治療開始後の予後が悪いこと（患者生存率が低いこと）を見出した。 そこで、本発明者は、ｓｎｈｇ１２の発現を抑制できれば、がん細胞の増殖と転移が抑制できると考え、核酸を用いてｓｎｈｇ１２の発現を抑制することを検討した。７７６個の塩基対のｓｎｈｇ１２の４つの部位（Ｒｅｇｉｏｎ）をターゲットとして選択し、その部分にハイブリダイズしてＲＮＡの発現を抑制する１本鎖又は２本鎖の核酸を作製した。ｓｎｈｇ１２の元となるＤＮＡの塩基配列を図６に示す。作製した核酸（実施例の項目に示したのはｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ）は、図７～８に示されるように、ｓｎｈｇ１２の発現抑制効果を示した。

この知見に基づき、本発明者は、ｓｉＲＮＡ番号２２（対応するＤＮＡ配列は配列番号２２）を使用し、ラットに移植された増殖抑制試験を図９のスケジュールで実施したところ、移植したヒト腎がん細胞は、図１０に示すように増殖し、番号２２のｓｉＲＮＡの投与でヒト腎がん細胞の増殖が顕著に抑制されることを見出した。 本発明者は、以上の知見に基づいて本発明を完成した。

即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ｓｎｈｇ１２の発現抑制剤を有効成分とする、がんの増殖抑制剤。
（２）上記ｓｎｈｇ１２の発現抑制剤が、１本鎖又は２本鎖の核酸であって、ｓｎｈｇ１２の４つの部位（１２７～１４７位、３５２～４２８位、４５８～４８０位、５３５～７３５位）のいずれかにハイブリダイズできる一つ以上の核酸であることを特徴とする、上記（１）に記載のがんの増殖抑制剤。
（３）上記核酸が、４つの部位の内、５３５～７３５位の領域（Ｒｅｇｉｏｎ４）にハイブリダイズできる一つ以上の核酸であることを特徴とする、上記（２）に記載のがんの増殖抑制剤。
（４）上記核酸が、配列番号１（ｔｃｇａｇａｔｇｇｔｇｇｔｇａａｔｇｔ）、配列番号３（ｃｃｇｇｃｇｔａｃｔｔａａｇｃａｇａｔ）、配列番号２２（ａｇｇｔａｇａａａｃａａｃａｇｃａｔｇ）、配列番号２３（ａａｃａａｃａｇｃａｔｇｃｔａａｔｇｃａａ）、配列番号３０（ａｇａｇｇｔｇａｔｃａａｔａａａａｇａ）、配列番号３１（ａｇａｇｇｔｇａｔｃａａｔａａａａｇａ）、又は配列番号３２（ａｃａｇｃａｔｇｃｔａａｔｇｃａａａａ）に対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡ；配列番号１、配列番号３、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に対応するＲＮＡ配列と相補的なＲＮＡ配列からなるＲＮＡ；配列番号１、配列番号３、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２のＤＮＡ配列からなるＤＮＡ；及び配列番号１、配列番号３、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２と相補的なＤＮＡ配列からなるＤＮＡの中から選択される一つ以上である、上記（２）又は（３）に記載のがんの増殖抑制剤。
（５）上記核酸が、配列番号２２若しくは配列番号３１に対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡであるか、配列番号２２若しくは配列番号３１に対応するＲＮＡ配列と相補的なＲＮＡ配列からなるＲＮＡであるか、配列番号２２若しくは配列番号３１のＤＮＡ配列からなるＤＮＡであるか、又は配列番号２２若しくは配列番号３１と相補的なＤＮＡ配列からなるＤＮＡである、上記（２）～（４）のいずれかに記載のがんの増殖抑制剤。
（６）上記がんが、ｓｎｈｇ１２の高発現のがん細胞である、上記（１）～（５）のいずれかに記載のがんの増殖抑制剤。
（７）上記がんが、膵臓がん、肺がん、腎がん、グリオーマがんのいずれかである、上記（６）に記載のがんの増殖抑制剤。
（８）上記がんが、腎がんである、上記（６）又は（７）に記載のがんの増殖抑制剤。
（９）上記（１）～（７）のいずれかに記載のがんの増殖抑制剤を有効成分とする、がん治療剤。
（１０）がんの増殖抑制に有効な量のｓｎｈｇ１２の発現抑制剤をがん患者に投与する、がんの増殖抑制方法。
（１１）がん治療に有効な量のｓｎｈｇ１２の発現抑制剤をがん患者に投与する、がん治療方法。
（１２）ｓｎｈｇ１２の発現抑制剤のがんの増殖抑制剤の製造のための使用。
（１３）ｓｎｈｇ１２の発現抑制剤のがん治療剤の製造のための使用。
（１４）がんの増殖抑制における使用のためのｓｎｈｇ１２の発現抑制剤。
（１５）がん治療における使用のためのｓｎｈｇ１２の発現抑制剤。

