CN110099999A - 用于听力丧失综合征的动物模型及其治疗方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种转基因小鼠,其基因组包含Pou4f3基因的破坏。在一些实施例中,所述转基因小鼠表现出相较于野生型小鼠的听力降低和/或表现出DFNA15疾病的症状。一些实施例涉及一种减轻受试者的所述DFNA15疾病的一种或多种症状的方法。例如,所述方法包含向所述受试者施用一定量的抑制所述受试者的视黄酸信号传导途径的试剂。
Description
技术领域
本公开一般涉及用于进行性听觉丧失的动物模型,并且特别涉及用于DFNA15疾病的动物模型及其治疗方法。
背景技术
进行性听觉丧失是影响大部分人群的由遗传和环境损害导致的最常见的感觉缺陷之一。尽管普遍存在,但到目前为止,减轻听觉丧失的方法仍非常少。明确耳聋的病理和分子变化可能为潜在的治疗发展提供新的见解。
在遗传性听觉障碍中,20%的病例是非综合征性听觉丧失的常染色体显性遗传(ADNSHL),这可能是由对应于59个基因座的至少35个基因中的突变引起的(http://hereditaryhearingloss.org)。常染色体显性耳聋-15(DFNA15)是进行性非综合征性感觉神经性听觉丧失的一种形式,在生命的第二个和第六个十年之间语后发作。尽管有人提出一个或多个基因的突变可能与DFNA15有关,但尚未确定直接的基因到表型证据。
发明内容
本公开的实施例涉及一种转基因小鼠,其基因组包含Pou4f3基因的破坏。在一些实施例中,所述转基因小鼠表现出相较于野生型小鼠的听觉能力降低的听觉能力和/或表现出DFNA15疾病的症状。
一些实施例进一步涉及一种测试试剂对DFNA15疾病的一种或多种症状的治疗功效的方法。在一些实施例中,所述方法可以包含将一种或多种待测试的试剂应用于其基因组可以包含Pou4f3基因的破坏的转基因小鼠。在一些情况下,所述转基因小鼠表现出相较于野生型小鼠的听觉能力降低的听觉能力和/或表现出DFNA15疾病的症状。此外,可以确定DFNA15疾病的一种或多种症状是否由于应用所述一种或多种试剂而改变。
一些实施例涉及一种用于制备转基因小鼠的方法。在一些实施例中,所述方法可以包含破坏小鼠的胚胎干细胞中的Pou4f3基因以生成从小鼠分离的胚胎干细胞或体细胞,以生成胚胎。所述方法可以进一步包含将所述胚胎干细胞或所述胚胎转移到受体雌性小鼠中,使得所述转基因小鼠的基因组可以包含Pou4f3基因的破坏。在某些实施例中,所述转基因小鼠表现出相较于野生型小鼠的听觉能力降低的听觉能力和/或表现出DFNA15疾病的症状。
在一些实施例中,所述Pou4f3基因的破坏可以包含Pou4f3基因的杂合破坏,并且所述转基因小鼠表达野生型Pou4f3基因。
在一些实施例中,所述Pou4f3基因的破坏可以包含Pou4f3基因的纯合破坏,并且所述转基因小鼠不表达野生型Pou4f3基因。
在一些实施例中,所述Pou4f3基因的破坏可以包含Pou4f3基因的一个或多个核苷酸的纯合或杂合缺失和Pou4f3基因的C/T转换。
在一些实施例中,所述Pou4f3基因的破坏是Pou4f3基因的外显子2的一部分的缺失。在某些实施例中,所述转基因小鼠的Pou4f3基因的外显子1未被破坏。
在一些实施例中,所述DFNA15疾病的所述症状可以包含进行性听觉丧失和平衡能力受损中的至少一种。
在一些实施例中,所述一种或多种试剂可以包含调节Espin表达的试剂。
在一些实施例中,所述调节Espin表达的试剂与视黄酸信号传导途径相关。
在一些实施例中,一种或多种测试可以包含在应用所述一种或多种试剂之前和之后对所述转基因小鼠进行的听性脑干反应(ABR)、畸变产物光声发射(DPOAE)和转棒测试中的至少一种。此外,可以确定所述一种或多种测试的结果是否由于应用所述一种或多种试剂而改变。
在一些实施例中,所述一种或多种测试的结果的改善表明试剂对DFNA15疾病的一种或多种症状的治疗功效。
一些实施例进一步涉及一种如上所述的转基因小鼠的分离组织。
一些实施例进一步涉及一种治疗(例如,减轻)受试者的所述DFNA15疾病的一种或多种症状的方法。在一些实施例中,所述方法可以包含向所述受试者施用一定量的抑制所述受试者的视黄酸信号传导途径的试剂。
附图说明
图1示出了Pou4f3基因中8bp的缺失和C-T转换。(A)引入具有8bp和C-T转换的Pou4f3基因的示意性策略。(B)同源重组等位基因的DNA印迹分析。野生型和突变等位基因分别产生6.7千碱基(Kb)和8.6Kb片段。(C)CTR和Pou4f3Δ/+小鼠的肉眼观察。(D)敲入小鼠的PCR基因型分析。可以在来自敲入小鼠的基因组DNA中检测到大小为542bp的条带。(E)来自耳蜗的POU4F3蛋白的蛋白印迹分析。小条带指示Pou4f3△/+小鼠的截短蛋白。
图2示出了Pou4f3△/+小鼠的听觉功能的检查。(A)ABR典型峰型记录。左图示出了响应于具有指示强度的16kHz刺激的对照小鼠(6-7月龄)的ABR峰型图;右图示出了Pou4f3△/+小鼠(6-7月龄)。*指示ABR阈值。(B、C、D和E)短声和纯音(8kHz、16kHz、32kHz)的ABR阈值概述。对照(n=28,29,17,17,7)和Pou4f3△/+小鼠(n=26,27,15,20,5)的年龄范围为5周龄到8-9月龄。记录每个响应的10ms ABR持续时间。误差条指示每个时间点的标准误差。(F、G)在8kHz、16kHz和32kHz下对60dB强度的ABR波I幅度的量化(n=4-6)。(H)不同强度(40到60dB)的ABR波I幅度的量化(n=4-6)。(I)所述图示出了了4-6月龄的CTR和Pou4f3△/+小鼠的DPOAE幅度(n=8)。误差条指示每个频率刺激的标准误差。*表示相较于对照的显著差异。*,p<0.05,**,p<0.01,***,p<0.001。
图3示出了Pou4f3△/+小鼠前庭功能的测量。使对照和Pou4f3△/+小鼠每次试验的最大保留时间均为120秒。结果示出了速度设置分别在12rpm(A)和20rpm(B)下保留在转桶上的动物的比率。与对照小鼠(实心方块)相比,Pou4f3△/+小鼠(实心圆圈)表现出更短的跌落潜伏期。
图4示出了Pou4f3△/+小鼠的柯蒂氏器的组织学形态。用苏木精和曙红(H&E)对柯蒂氏器的塑料切片进行染色。(A)来自对照小鼠(4月龄)的柯蒂氏器。(B、C、D)来自Pou4f3△/+小鼠(4月龄)的柯蒂氏器。比例尺:50mm。
图5示出了Pou4f3△/+小鼠的柯蒂氏器的SEM超微结构。对来自对照(A)和Pou4f3△/+小鼠(B)的中转(middle turn)处的柯蒂氏器进行取样并在扫描电子显微镜下检查。来自Pou4f3△/+小鼠(B、C、D、E)的突变IHC表现出静纤毛融合(^)和过度生长(箭头)。一些突变OHC消失(星号)。与对照(F、I)相比,存在的OHC(G、J)的静纤毛的数量较少。(K)扫描电子显微照片,示出了沿基底膜的三个不同位置:顶端、中部、基部。在6-7月龄的不同耳蜗区域中的IHC静纤毛的长度(L)和OHC静纤毛的数量(M)的量化(分别对于对照的顶端-中部、中部-基部,n=4;分别对于Pou4f3△/+小鼠的顶端-中部、中部-基部,n=7;*,p<0.05,**,p<0.005)。比例尺:5μm。
图6示出了Pou4f3△/+小鼠的毛细胞的TEM超微结构。从对照和Pou4f3△/+小鼠(6-7月龄)分离中回处的耳蜗并取样进行TEM检查。TEM图像的两个上图表示IHC的结构,两个下图表示OHC的结构。用白色虚线画出的细胞是IHC和OHC细胞。星号指示毛细胞的空泡。注意,突变毛细胞中线粒体的数量少于对照。左图示出了毛细胞的线粒体的量化。比例尺:1μm。***,p<0.001。
图7示出了在Pou4f3△/+耳蜗中Espin的过表达(A)Q-PCR测量从4-6月龄(n=6)的耳蜗上皮提取的Espin、Nt3、Bdnf、Gfi1和Lhx3mRNA。(B)Espin蛋白的蛋白印迹分析。(C)Espin蛋白的量化。条表示IODESPIN/IODGAPDH±SD(积分光密度,IOD)的均值。(D)POU4F蛋白对Espin表达的调节。用含有Espin调控区和Pou4f3-或Pou4f3△/+可表达载体的报告基因共转染HEK293细胞。转染后48小时,然后测量荧光素酶活性。*,p<0.05。
图8示出了施用ALDH抑制剂影响DFNA15动物的听觉功能。
具体实施方式
本公开提供了人类疾病和病状(例如,DFNA15耳聋)的动物模型。所述动物模型可以用于方法中,例如标识和表征治疗疾病和病状的方法。
本公开的实施例涉及导致动物具有疾病或病状的一个或多个症状特点的遗传修饰。表现出这些症状的动物在治疗方法的开发中是特别有利的,因为可以评价候选药物和其它治疗方法对这些动物的症状的影响。因此,除了动物模型本身之外,本公开进一步提供了使用动物来标识和表征治疗的方法。在一些实施例中,本公开包含制造转基因非人动物模型的方法和可以在这些方法中使用的细胞。在一些实施例中,本公开进一步涉及用于治疗疾病和病状的方法。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试,但描述了优选方法和材料。出于本发明的目的,以下术语定义如下。
本文使用的冠词“一个/一种(a/an)”是指所述冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。举例来说,“一个元件”表示一个元件或多于一个元件。
“约”是指相较于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
术语“结合”或“与……相互作用”是指一个分子识别并粘附于样品或生物中的特定第二分子,但基本上不识别或粘附于样品中的其它结构上不相关的分子。
“编码序列”是指有助于编码基因的多肽产物的任何核酸序列。相反,术语“非编码序列”是指未有助于编码基因的多肽产物的任何核酸序列。
在整个本说明书中,除非上下文另有要求,否则词语“包含”和“包括”将被理解为暗示包含所述步骤或元件或步骤或元件组,但不排除任何其它步骤或元件或步骤或元件组。
“由……组成”是指包含且限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此,短语“由……组成”指示所列出的元件是必需的或强制性的,并且不能存在其它元件。
“基本上由……组成”是指包含在所述短语之后列出的任何元件,并且限于不干扰或未有助于本公开中针对所列出的元件指定的活性或作用的其它元件。因此,短语“基本上由……组成”指示所列出的元件是必需的或强制性的,但是其它元件是任选的,并且可以存在或不存在,这取决于它们是否影响所列出的元件的活性或作用。
术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即,核苷酸序列)。例如,序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”,其中根据碱基配对规则仅匹配一些核酸碱基。或者,核酸之间可能存在“完全”或“总”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。
“对应于”是指(a)多核苷酸具有与参考多核苷酸序列的全部或部分基本上相同或互补的核苷酸序列,或编码与肽或蛋白质中的氨基酸序列相同的氨基酸序列;或(b)肽或多肽具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。
“降低”或“减少”或“较少”量通常是“统计学显著的”或生理学上显著的量,并且可以包含本文描述的量或水平的约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50或更多倍(例如,100倍、500倍、1000倍)(包含在其之间且大于1的所有整数和小数,例如1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8等)的降低。
靶基因的“缺失”也可以通过靶向所述基因的mRNA来完成,例如通过使用本领域已知的各种反义技术(例如,反义寡核苷酸和siRNA)。因此,当由所述基因编码的多肽或酶不被修饰的细胞表达或以可忽略的量表达时,靶基因可被认为是“非功能性的”,使得修饰的细胞相较于未修饰或不同修饰的细胞产生或累积较少的多肽或酶产物(例如,白蛋白)。
关于多核苷酸,术语“外源的”是指在野生型细胞或生物中非天然存在的多核苷酸序列,但通常通过分子生物学技术引入细胞中。外源多核苷酸的实例包含编码所需的蛋白质的载体、质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸,术语“内源的”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物中发现的天然存在的多核苷酸序列。而且,通过分子生物学技术从第一生物分离并转移到第二生物的特定多核苷酸序列通常被认为是相对于第二生物的“外源”多核苷酸。在具体实施例中,多核苷酸序列可以通过分子生物学技术“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物,例如,以产生以其它方式天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的拷贝,从而促进编码的多肽的过表达。
如本文使用,术语“功能”和“功能性的”等是指生物学、酶学或治疗功能。
“基因”是指占据染色体上特定基因座的遗传单位,并且由转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(即内含子,5'和3'未翻译序列)组成。
“同源性”是指相同或构成保守取代的氨基酸的百分数。可以使用序列比较程序(例如,GAP(Deveraux等人,1984年,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,12,387-395))确定同源性,所述文献通过引用并入本文。以这种方式,可以通过将空位插入比对中来比较与本文引用的序列相似或明显不同长度的序列,这种空位例如通过GAP使用的比较算法确定。
术语“宿主细胞”包含单个细胞或细胞培养物,其可以是或已经是本发明的任何重组载体或分离的多核苷酸的受体。宿主细胞包含单个宿主细胞的后代,并且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变,所述后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学上或在总DNA补体中)。宿主细胞包含用本发明的重组载体或多核苷酸在体内或体外转染或感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。
“分离的”是指物质基本上(substantially/essentially)不含在其天然状态下通常伴随其的组分。例如,如本文使用,“分离的多核苷酸”是指已经从天然存在状态的侧翼序列纯化的多核苷酸,例如已经从通常与DNA片段相邻的序列去除的所述DNA片段。可替代地,如本文使用,“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从肽或多肽分子的天然细胞环境以及从其与细胞其它组分的缔合中体外分离和/或纯化的所述肽或多肽分子。