本発明のがん増殖抑制剤及びがん治療剤は、ｓｎｈｇ１２が高発現するがん細胞の増殖を抑制し、がんの治療を行うものである。がん細胞でのｓｎｈｇ１２の高発現を抑制するために、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、ｍｉＲＮＡや、アプタマー、デコイのような公知の手段を使用することができる。ｓｉＲＮＡなどの核酸がハイブリダイズする部位としては、ｓｎｈｇ１２の４つの部位（１２７～１４７位、３５２～４２８位、４５８～４８０位、５３５～７３５位）を使用することができる。 ｓｉＲＮＡなどのｓｎｈｇ１２発現抑制剤を使用することによって、腎がんの増殖を顕著に抑制できることから、本発明のがん増殖抑制剤は、腎がんを始めとする多くのｓｎｈｇ１２高発現のがんの治療剤として有効である。

ＳＮＨＧ１２遺伝子が高発現である各種のがん細胞の実情を表した図である。 膵臓がん患者でのｓｎｈｇ１２の発現量と患者の生存率を表した図である。 肺がん患者でのｓｎｈｇ１２の発現量と患者の生存率を表した図である。 腎がん患者でのｓｎｈｇ１２の発現量と患者の生存率を表した図である。 グリオーマがん患者でのｓｎｈｇ１２の発現量と患者の生存率を表した図である。 ｌｎｃＲＮＡであるｓｎｇｈＲＮＡに対してこれの発現を抑制する核酸がハイブリダイズする部位とその部位に使用する核酸の塩基配列を記載した図である。 図６に記載された核酸（ｓｉＲＮＡ）を使用して得られる、ｓｎｈｇ１２の発現抑制効果を表した図である。 ｓｎｈｇ１２に対するｓｉＲＮＡによる腎がん細胞株でのｓｎｈｇ１２の発現量の抑制効果を表した図である。 図８で使用したｓｉＲＮＡ（対応するＤＮＡ配列は配列番号２２）を使用した、異種移植腎がん細胞の増殖抑制試験法のプロトコールを表した図である。 図９のプロトコールで実施されたがん細胞の増殖抑制試験の結果を表した図である。

本発明の「ｓｎｈｇ１２」とは、ＳＮＨＧ１２遺伝子から派生するｌｎｃＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ）であり、その元となるＤＮＡは図６で示される７７６個の塩基対で構成されている。ＳＮＨＧ１２遺伝子は、染色体の１ｐ３５．３に存在し、６つのエキソンを持つ遺伝子である。この遺伝子から、ｓｎｈｇ１２と共に、ＳＮＯＤＲ４４、ＳＮＯＤＲ６１、ＳＮＯＤＲ１６Ａ、ＳＮＯＤＲ９９の合計５種のｎｃＲＮＡが発現される。ＳＮＨＧ１２遺伝子の発現は、ｌｎｃＲＮＡのｓｎｈｇ１２と共に、ＳＮＯＤＲ４４、ＳＮＯＤＲ６１、ＳＮＯＤＲ１６Ａ、ＳＮＯＤＲ９９の合計５種のｎｃＲＮＡの発現により確認することができる。 これらｎｃＲＮＡは、乳癌、骨肉腫、肝細胞癌などの癌に顕著に発現していることが知られており、これらｎｃＲＮＡの発現亢進は、癌の大きさに密接に関係し、癌のステージを悪化させると共に、大腸がん患者の５年生存率を悪化させていることが報告されている（非特許文献２）。