关于探针或抗体,术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质与探针或抗体联接(即物理连接)来直接标记所述探针或抗体。
术语“基因座”是染色体上DNA序列的(例如,基因的)具体物理位置。术语“基因座”通常是指染色体上靶序列的具体物理位置。
“从……获得”是指样品(例如,多核苷酸或多肽)从特定来源(例如,期望的生物或期望的生物内的具体组织)分离或衍生。“从……获得”还可以指多核苷酸或多肽序列从特定生物或生物内的组织分离或衍生的情况。例如,编码本文所述的参考多肽的多核苷酸序列可以从多种原核或真核生物,或从某些真核生物内的特定组织或细胞分离。
本文所用的叙述“多核苷酸”或“核酸”表示mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。所述术语通常是指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式,或是核糖核苷酸,或是脱氧核苷酸,或是任一类型核苷酸的修饰形式。所述术语包含DNA和RNA的单链和双链形式。
术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指表现出与参考多核苷酸序列或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸具有基本序列同一性的多核苷酸。这些术语还涵盖通过添加、缺失或取代至少一个核苷酸而区别于参考多核苷酸的多核苷酸。因此,术语“多核苷酸变体”和“变体”包含其中已添加或缺失一个或多个核苷酸或一个或多个核苷酸用不同核苷酸替换的多核苷酸。在这方面,本领域充分理解,可以对参考多核苷酸进行某些改变(包含突变、添加、缺失和取代),由此改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活性,或者具有增加的与参考多核苷酸相关活性(即,优化的)。多核苷酸变体包含例如与本文所述的参考多核苷酸序列具有至少50%(和至少51%到至少99%以及期间的所有整数百分比,例如90%、95%或98%)的序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包含天然存在的等位基因变体和编码这些酶的直系同源物。
在某些方面,靶核酸可以通过改变编码多肽的氨基酸序列的核苷酸水平的变化或突变而变为“非功能性的”,使得表达修饰的多肽,但其具有关于其活性(例如,引入白蛋白的转运)降低的功能或活性,无论是通过修饰所述多肽的活性位点、其细胞定位、其稳定性,还是本领域技术人员显而易见的其它功能特征。参与白蛋白表达的多肽的编码序列的这种修饰可以根据本领域已知的技术完成,例如基因组水平的定点诱变和/或给定细胞的自然选择(即定向进化)。
“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用,是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此,这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(例如,相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物,以及天然存在的氨基酸聚合物。
背景多肽“变体”是指通过添加、缺失或取代至少一个氨基酸残基而区别于参考多肽序列的多肽。在某些实施例中,多肽变体通过一个或多个取代区别于参考多肽,所述取代可以是保守的或非保守的。在某些实施例中,多肽变体包含保守取代,并且在这方面,本领域充分理解,一些氨基酸可以在不改变多肽的活性的性质的情况下改变为具有广泛相似性质的其它氨基酸。多肽变体还涵盖其中已添加或缺失一个或多个氨基酸或一个或多个氨基酸用不同氨基酸残基替换的多核苷酸。
术语“参考序列”通常是指与另一序列进行比较的核酸编码序列或氨基酸序列。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列都被作为参考序列包含,包含以名称描述的那些(例如,β2微球蛋白)和在序列表中描述的那些。
术语“样品”在本文中以其最广泛的含义使用。包含多核苷酸、肽、抗体等的样品可以包含体液、细胞制剂或细胞生长的培养基的可溶性部分、基因组DNA、RNA或cDNA、细胞、组织、皮肤、毛发等。样品的实例包含唾液、血清、活检标本、血液、尿液和血浆。
如本文使用,叙述“序列同一性”或例如包含“与……具有50%同一性的序列”是指序列在比较窗口期间在逐个核苷酸的基础或逐个氨基酸的基础上的相同程度。因此,“序列同一性百分比”可以通过以下计算:在比较窗口期间比较两个最佳比对序列,确定在两个序列中存在相同的核酸碱基(例如,A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如,Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)位置的数量以产生匹配位置的数量,将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数(即窗口大小),并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。包含与本文所述的任何参考序列(参见例如序列表)具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的核苷酸和多肽,通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物学活性。
用于描述两种或更多种多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包含“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”的长度为至少12个,但通常为15到18个,常常为至少25个单体单元(包含核苷酸和氨基酸残基)。因为两种多核苷酸可以各自包含(1)两种多核苷酸之间相似的序列(即,仅完整多核苷酸序列的一部分),和(2)两种多核苷酸之间不同的序列,两种(或多种)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”期间比较两种多核苷酸的序列来进行,以标识和比较序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指至少6个(通常为约50到约100个,更通常为约100到约150个)连续位置的概念性片段,其中序列与相同数量的连续位置的参考序列进行比较,然后再对两个序列进行最佳比对。对于两个序列的最佳比对,比较窗口可以包含相较于参考序列(其不包含添加或缺失)约20%或更少的添加或缺失(即,空位)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)进行,或者通过由选择的各种方法中的任一种生成的检查和最佳比对(即,在比较窗口期间产生最高百分比同源性)进行。还可以参考例如由Altschul等人,1997年,《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》,25:3389公开的BLAST家族程序。序列分析的详细讨论可以见于Ausubel等人,《分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,John Wiley&SonsInc,1994-1998,第15章的第19.3单元。
“统计学显著的”是指结果不可能偶然发生。统计学显著性可以通过本领域已知的任何方法确定。显著性的常用度量包含p值,所述p值是在以零假设为真的情况下观察事件所发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平,则拒绝零假设。在简单的情况下,显著性水平被定义为0.05或更小的p值。
“基本上”是指几乎全或完全,例如,一些给定数量的95%、96%、97%、98%、99%或更高。
“转化”是指由于外源DNA摄入和掺入宿主细胞基因组而导致的细胞中的永久性可遗传的改变;以及外源基因从一种生物到另一种生物的基因组中的转移。
“载体”是指多核苷酸分子,优选衍生自例如多核苷酸可以插入或克隆到其中的质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子。载体优选地含有一个或多个独特的限制性位点,并且能够在限定的宿主细胞(包含靶细胞或组织或祖细胞或其组织)中自主复制,或者可以与限定的宿主的基因组整合,使得克隆的序列是可复制的。因此,载体可以是自主复制载体,即作为其复制独立于染色体复制的染色体外实体存在的载体,例如线性或闭合环状质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何确保自我复制的手段。可替代地,载体可以是这样一种载体,当其被引入宿主细胞时,其整合到基因组中并与其已整合到其中的染色体一起复制。这种载体可以包含允许重组进入宿主染色体的特定期望位点的具体序列。载体系统可以包含单个载体或质粒、两个或多个载体或质粒(它们一起含有待引入宿主细胞基因组的总DNA)、或转座子。载体的选择通常取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。在本发明的情况下,载体优选地是在宿主细胞中可操作地起作用的载体,例如质粒。载体可以包含报告基因,例如绿色荧光蛋白(GFP),其可以与一个或多个编码的多肽框内融合,或单独表达。载体还可以包含选择标志,例如抗生素抗性基因,其可以用于选择合适的转化体。
术语“野生型”是指当从天然存在的来源分离时具有所述基因或基因产物的特点的基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如,多肽)是在群体中最常观察到的,因此被任意地设计为基因的“正常”或“野生型”形式。
如本文使用,“异源的”是指非天然存在的元件的组合。例如,异源DNA是指天然不在细胞中或不在细胞的染色体位点中的DNA。预期异源DNA包含细胞的外源基因。异源表达调控元件是与不同于其在自然界中可操作地相关的基因可操作地相关的元件。
如本文使用,术语“同源的”是指具有“共同进化起源”的蛋白质之间的关系,包含来自超家族的蛋白质(例如,免疫球蛋白超家族)和来自不同物种的同源蛋白质(例如,肌球蛋白轻链等)(Reeck等人,《细胞(Cell)》,50:667,1987)。无论是在百分比相似性方面还是在保守位置存在具体残基或基序方面,这些蛋白质(及其编码基因)具有序列同源性,如其序列相似性所反映。
如本文使用,术语“表达”是指允许或使基因或DNA序列中的信息变得明显,例如通过激活相应基因或DNA序列的转录和翻译中涉及的细胞功能来产生蛋白质。DNA序列在细胞中或由细胞表达以形成“表达产物”,例如蛋白质。表达产物本身,例如所得的蛋白质,也可以被称为是“表达的”。表达产物在各个方面表征为细胞内、细胞外或分泌。术语“细胞内”是指在细胞内部。术语“细胞外”是指在细胞外部,例如跨膜蛋白。如果某一物质从细胞上或细胞内部的某处在细胞外部以显著度量出现,则其是由细胞“分泌”的。
如本文使用,“转染”是指将外源核酸引入细胞中。术语“转化”是指将“外来”(即外源、异源、外部或细胞外)基因、DNA或RNA序列引入胚胎干(ES)细胞或原核,以便细胞表达引入的基因或序列以在转基因动物中产生期望的物质。
如本文使用,当RNA聚合酶将编码序列转录成RNA时,编码序列在细胞中是在转录和翻译控制序列“的控制下”的,与转录和翻译控制序列“可操作地连接”或与转录和翻译控制序列“可操作地相关”,所述RNA然后进行反式RNA剪接(如果它含有内含子),并且在mRNA的情况下被翻译成由编码序列编码的蛋白质。
如本文使用,“转基因动物”是非人动物,其中动物的一种或多种细胞(优选基本上所有细胞)含有通过人为干预(例如,通过本领域已知的转基因技术)引入的转基因。通过有意的遗传操作,例如通过显微注射或通过用重组病毒感染,可以通过引入细胞前体直接或间接地将转基因引入细胞中。
如本文使用,本文所用的术语“基因组”可以是指来自患者、组织、器官、单细胞、肿瘤、取自患者的有机流体样本、自由循环的核酸、真菌、原核生物和病毒的序列,即DNA、RNA或cDNA。
本文所用的“嵌合”(例如,“嵌合动物”或“嵌合肝脏”)旨在描述包含异种组织或细胞的器官或动物。
基因序列的“敲除”是指基因序列的改变,其导致靶基因功能的降低,优选地使得靶基因表达不可检测或不显著。转基因敲除动物可以包含靶基因的杂合敲除或靶基因的纯合敲除。本文所用的“敲除”还包含条件性敲除,其中靶基因的改变可以在例如将动物暴露于促进靶基因改变的物质时,引入促进靶基因位点(例如,Cre-lox系统中的Cre)处的重组的酶时,或进行用于在出生后指导靶基因改变的其它方法时发生。
靶基因的“敲入”是指宿主细胞基因组的改变,其例如通过引入靶基因的另外的拷贝或通过可操作地插入提供靶基因内源拷贝的增强表达的调控序列导致了靶基因的表达改变(例如,表达增加(包含异常)或降低)。“敲入”转基因可以包含靶基因的杂合敲入或靶基因的纯合敲入。“敲入”还涵盖条件性敲入。
本文使用的术语“治疗”等通常是指获得期望的药理学和/或生理学作用。所述作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良作用而言可以是治疗性的。本文所用的“治疗”涉及对哺乳动物,特别是人的疾病的任何治疗,并且包含:(a)在可能易患疾病但尚未被诊断为患有所述疾病的受试者中预防疾病发生;(b)抑制疾病,即阻止其发展;或(c)缓解疾病,即使疾病消退。
本公开的实施例涉及一种转基因小鼠,其基因组包含Pou4f3基因的破坏。在一些实施例中,所述转基因小鼠表现出相较于野生型小鼠的听觉能力降低的听觉能力和/或表现出DFNA15疾病的症状。
一些实施例进一步涉及一种测试试剂对DFNA15疾病的一种或多种症状的治疗功效的方法。在一些实施例中,所述方法可以包含将一种或多种待测试的试剂应用于其基因组可以包含Pou4f3基因的破坏的转基因小鼠。在一些情况下,所述转基因小鼠表现出相较于野生型小鼠的听觉能力降低的听觉能力和/或表现出DFNA15疾病的症状。此外,可以确定DFNA15疾病的一种或多种症状是否由于应用所述一种或多种试剂而改变。
一些实施例涉及一种用于制备转基因小鼠的方法。在一些实施例中,所述方法可以包含破坏小鼠的胚胎干细胞中的Pou4f3基因以生成从小鼠分离的胚胎干细胞或体细胞,以生成胚胎。所述方法可以进一步包含将所述胚胎干细胞或所述胚胎转移到受体雌性小鼠中,使得所述转基因小鼠的基因组可以包含Pou4f3基因的破坏。在某些实施例中,所述转基因小鼠表现出相较于野生型小鼠的听觉能力降低的听觉能力和/或表现出DFNA15疾病的症状。