本発明の「発現抑制剤」とは、ｓｎｈｇ１２の発現を抑制する試剤であれば特に限定はされない。ｓｎｈｇ１２の発現抑制剤は、核酸（１本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらのハイブリッド）であり、ｓｎｈｇ１２に対してＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡや、アンチセンス（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、デコイ、アプタマー等が挙げられる。
使用されるアンチセンスやｓｉＲＮＡ等の核酸化合物の塩基数は、１４～４５個とすればよく、核酸化合物の種類によって適宜好ましい塩基数のものを使用することができる。例えばアンチセンスの塩基数は１４～３０個、ｓｉＲＮＡの塩基数は１９～２５個、ｍｉＲＮＡの塩基数は１９～２５個、デコイの塩基数は１６～２４個、アプタマーの塩基数は２６～４５個が、それぞれ望ましい。

ｓｎｈｇ１２の発現を抑制するために、例えば、ｓｉＲＮＡなどの核酸を標的領域にハイブリダイズさせることができる。ｓｎｈｇ１２のターゲット部位に対応するＤＮＡの部位としては、図６で示される４つの部位（Ｒｅｇｉｏｎ１～４）を挙げることができる。Ｒｅｇｉｏｎ１は、１２７～１４７位の部位であり、Ｒｅｇｉｏｎ２は、３５２～４２８位の部位である。Ｒｅｇｉｏｎ３は、４５８～４８０位の部位であり、Ｒｅｇｉｏｎ４は、５３５～７３５位の部位である。

ｓｎｈｇ１２にハイブリダイズする核酸としては、図６で示される４つの部位（Ｒｅｇｉｏｎ１～４）に対応するＲＮＡ部位の何れかにハイブリダイズする３０個以下、好ましくは１４～３０個、より好ましくは１５～２５個、さらにより好ましくは１８～２１個の塩基からなる核酸を挙げることができる。
このような核酸として、配列番号１～３２の何れかの塩基配列を含む３０個以下、好ましくは２５個以下、より好ましくは２３個以下の塩基からなるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡ、特に配列番号１～３２の何れかの塩基配列に対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡを挙げることができる。また、配列番号１～３２の何れかの塩基配列に相補的な塩基配列を含む３０個以下、好ましくは２５個以下、より好ましくは２３個以下の塩基からなるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡ、特に配列番号１～３２の何れかに相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡを挙げることができる。また、配列番号１～３２の何れかの塩基配列を含む３０個以下、好ましくは２５個以下、より好ましくは２３個以下の塩基からなるＤＮＡ、特に、配列番号１～３２の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。また、配列番号１～３２の何れかの塩基配列に相補的な塩基配列を含む３０個以下、好ましくは２５個以下、より好ましくは２３個以下の塩基からなるＤＮＡ、特に、配列番号１～３２の何れかに相補的な塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。

中でも好ましい核酸としては、図７で示されるように、ｓｎｈｇ１２の発現抑制率が５０％以上のものを挙げることができ、配列番号１、３、２２、２３、３０、３１、若しくは３２の塩基配列を含む３０個以下、好ましくは２５個以下、より好ましくは２３個以下の塩基からなるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡ、特に配列番号１、３、２２、２３、３０、３１、若しくは３２の塩基配列に対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡを挙げることができる。また、配列番号１、３、２２、２３、３０、３１、若しくは３２の塩基配列に相補的な塩基配列を含む３０個以下、好ましくは２５個以下、より好ましくは２３個以下の塩基からなるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡ、特に配列番号１、３、２２、２３、３０、３１、若しくは３２に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡを挙げることができる。また、配列番号１、３、２２、２３、３０、３１、若しくは３２の塩基配列を含む３０個以下、好ましくは２５個以下、より好ましくは２３個以下の塩基からなるＤＮＡ、特に、配列番号１、３、２２、２３、３０、３１、若しくは３２の塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。また、配列番号１、３、２２、２３、３０、３１、若しくは３２の塩基配列に相補的な塩基配列を含む３０個以下、好ましくは２５個以下、より好ましくは２３個以下の塩基からなるＤＮＡ、特に、配列番号１、３、２２、２３、３０、３１、若しくは３２に相補的な塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
核酸は単独で使用してもよく、２種以上の核酸を組み合わせて使用してもよい。