常染色体显性耳聋-15(DFNA15)是进行性非综合征性感觉神经性听觉丧失的一种形式,在生命的第二个和第六个十年之间语后发作。DFNA15症状的例子包含先天性听觉丧失、进行性听觉丧失和平衡能力受损。尽管认为DFNA15与Pou4f3基因的突变有关,但由于不可能收集人体活检,其病理一直未知。本公开的实施例在具有家族H的Pou4f3基因突变的小鼠中提供了一种DFNA15疾病模型。例如,突变小鼠(Pou4f3Δ/+)具有小鼠Pou4f3基因的杂合破坏并且以DFNA15患者的类似方式表现出进行性听觉丧失和前庭功能障碍。突变柯蒂氏器的组织学研究表现出具有长且融合的静纤毛的进行性备用内毛细胞。突变小鼠的外毛细胞表现出稍长但较少的静纤毛以及无序的细胞体。内毛细胞和外毛细胞均具有退行性改变,如线粒体较少所证明。令人惊讶的是,突变耳蜗表现出Espin的过表达,所述Espin是用于听觉发育和静纤毛维持的基因。生化分析表明Pou4f3可以转录抑制Espin表达,并且Pou4f3突变消除了这种影响。由Pou4f3突变进行的Espin过表达似乎有助于DFNA15病理学研究。因此,对本动物模型(Pou4f3△/+)小鼠的观察表明患者的DFNA15耳聋的病理改变,并且这种动物模型可以用于开发治疗方法,因为可以对候选药物和其它治疗方法对这些动物的症状的影响进行评价。
Pou4f3突变与DFNA15耳聋相关,所述DFNA15耳聋是进行性听觉丧失的常见常染色体显性形式。与其它遗传性听觉障碍相似,DNFA15耳聋迄今尚无适当的治疗方法或药物。阻碍治疗发展的障碍是由于难以从人体获得耳蜗活检而使疾病的机械病理变得神秘。为了解决这个问题,通过动物模型进一步分析了DFNA15耳聋的病理。
DFNA15患者一般患有全音频听觉损伤,在青春期有一些明显的高音感觉神经性听觉损伤,并且听觉损伤随时间逐渐变得严重。患者最终表现出在所有频率上跨频率的显著听觉丧失。此外,一些患者的前庭功能也可能受到影响。在人Pou4f3的外显子2中标识的8碱基对缺失与患者相关。Pou4f3是POU转录因子家族的成员,其调节广泛的神经内分泌发育途径。本家族的特征在于存在被称为POU结构域的二分DNA结合结构域,其可以包含POU-同源结构域和由连接子分开的POU特异性结构域。所有这些组分都是序列特异性DNA结合所必需的。
本公开提供的突变小鼠表现出与进行性听觉丧失的表现一致的症状。此外,来自突变小鼠的耳蜗的IHC和OHC细胞表现出多种听觉细胞病理,例如IHC中较少、融合且变长的静纤毛和OHC中变长的静纤毛。听觉细胞表现出退行性病变,如线粒体较少所证明。鉴于功能表型的高度相似性以及突变小鼠和人类患者之间的表型发生,Pou4f3△/+小鼠的组织学病理可以用作DFNA15耳蜗的病理学研究的动物模型。
在一些实施例中,Pou4f3基因的破坏可以包含Pou4f3基因的杂合破坏,并且转基因小鼠表达野生型Pou4f3基因。在其它实施例中,Pou4f3基因的破坏可以包含Pou4f3基因的纯合破坏,并且转基因小鼠不表达野生型Pou4f3基因。在一些实施例中,Pou4f3基因的破坏可以包含Pou4f3基因的一个或多个核苷酸的纯合或杂合缺失和Pou4f3基因的C/T转换。在一些实施例中,Pou4f3基因的破坏是Pou4f3基因的外显子2的一部分的缺失。在某些实施例中,转基因小鼠的Pou4f3基因的外显子1未被破坏。
本公开进一步涉及惊人的发现Pou4f3敲除(Pou4f3+/-和Pou4f3-/-)的表型不同于Pou4f3△/+和Pou4f3△/△小鼠的表型。例如,Pou4f3-/-小鼠表现出耳聋并且缺少IHC和OHC细胞,而Pou4f3+/-小鼠在胚胎期和产后期看起来正常。相反,Pou4f3△/+和Pou4f3△/△小鼠在幼年期均表现出正常的耳蜗,但是听觉损伤的程度在成年期有所不同。这种表型差异意味着完整的Pou4f3基因与耳蜗发育有关,并且Pou4f3基因的C末端与成年人的静纤毛维持相关。Pou4f3通过不同的调控结构域与时空有关地调节耳蜗发育和听觉功能所必需的多个基因。Pou4f3的这种复杂的调控机制可能有助于理解患有Pou4f3基因的不同突变的DFNA15患者的各种临床表型。
在一些实施例中,一种或多种试剂可以包含调节Espin表达的试剂。在一些实施例中,调节Espin表达的试剂与视黄酸信号传导途径相关。
作为POU转录因子家族的成员,Pou4f3可能通过复杂的方式调节多个靶基因(例如,Bdnf、NT-3、Gfi1和Lhx3)。DFNA15中Pou4f3的突变预期会损害本调控机制并影响靶基因的表达。令人惊讶的是,靶基因(包含Bdnf、NT-3、Gfi1和Lhx3)的表达在突变耳蜗中没有改变,这与体外测定不一致。令人惊讶的是,已发现Espin基因表达在突变耳蜗中升高。体外测定证明,本Pou4f3的突变导致Espin表达增加,表明Pou4f3可能用作为耳蜗中Espin表达的负调节因子。Espin可能存在于所有年龄段(包含成年期和胚胎形态发生期)的毛细胞静纤毛中,并且用作为肌动蛋白成束蛋白并且是静纤毛平行肌动蛋白束的组装和稳定化所必需的。Espin的平衡水平对于严格控制每个静纤毛的物理尺寸是重要的。特别地,Espin的过表达可能会在耳蜗中产生长静纤毛,这与DFNA15疾病小鼠的病理一致。这种表型相似性强烈地表明过表达的Espin在DFNA病理中的作用。
在一些实施例中,DFNA15疾病的症状可以包含进行性听觉丧失和平衡能力受损中的至少一种。在一些实施例中,在应用一种或多种试剂之前和之后,对转基因小鼠进行一种或多种测试,所述一种或多种测试包括听性脑干反应(ABR)、畸变产物光声发射(DPOAE)和转棒测试中的至少一种。此外,确定一种或多种测试的结果是否由于应用一种或多种试剂而改变。
进行性听觉丧失的症状可以包含在暴露于大声噪音之后的或随年龄的进行性听觉丧失,听高频声音困难,谈话期间难以区分单词(特别是在嘈杂或拥挤的情况下),和/或听电话困难。平衡能力受损的症状包含听觉受损,无论是永久性还是波动性,其都会对受试者的表现产生不利影响。在一些实施例中,进行性听觉丧失的症状可以包含感觉摇晃或头晕,并且不能静止站立。
听性脑干反应(ABR)或听性诱发电位(AEP)测试提供有关内耳(耳蜗)和听觉脑通路的信息。所述测试可以用于难于进行常规听觉筛查行为方法的受试者。ABR还针对受试者指示表明大脑或脑通路中听觉丧失类型的征兆、症状或不适。例如,ABR可以通过以下来进行:将电极粘贴在头部上——类似于运行心电图时将电极放置在心脏周围——并且响应于声音记录脑电波活动。所测试的受试者在进行测试时安静地休息或睡觉,无需回应。ABR也可以用作新生儿听觉筛查计划的筛查测试。当用作筛查测试时,仅对一个强度或响度水平进行检查,婴儿或者通过筛查或者未通过筛查。
畸变产物耳声发射(也被称为组合音)是在给定听觉输入中的频谱分量之间的物理和生理相互作用时在听者耳朵内生成的声音。由扬声器生成的声音与听者耳朵中生成的声音之间的关系为探索声音中的空间深度提供了肥沃的土壤。
转棒性能测试是基于转棒的性能测试,其通常由啮齿动物施加强制运动活动进行。测试测量参数,如骑棒时间(秒)或耐力。
在一些实施例中,所述一种或多种测试的结果的改善表明试剂对DFNA15疾病的一种或多种症状的治疗功效。
一些实施例进一步涉及一种如上所述的转基因小鼠的分离组织。
一些实施例进一步涉及一种治疗(例如,减轻)受试者的DFNA15疾病的一种或多种症状的方法。在一些实施例中,所述方法可以包含向受试者施用一定量的降低Epsin表达或活性的试剂,所述量其足以减轻DFNA15疾病的一种或多种症状。在某些实施例中,所述试剂可以包含抑制受试者的视黄酸信号传导途径的抑制剂。在一些实施例中,视黄酸可以促进耳蜗中的Espin表达。例如,在用DEAB(其是一种导致内源性视黄酸较少产生的ALDH抑制剂)治疗患有DFNA15疾病的受试者时,可以降低受试者的ABR值。在一些实施例中,可显著降低受试者的ABR值。
尽管已经参考特定实施例描述了本公开,但是应当理解,这些实施例是说明性的,并且本公开范围不限于此。本公开的替代实施例对于本公开所属领域的普通技术人员来说将是显而易见的。这种替代实施例被认为是涵盖在本公开的范围内。因此,本公开的范围由所附权利要求限定并且由前面的描述支持。