また、発現抑制剤がＲＮＡ分子である場合は、生体内で生成し得るようにデザインされたものであってもよい。具体的には、当該ＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡを哺乳動物細胞用の発現ベクターに挿入したものであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミド等が挙げられる。

また、核酸は、安定性改善のために化学修飾が施されたものであってもよい。化学修飾核酸として、例えば、ホスホロチオエート、モルフォリノホスホロジアミデート、ボラノホスフェート、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）のような核酸アナログを含む核酸や、２’－Ｏ－メチル化核酸、２’－Ｏ－メトキシエチル化核酸等が挙げられる。

本発明の「がんの増殖抑制剤」とは、がんの増殖を抑制できる試剤のことであり、ｓｎｈｇ１２の発現を抑制する試剤を有効成分として使用することによって達成することができるものを言う。
本発明の「がん治療剤」とは、がんの増殖を抑制することにより、がん細胞のアポトーシスを惹起するか、あるいは増殖が止まったがん細胞を生体の免疫反応によって死滅させる治療剤のことを言う。

増殖抑制や治療対象のがん細胞としては、図１に記載の１７種のがん細胞を含む、ＳＮＨＧ１２遺伝子の発現が高いがん細胞３３種（胸腺腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、子宮頸がん、精巣がん、膀胱尿路上皮がん、膀胱がん、急性骨髄性白血病、中皮腫、膵臓がん、眼内黒色腫、子宮体がん、子宮体がん肉腫、肉腫、肺がん、胆管がん、大腸がん、多形性謬芽腫、肺扁平上皮がん、卵巣がん、食道がん、乳頭型腎がん、腎がん、胃がん、頭頸部がん、皮膚がん、甲状腺がん、前立腺がん、乳がん、グリオーマがん、傍神経節腫、腺様膿胞がん、肝がん、嫌色素性腎細胞がん）が挙げられる。好ましくは、膵臓がん、肺がん、腎がん、グリオーマがんを挙げることができる。
本発明のがんの増殖抑制剤及びがんの治療剤は、担癌患者の治療に使用されるだけでなく、担癌患者から癌を切除した後に、再発や転移を予防する目的で投与してもよく、癌の切除後の患者における予後の改善剤又は癌の転移予防剤としても使用することもできる。

また、本発明の増殖抑制剤及び治療剤は、以下のように使用される。
（用量、用法）
投与経路としては、本発明の増殖抑制剤及び治療剤を生体内で癌にデリバリーできることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）、筋肉内、皮下、局所（特に、腫瘍内）、リンパ管又はリンパ節内、髄腔内、直腸内、経粘膜、経皮、鼻腔、肺内、子宮内等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは血管内（動脈内又は静脈内）、局所（特に、腫瘍内）が挙げられる。投与方法は剤形により異なるが、注入（ボーラス注入、点滴注入）が好ましい。

投与量は、がんの増殖抑制剤では、がんの増殖抑制に有効な量とすればよく、がん治療剤では、がんの治療に有効な量とすればよい。使用する有効成分の種類、患者の症状の程度、患者の性別、年齢等に応じて、標的分子の発現抑制及び／又は機能阻害が可能な範囲で、当業者が適宜設定できる。
がんの増殖抑制又はがん治療に有効な、ｓｎｈｇ１２の発現抑制剤の量は、上記の種々の条件により異なるが、例えば、１日当たり、０．００００１ｍｇ～１００ｇ、中でも０．０００１ｍｇ～１０ｇ、中でも０．００１ｍｇ～１ｇ、０．０１ｍｇ～１００ｍｇ、中でも０．１ｍｇ～１０ｍｇとすることができる。この投与量は、ｓｎｈｇ１２の発現抑制剤が修飾されたＲＮＡである場合は、ＲＮＡに換算した量である。また、毎日投与しない場合や投与頻度が経時的に変化する場合は、総投与量から算出した1日当たりの投与量である。

投与頻度又はスケジュールは、上記の種々の条件により異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回、または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間に数回（例えば、１週間に２、３、４回など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってよい。また、症状に応じて経時的に投与頻度が変わってもよい。
投与期間は、例えば、がんが治癒または寛解するまでとすることができる。

本発明の増殖抑制剤及び治療剤は、単独で使用してもよいが、１種又は２種以上の抗腫瘍作用を有する他の薬剤及び／又は放射線療法と併用してもよい。

（製剤形態）
本発明の増殖抑制剤及び治療剤は、その製剤形態に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、固形製剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いて製剤化することができる。また、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。好ましい剤型は、注射剤である。

また、本発明の増殖抑制剤及び治療剤において、有効成分として核酸分子を使用する場合であれば、当該核酸分子が癌細胞内に移行され易いように、核酸導入補助剤と共に製剤化されていることが望ましい。核酸導入補助剤としては、具体的には、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、ＲＮＡｉフェクト、リポソーム、ポリアミン、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマー等が挙げられる。

本発明は、がんの増殖抑制に有効な量の、ｓｎｈｇ１２の発現抑制剤を、がん患者に投与する、がんの増殖抑制方法を提供する。
また、本発明は、がん治療に有効な量の、ｓｎｈｇ１２の発現抑制剤を、がん患者に投与する、がん治療方法を提供する。がん治療は、がんの増殖を抑制することにより、がん細胞のアポトーシスを惹起するか、あるいは増殖が止まったがん細胞を生体の免疫反応によって死滅させることを言う。

以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。

（実施例１）担がん患者におけるＳＮＨＧ１２遺伝子の発現量の測定
ａ）材料・試薬：
米国国立がん研究所米国国立ヒトゲノム研究所によるがんゲノムアトラスプロジェクトで収集した、さまざまな組織におけるがんのゲノムやエピゲノム、トランスクリプトーム、変異情報などの公開データ
ｂ）方法：
公開データ内のＲＮＡ－ｓｅｑにより解析されたＳＮＨＧ１２遺伝子のＲＮＡ発現データ（ＲＰＫＭ値：Ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）を取得し、全遺伝子の発現量からＳＮＨＧ１
２ＲＮＡ発現量の相対値(ＡＵ)を正規化法により算出し、患者毎でのＳＮＨＧ１２遺伝子発現量をｌｏｇ２表示した。
ｃ）結果：
図１に記載のように、多くのがんで高発現していることが明らかとなった。

（実施例２）ｌｎｃＲＮＡのｓｎｈｇ１２が高発現と低発現の担がん患者における生存率の相違
ａ）材料・試薬：
米国国立がん研究所米国国立ヒトゲノム研究所によるがんゲノムアトラスプロジェクトで収集した、さまざまな組織におけるがんのゲノムやエピゲノム、トランスクリプトーム、変異情報などの公開データ
ｂ）方法：
公開データ内の担がん患者におけるｓｎｈｇ１２の発現量と治療開始後の生存日数を収集した。
ｓｎｈｇ１２発現量の中央値を算出し、中央値以上をｈｉｇｈ、それより低い量をｌｏｗと区分した。各がん患者をｈｉｇｈ群とｌｏｗ群に分類し、各郡患者の治療開始後の生存率と生存日数をカプランマイヤー法によりグラフ化した。コックス比例ハザードモデルによる統計解析を行った。
ｃ）結果：
図２～５に示されるように、膵臓がん、肺がん、腎がん、グリオーマがんの担がん患者において、ｓｎｈｇ１２発現量の高い担がん患者の生存率が良くないことが示された。

（実施例３）ｓｉＲＮＡを用いたｓｎｈｇ１２の発現抑制評価試験
（１）材料・試薬
・評価細胞株：ヒト腎癌細胞株７８６Ｏ ｍｏｃｋ
・ｓｉＲＮＡ：
ｓｎｈｇ１２の元となるＤＮＡの図６に記載の４つの部位にハイブリダイズする３０種のｓｉＲＮＡと２種のアンチセンスＤＮＡを作製した。各ｓｉＲＮＡがハイブリダイズする領域の元となるＤＮＡの塩基配列は表１～４の配列番号１～３０の塩基配列であり、各アンチセンスＤＮＡがハイブリダイズする領域の元となるＤＮＡの塩基配列は表４の配列番号３１、３２の塩基配列である。各ＲＮＡは配列番号１～３０の各ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなる。