实施例仅用于说明本公开,而并非旨在限制本公开的范围。应当理解,对于本技术领域的技术人员而言,在不脱离本公开的原理的情况下,可以进行某些修改和改进,并且其应被视为在本公开的保护下。
实例
Pou4f3突变小鼠的生成
在家族H中,Pou4f3基因(基因ID:5459)通过8bp缺失突变,这导致密码子295处的编码框移位和在位置299处的过早翻译终止。为了将相同的突变引入小鼠,设计了用于敲入(Ki)策略的靶载体。在本载体中,使小鼠Pou4f3基因(基因ID:18998)相应区域的8bp(参见SEQ ID NO:1)缺失,并通过将C逆转为T(C/T)产生新的终止密码子(图1)。将靶载体电穿孔到129S6胚胎干细胞中,并通过DNA印迹分析筛选同源重组体。通过将阳性重组ES细胞注射到胚胎中获得嵌合小鼠。通过基因组PCR和DNA印迹标识后代的种系传递。PCR引物对示于SEQ ID NO:2和3。这里使用的所有小鼠都是无特定病原体(SPF)的动物,其被保持在中国国家突变小鼠资源中心(NRCMM)的标准动物室中。所有实验均由动物护理和使用委员会批准,并根据南京大学模式动物研究所的动物方案(许可号AP#MZ15)进行。
蛋白印迹分析
从小鼠中新鲜分离出完整的耳蜗基底膜,并用含有2%SDS、10mM二硫苏糖醇、10%甘油、微量溴酚蓝和50mM Tris HCl,pH 7.4的裂解缓冲液在4℃下裂解。在均质化和离心之后,将蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转移至PVDF膜。膜分别用抗Pou4f3(Abcam,UK)、抗-β-肌动蛋白(Sigma,USA)、抗-Espin(abcam,UK)和抗-GAPDH(Sigma,USA)抗体进行探测,然后再与相应的第二抗体一起温育。通过与ECL底物(Mucyte Co.,Ltd,Nanjing)一起温育来观察信号。
ABR和DPOAE测量
为了评估小鼠的听觉功能,如先前所述测量听性脑干反应(ABR)。对使用由SigGen32软件驱动的诱发生成工作站系统III(Tucker Davis TechnologiesIncorporated,Gainesville,FL,USA)生成的8、16和32kHz的短声和短音的响应求平均(n=1024)并且从110dB到0dB显示,以5dB步进减小。记录ABR波形,其可以用于判断阈值并量化波幅。每组至少测试四只动物,分别取5周龄、2-3月龄、4-5月龄、6-7月龄和8-9月龄的对照小鼠和Pou4f3△/+小鼠进行测试,其中对照小鼠的数量分别为28只、29只、17只、17只、7只,Pou4f3△/+小鼠的数量分别为26只、27只、15只、20只、5只。这里使用5周龄和2-3月龄以8kHz、16kHz和32kHz在超阈值强度水平(40dB到60dB)下的波I幅度的量化来检测早期听觉缺陷的突变。使用SigGen32软件驱动的诱发生成工作站系统III(Tucker Davis TechnologiesIncorporated,Gainesville,FL,USA)测量畸变产物光声发射(DPOAE)。频率为2f1-f2的DPOAE通过使用两个主要音调刺激f1和f2引发,其中声压水平分别为75和65dB SPL,f2/f1=1.20。在腹膜内麻醉后,将定制的塑料耳塞(直径3mm)插入耳道。以4、8、12、16、24和32kHz的f2频率测量DPOAE幅度,并在减去噪声基底幅度后对其进行绘制。
转棒测试
在下午用加速转棒(UGO Basile Accelerating Rotarod,Italy)测试小鼠运动协调和平衡。将所有动物放在带纹理的桶上以避免滑倒。当动物掉落到各个感应平台上时,记录测试结果。对于每个2分钟周期,转棒的速度被设置为12和20rpm。给小鼠进行三次试验,试验间休息间隔为30-60分钟。使用具有重复测量的双因素ANOVA分析转棒数据。
组织学检查
用过量麻醉处死小鼠,然后注入磷酸盐缓冲溶液(PBS)。用4%多聚甲醛(PFA)固定分离的耳蜗。在摇床上用10%(W/V)乙二胺四乙酸(EDTA)进行脱钙3天,然后再使用乙醇梯度脱水。将脱水的样本穿透并用MC-Plastic I试剂盒(MuCyte,Nanjing)在4℃下包埋过夜。切割包埋块并用苏木精/曙红(H&E)染色。
SEM和TEM
在过量麻醉后,通过用含有2.5%戊二醛的PBS灌注来固定小鼠。分离内耳组织并用10%(W/V)EDTA脱钙2天。暴露柯蒂氏器的上皮细胞,然后用1%OsO4的H2O溶液中固定2小时。对于SEM(扫描电子显微镜)检查,将组织在乙醇系列中脱水并进行点干燥。将干燥的样品安装在短柱上,用金溅射涂覆并在S-3000N扫描电子显微镜(Hitachi,Tokyo,Japan)上以15kV进行检查。对于TEM(透射电子显微镜)检查,将样品脱水,浸润并在爱牢达中聚合。将超薄切片(70nm)后染色并在Hitachi-7650透射电子显微镜下以70kV检查。
定量PCR(Q-PCR)
使用RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa,Japan)从来自小鼠的新鲜耳蜗基底膜提取总RNA。通过使用HiScriptTM Q RT Super Mix(Vazyme,China)进行逆转录反应,并使用Rremix Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa,Japan)和Step One Plus TM实时PCR系统进行q-PCR。用于各个基因的引物对描述于:NT-3(F)SEQ ID NO:4、(R)SEQ ID NO:5;Bdnf(F)SEQID NO:6、(R)SEQ ID NO:7;Gfi1(F)SEQ ID NO:8、(R)SEQ ID NO:9;Lhx3(F)SEQ ID NO:10、(R)SEQ ID NO:11;Gapdh(F)SEQ ID NO:12、(R)SEQ ID NO:13。
荧光素酶测定
用高保真聚合酶ExTaq从C57/BL6小鼠尾DNA扩增小鼠Espin基因(基因ID:56226)的调控区的3.5Kb片段。引物示于SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15,其中SEQ ID NO:16的核苷酸序列和SEQ ID NO:17的核苷酸序列分别是Kpn I和Mlu I的限制性位点。通过测序确认PCR产物,然后将其连接到含有荧光素酶报告基因的pGL3-Basic载体(Takara,Japan)中。所得的报告基因pGL-Espin与内部对照pRL-TK一起在HEK293中转染。根据制造商的说明,在于GloMax96发光读数器中用双荧光素酶报告基因测定系统(均来自Promega,Madison,WI,USA)转染后24小时测量萤火虫和海肾荧光素酶活性。通过海肾荧光素酶活性来归一化相对荧光素酶活性。所有实验独立地重复至少三次。
Pou4f3△/+小鼠的建立
建立了具有8bp缺失和小鼠Pou4f3基因的C/T逆转的小鼠系(图1A)。通过DNA印迹分析和测序确认靶ES细胞中的Pou4f3等位基因的突变(图1B)。将具有129:B6遗传背景的Ki小鼠与C57BL/6小鼠回交9代,并将所得的杂合体(Pou4f3Δ/+)用作DFNA15疾病模型。对具有尾基因组DNA的Pou4f3Δ/+小鼠的基因分型分析示出了大小为542bp的特异性PCR产物,表明突变的种系传递成功(图1D)。蛋白印迹分析示出了Pou4f3Δ/+的耳蜗中预期的截短POU4F3蛋白的小条带(图1E)。Pou4f3Δ/+和Pou4f3+/+小鼠均表现出正常的外观(图1C)、行走行为、体重和血压。幼仔(包含Pou4f3Δ/+、Pou4f3Δ/Δ或Pou4f3+/+)以预期的孟德尔比率出生。雄性和雌性Pou4f3Δ/+和Pou4f3Δ/Δ小鼠均可生育并达到成年期,没有任何明显的结构或功能异常,这与DFNA15患者一致。