１）部位１（Ｒｅｇｉｏｎ１、１２７～１４７位）

２）部位２（Ｒｅｇｉｏｎ２、３５２～４２８位）

３）部位３（４５８～４８０位）

４）部位４（５３５～７３５位）

（２）方法
腎がん７８６０株を２４穴プレートに培養後、配列番号１～３０の各ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡ、又は配列番号３１、３２のＤＮＡ配列と相補的な塩基配列からなるアンチセンスＤＮＡの５μＭのそれぞれを５μＬのＤｈａｒｍａｆｅｃｔ試薬（ＧＥ－ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)に溶解し細胞内に導入した。７２時間培養後、ＲＮＡを抽出しＲＴ－ｑＰＣＲによりｓｎｈｇ１２の発現量を解析した。
（３）結果
図８に示されるように、腎癌細胞株からのｓｎｈｇ１２の発現は、使用したｓｉＲＮＡによって抑制されることが明らかとなった。
腎がん７８６０株におけるｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡによるｓｎｈｇ１２の５０％以上の発現抑制率をまとめると、例えば図７～８と表５で示すことができる。

ｓｎｈｇ１２の発現抑制のために用いられる好ましい核酸の標的となるＤＮＡ配列としては、配列番号１、配列番号３、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２を挙げることができる。特に好ましい核酸の標的となるＤＮＡとしては、配列番号２２、配列番号３１を挙げることができる。

（実施例４）ｓｎｈｇ１２の発現抑制による異種移植腎細胞がんの増殖抑制試験
（１）材料・試薬
・異種移植用のヒト腎がん細胞株：７８６Ｏ ｍｏｃｋ
・配列番号２２（ａｇｇｔａｇａａａｃａａｃａｇｃａｔｇ）に対応するＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡ
（２）方法
ヌードマウス（雄性、４週令）の皮下に、ヒト腎がん細胞株（７８６Ｏ ｍｏｃｋ）を、５ｘ１０^６個注入した。図９に示されるスケジュールで配列番号２２のｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）を投与した。また、コントロールとして、その反対側の体側に同様にヒト腎がん細胞株を投与し、ＥＧＦＰｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）を投与した。ｓｉＲＮＡの投与開始当日、その後５日目、１０日目、１７日目、２５日目、３２日目の移植腎細胞の直径を計測した。
（３）結果
図１０に示されるように、配列番号２２に対応するＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡを投与した場合、顕著に腎がんの生着と増殖が抑制されていた。一方、コントロールとしてＥＧＦＰｓｉＲＮＡを投与した場合には、移植腎がんが増殖していた。
以上のように、配列番号２２に対応するＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡを投与すると、ｓｎｈｇ１２の発現を抑制して、ヌードマウスに対する腎がん細胞の生着・増殖を顕著に抑制することができた。
このことは、ｓｎｈｇ１２を高発現するがん細胞において、ｓｎｈｇ１２の発現抑制により、がん細胞の増殖抑制ができることを示している。即ち、ｓｎｈｇ１２の発現抑制剤を使用することにより、がん治療が可能であることを示している。

本発明のがん増殖抑制剤及びがん治療剤は、ｓｎｈｇ１２が高発現のがん細胞において、ｓｎｈｇ１２を発現抑制することによって、効果的にがん細胞の増殖を抑制し、がん治療を行える。本発明のがん増殖抑制剤は、単剤で使用することができ、更には免疫賦活化のがん治療剤と併用して、その効果を高めることができる。

Claims (5)

1. 配列番号１、３、６、２２、２３、２９、３０、３１、若しくは３２の塩基配列を含む３０個以下の塩基からなるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡ、又は配列番号１、３、６、２２、２３、２９、３０、３１、若しくは３２の塩基配列に相補的な塩基配列を含む３０個以下の塩基からなるＤＮＡ配列からなるアンチセンスＤＮＡを有効成分とする、がんの増殖抑制剤。
2. 上記がんが、ｓｎｈｇ１２の高発現のがん細胞である、請求項１に記載のがんの増殖抑制剤。
3. 上記がんが、膵臓がん、肺がん、腎がん、グリオーマがんのいずれかである、請求項２に記載のがんの増殖抑制剤。
4. 上記がんが、腎がんである、請求項２又は３に記載のがんの増殖抑制剤。
5. 請求項１～４のいずれかに記載のがんの増殖抑制剤を有効成分とする、がん治療剤。

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