Pou4f3Δ/+小鼠表现出与DFNA15患者相当的内耳表型
人DFNA15耳聋表现为语后进行性听觉丧失和前庭功能障碍。使用听性脑干反应(ABR)、畸变产物光声发射(DPOAE)和转棒测试在Pou4f3Δ/+小鼠中测量耳蜗和前庭功能。
Pou4f3Δ/+突变小鼠早在出生后5周就表现出纯音ABR阈值的增加。典型的ABR峰型图记录如图2A中所示。16kHz的阈值从对照的18.45±1.00dB显著地提高到25.74±1.76dB(p<0.01),而频率为8kHz和32kHz的阈值略有增加,没有统计学显著性(p>0.05)(图2,B、C、D、E)。随着年龄的增长,突变小鼠的ABR阈值在更多的音调频率下进一步升高,甚至在短声时也是如此。例如,Pou4f3Δ/+小鼠(4-5月龄)对短声的ABR阈值(22.33±2.12dB与15.00±1.21dB,p<0.01)、对16kHz的ABR阈值(30.67±3.23dB与20.59±1.54dB,p<0.001)和对32kHz的ABR阈值(87.00±7.70dB与62.35±6.05dB,p<0.01)显著高于对照,但是8kHz下的ABR阈值增加,没有统计学显著性(38.67±3.18dB与29.71±2.55dB,p>0.05)(图2B、2C、2D、2E);6-7月龄的Pou4f3Δ/+小鼠表现出大规模的听觉损伤,特别是在32kHz下(97.50±4.31dB与84.41±6.24dB,p<0.01)。本观察结果表明,Pou4f3Δ/+小鼠对于高频纯音表现出进行性听觉损伤,对于短声表现出中度损伤,对于低频(8kHz)表现出轻微损伤。
响应于短声或短音的ABR波形通常在小鼠中含有五个峰(波I-V)(图2F),其中波I幅度可以反映小鼠耳蜗听神经的总活动。进行5周龄和2-3月龄以8kHz、16kHz和32kHz在超阈值强度水平下的波I幅度的量化(图2F、2G)。在60dB强度下,Pou4f3Δ/+小鼠在5周龄时表现出各自短音频率的波I幅度明显减少(平均12.56μv)(p<0.05,双向方差分析)(图2F)和2-3月龄时的显著减少(平均16.70uv)(p<0.001,双向方差分析)(图2G)。响应于16kHz测量40dB-60dB强度下的波I幅度,并且在5周龄突变小鼠中也发现显著减少(p<0.001,双向方差分析)(图2H)。本观察结果表明Pou4f3Δ/+小鼠中耳蜗听神经活动的影响。
DPOAE反映了功能性外毛细胞衍生的耳蜗放大器对听觉的灵敏度和音频的选择性。当ABR阈值明显升高时,测量4-6月龄Pou4f3Δ/+小鼠的DPOAE。结果示出了突变小鼠的DPOAE显著降低(p<0.001,双向方差分析,并对所有频率下的显著性进行成对事后比较检验)(图2I),表明外毛细胞也受Pou4f3突变的影响。
为了测试突变小鼠的前庭功能,进行了转棒测试。将小鼠置于转桶上并对在不同时间点从桶上跌落的小鼠进行计数。在12rpm的速度下,77.78%的Pou4f3△/+小鼠在120秒内从棒上跌落,而对照小鼠则为27.27%(图3A)。随着棒的速度增加到20rpm,100%的突变小鼠在54秒内跌落,而35.36%的对照小鼠仍然能够在棒上停留长达120秒(图3B)。统计学测试示出了Pou4f3△/+小鼠相较于对照在12rpm(p<0.05)和20rpm(p<0.005)下具有显著下降的跌落潜伏期,提示Pou4f3△/+小鼠前庭功能受损。
如上所述,Pou4f3△/+小鼠在ABR阈值、波I幅度、DPOAE以及转棒测试中的短潜伏期方面都表现出Pou4f3△/+小鼠的进行性表型异常。为了检查其与DFNA15A患者的表型相关,从先前报道的DFNA15患者(家族H)收集临床数据,并将之与不同年龄的ABR阈值(表1)进行比较。根据对与人类年龄相对应的小鼠年龄的估计,2-3月龄的小鼠对应为20-30岁的患者,8-9月龄的小鼠对应为41-50岁的患者,并且11-12月龄的小鼠对应为51-60岁的患者(表1)。平均而言,2-3月龄的小鼠和20-30岁的患者均未表现出明显的听觉丧失,而8-9月龄的小鼠和41-50岁的患者在较高频率音调下表现出ABR阈值增加。有趣的是,几乎所有11-12月龄的小鼠都表现出高ABR阈值(>70dB),表明小鼠中出现了一致的耳聋。然而,一些51-60岁的患者仍然具有相对较小的ABR阈值,但是平均阈值升高。这种表型变化可能反映了受POU4F3影响的多种基因相互作用。这表明,Pou4f3△/+小鼠表现出与家族H患者相当的表型发病和进展,但患者的表型可能更加多变。
表1.家族H患者和Pou4f3△/+小鼠的ABR比较
Pou4f3△/+小鼠耳蜗的病理学研究
由于大多数Pou4f3△/+小鼠在4-5月龄内表现出明显的听觉损伤而对照小鼠没有,因此分析了该年龄的突变耳蜗。应用H&E染色的横截面耳蜗示出了清晰的耳蜗组织整体结构,包含盖膜、内毛细胞、亨森氏细胞和周围的其它细胞,外毛细胞的无组织核除外(图4)。在SEM下分析突变柯蒂氏器的超微结构改变。在来自4月龄小鼠的对照柯蒂氏器中,观察到一排清晰的IHC和三排清晰的OHC,其中IHC的静纤毛排列成几个轻微弯曲的行,每行具有适度确定的长度,并且OHC的静纤毛排列成三个明显可辨别的行,具有特有的“V”形状(图5A)。然而,在Pou4f3△/+小鼠中,来自4月龄小鼠的柯蒂氏器的一些IHC表现出静纤毛的融合和过度生长。如图5中所示,这种形态学变化随后变得更加严重。在6月龄小鼠中,突变柯蒂氏器在IHC细胞中表现出多余的静纤毛,高度融合且显著长的静纤毛(图5B、5C、5D、5E),一些OHC行消失(图5B)。根据SEM图像测量来自顶端和中部耳蜗膜的静纤毛的长度(图5H和K)。不同层的突变静纤毛的长度分别比对照长43%(顶端:5.27±0.56与3.69±0.02um,p<0.01)和34%(中部:3.66±0.73与2.73±0.01um,p<0.05)(图5L)。在顶端和中部区域量化突变柯蒂氏器的OHC静纤毛的数量。由于很难对整排OHC中的所有静纤毛进行计数,所以对半排静纤毛进行计数(图5I和J和K)。结果表明,突变小鼠的静纤毛数量显著低于对照的静纤毛数量(Pou4f3△/+的顶端:9.96±0.26与对照的顶端:12.71±0.30,p<0.01;Pou4f3△/+的中部:10.88±0.30与对照的中部:13.40±0.37,p<0.01)(图5M)。
为了检查突变毛细胞的结构,进行TEM(透射电子显微镜)分析。结果表明,突变IHC和OHC具有正常的核、表皮板、细胞器和紧密连接。有趣的是,突变IHC和OHC表现出线粒体减少50%,并且在线粒体中观察到多个空泡(图6)。本观察结果提示两种听毛细胞发生了退行性改变。
Espin的过表达可能是DFNA15A表型改变的基础。
作为转录因子,POU4F3可能调节几种靶基因的表达。为了确定涉及DFNA15疾病病理的效应基因,制备来自对照和Pou4f3△/+耳蜗组织的mRNA,然后进行微阵列和实时PCR分析。具有2倍减少的基因包含离子通道(例如,氯离子通道和非选择性钠泄漏通道)、基质蛋白(例如,纤维蛋白原α链)、嗅觉受体;具有显著升高的基因包含蛋白酪氨酸磷酸酶、半胱天冬酶7等。功能预测暗示了这些基因不太可能参与这些小鼠的听觉丧失过程。由于Bdnf、NT-3、Gfi1、Lhx3已被报道为Pou4f3的靶标,因此测量了它们在突变耳蜗膜中的mRNA表达水平。令人惊讶的是,没有观察到这些基因有显著的表达差异(图7A)。测量突变耳蜗中其它听觉相关基因的表达水平。作为肌动蛋白成束蛋白,Espin参与了静纤毛的发育,并且Espin的缺失导致异常细、短的静纤毛,而Espin的过表达则导致听觉细胞纤毛的过度生长。在突变耳蜗中测量Espin mRNA和蛋白质表达。Q-PCR测定示出了相较于对照的突变组织的EspinmRNA增加了60%(图7A)。与此相一致的是,突变耳蜗组织中Espin的蛋白质表达水平几乎增加2倍(图7B、7C)。为了确定Pou4f3对Espin表达的调节是直接调节,先预测了Espin基因上游的顺式元件,再制备Espin基因上游的WA片段(总共3500bp)做为调控区序列,并将其亚克隆到荧光素酶报告基因载体中。用所得的pGL3-Basic-Espin报告基因转染到HEK293细胞中表现出明显的荧光素酶活性,表明在调控区内存在活性启动子。当与野生型可表达Pou4f3的质粒共转染细胞时,荧光素酶活性显著降低(1.00±0.08与0.70±0.04,p<0.01)(图7D),表明对Pou4f3对Espin表达有显著抑制作用。然而,用不同量的突变Pou4f3可表达载体进行转染没有表现出荧光素酶活性的抑制(图7D)。本结果表明Pou4f3能够负调节Espin表达,并且其8bp缺失和C-A逆转的突变可能会消除这种影响。
表2.各种构建体的序列标识符
SEQ ID NO: | 标识符 | |
SEQ ID NO:1 | 8bp缺失 | GCTATCCA |
SEQ ID NO:2 | PCR引物 | TCGACTAGAGCTTGCGGAA |
SEQ ID NO:3 | PCR引物 | GATCTGAAACCACCAACCTC |
SEQ ID NO:4 | PCR引物 | GGAGTTTGCCGGAAGACTCTC |
SEQ ID NO:5 | PCR引物 | GGGTGCTCTGGTAATTTTCCTTA |
SEQ ID NO:6 | PCR引物 | GCCCAACGAAGAAAACCATAAG |
SEQ ID NO:7 | PCR引物 | AGGAGGCTCCAAAGGCACTT |
SEQ ID NO:8 | PCR引物 | AGCTGTGTAACACTACCGTGAGGAT |
SEQ ID NO:9 | PCR引物 | ACCATGATGAGCTTTGCACACT |
SEQ ID NO:10 | PCR引物 | GCAGAATTGTGCACCGTGAA |
SEQ ID NO:11 | PCR引物 | CCAGCCTCCTCCAGTGGAA |
SEQ ID NO:12 | PCR引物 | AAGCAAA GGAGGCTGGCAG |
SEQ ID NO:13 | PCR引物 | TGGTTCAGCCCGTGCAT |
SEQ ID NO:14 | PCR引物 | (GGTACC)AGCCTAGGTTCCAGTTCACC |
SEQ ID NO:15 | PCR引物 | (ACGCGT)CCTCTCTCCAGTCTCAAAGC |
SEQ ID NO:16 | 限制性位点 | GGTACC |
SEQ ID NO:17 | 限制性位点 | ACGCGT |
ALDH抑制剂的施用影响DFNA15动物的听觉功能
向C57/BL6j背景的2月龄Pou4f3△/+小鼠每天腹膜内施用N,N-二乙基氨基苯甲醛(DEAB),剂量为100mg/kg/天,持续38天。将DEAB溶于100%二甲基亚砜DMSO中,并用玉米油稀释至最终的10%DMSO浓度。通过以500mg/kg体重的初始剂量腹膜内注射阿佛丁来麻醉小鼠,并且保持每20分钟递送一次半剂量的麻醉。对使用由SigGen32软件驱动的诱发生成工作站系统III(Tucker Davis Technologies Incorporated,Gainesville,FL,USA)生成的8、16和32kHz的短声和短音的响应求平均(n=500)并且从100dB到5dB显示,以5dB步进减小。在每个ABR波形系列中确定阈值,作为产生至少两个清晰可见波的最低强度。DEAB的保护效果通过给定时间段内dB值的每日变化来评估。数据表示为均值±SEM。误差表示SEM。组间差异通过Student检验来确定显著差异。显著性水平表示如下:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
Claims (18)
1.一种转基因小鼠,其基因组包括Pou4f3基因的破坏,其中所述转基因小鼠表现出相较于野生型小鼠的听觉能力降低的听觉能力和/或表现出DFNA15疾病的症状。
2.一种测试试剂对DFNA15疾病的一种或多种症状的治疗功效的方法,所述方法包括:
将一种或多种待测试的试剂应用于其基因组包括Pou4f3基因的破坏的转基因小鼠,所述转基因小鼠表现出相较于野生型小鼠的听觉能力降低的听觉能力和/或表现出DFNA15疾病的症状;和
确定DFNA15疾病的一种或多种症状是否由于应用所述一种或多种试剂而改变。
3.一种用于制备转基因小鼠的方法,所述方法包括:
破坏小鼠的胚胎干细胞中的Pou4f3基因以生成从小鼠分离的胚胎干细胞或体细胞,以生成胚胎;和
将所述胚胎干细胞或所述胚胎转移到受体雌性小鼠中,使得所述转基因小鼠的基因组包括Pou4f3基因的破坏,其中所述转基因小鼠表现出相较于野生型小鼠的听觉能力降低的听觉能力和/或表现出DFNA15疾病的症状。
4.根据权利要求123所述的、2和3中任一项所述的转基因小鼠,其中所述Pou4f3基因的破坏包括Pou4f3基因的杂合破坏,并且所述转基因小鼠表达野生型Pou4f3基因。
5.根据权利要求1、2和3中任一项所述的转基因小鼠,其中所述Pou4f3基因的破坏包括Pou4f3基因的纯合破坏,并且所述转基因小鼠不表达野生型Pou4f3基因。
6.根据权利要求1、2和3中任一项所述的转基因小鼠,其中所述Pou4f3基因的破坏包括Pou4f3基因的一个或多个核苷酸的纯合或杂合缺失和Pou4f3基因的C/T转换。
7.根据权利要求1、2和3中任一项所述的转基因小鼠,其中所述Pou4f3基因的破坏是Pou4f3基因的外显子2的一部分的缺失。
8.根据权利要求7所述的转基因小鼠,其中所述转基因小鼠的Pou4f3基因的外显子1未被破坏。
9.根据权利要求1到7中任一项所述的转基因小鼠,其中所述DFNA15疾病的所述症状包括进行性听觉丧失和平衡能力受损中的至少一种。
10.根据权利要求2所述的方法,其中所述一种或多种试剂包括调节Espin表达的试剂。
11.根据权利要求9所述的方法,其中所述调节Espin表达的试剂与视黄酸信号传导途径相关。
12.根据权利要求2所述的方法,其中所述确定DFNA15疾病的所述一种或多种症状是否由于应用所述一种或多种试剂而改变包括:
在应用所述一种或多种试剂之前和之后,对所述转基因小鼠进行一种或多种测试,所述一种或多种测试包括听性脑干反应(ABR)、畸变产物光声发射(DPOAE)和转棒测试中的至少一种;和
确定所述一种或多种测试的结果是否由于应用所述一种或多种试剂而改变。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述一种或多种测试的所述结果的改善表明试剂对DFNA15疾病的一种或多种症状的治疗功效。
14.根据权利要求2所述的方法,其中所述一种或多种试剂包括抑制所述转基因小鼠的视黄酸信号传导途径的试剂。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述试剂是N,N-二乙基氨基苯甲醛(DEAB)。
16.一种根据权利要求1所述的转基因小鼠的分离组织或细胞。
17.一种减轻受试者的所述DFNA15疾病的一种或多种症状的方法,所述方法包括向所述受试者施用一定量的抑制所述受试者的视黄酸信号传导途径的试剂。
18.根据权利要求15所述的方法,其中所述试剂是DEAB。
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