CN111166769A - 真皮成纤维细胞在治疗黑色素瘤中的应用 - Google Patents

真皮成纤维细胞在治疗黑色素瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种真皮成纤维细胞在治疗黑色素瘤中的应用，属于生物医学技术领域。本发明通过研究发现，在体外，高水平表达激活转录因子3的真皮成纤维细胞能抑制黑素瘤细胞的增殖和迁移，并伴随着不同细胞因子(包括IL‑6)的下调。在体内，具有高激活转录因子3表达的真皮成纤维细胞降低了肿瘤的形成。向黑色素瘤细胞中添加重组IL‑6可以逆转那些体外和体内的作用，这表明真皮成纤维细胞的激活转录因子3表达可通过IL‑6/STAT3途径调节黑色素瘤的进程，具有良好的实际应用之价值。

Description

真皮成纤维细胞在治疗黑色素瘤中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及真皮成纤维细胞在治疗黑色素瘤中的应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
人皮肤黑色素瘤起源于黑色素细胞增殖失调，是皮肤中最具侵袭性和致命性的肿瘤之一，占皮肤癌相关死亡的80％以上。尽管最近在黑色素瘤的治疗方面取得了一定进展，包括使用免疫检查点抑制剂，但在针对转移性黑素瘤的治疗方案的选择上仍然是捉襟见肘。被激活的BRAF突变被认为是导致黑色素瘤发生的一个主要因素。然而大约80％的良性黑素细胞痣含有BRAF激活突变，但只有一小部分会发展为恶性黑色素瘤。因此，从痣向黑色素瘤恶性转化的潜在机制尚不清晰。
近期研究表明，基质细胞的变化在肿瘤的发生中起着至关重要的作用。肿瘤微环境的主要成分是癌症中活化的成纤维细胞，称为癌相关成纤维细胞(CAFs)。大量研究表明，CAFs分泌大量促进肿瘤细胞增殖和迁移的细胞因子和生长因子的研究表明，衰老的CAF可以促进黑色素瘤的发生和发展，这表明肿瘤微环境的改变可能在黑色素瘤的发生和发展中起重要作用。因此，将CAF作为目标可能为临床治疗黑色素瘤提供潜在的新疗法。转录活化因子3(ATF3)是细胞应激反应中关键的转录因子，在不同组织中具有不同的表达水平和功能。目前发现ATF3可以取决于肿瘤的类型而成为癌基因或抑癌基因。例如，有学者发现在食管鳞状细胞癌(ESCC)病变中ATF3比例下调，而在体外和体内研究中，ATF3过表达可通过调节MDM2的表达导致ESCC细胞的增殖和侵袭性能下降。ATF3在人真皮中也有表达，但是发明人发现，尚无其在人皮肤成纤维细胞(Human dermalfibroblasts,HDFs)或黑色素瘤相关成纤维细胞中功能的报道。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供一种真皮成纤维细胞在治疗黑色素瘤中的应用，本发明通过研究发现，在体外，高水平表达ATF3的真皮成纤维细胞能抑制黑素瘤细胞的增殖和迁移，并伴随着不同细胞因子(包括IL-6)的下调。在体内，具有高ATF3表达的真皮成纤维细胞降低了肿瘤的形成。向黑色素瘤细胞中添加重组IL-6可以逆转那些体外和体内的作用，这表明真皮成纤维细胞的ATF3表达可通过IL-6/STAT3途径调节黑色素瘤的进程，基于上述研究，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种真皮成纤维细胞在制备治疗黑色素瘤产品中的应用。
其中，所述真皮成纤维细胞优选为激活转录因子3(ATF3)高表达的真皮成纤维细胞。
根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗黑色素瘤相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
具体的，所述治疗黑色素瘤至少表现在具有如下任意一种或多种用途：
1)抑制黑色素瘤细胞的增殖；
2)抑制黑色素瘤细胞的迁移；
3)抑制黑色素瘤的形成和生长；
4)细胞因子下调表达。
其中，
所述用途3)中，抑制黑色素瘤的形成和生长具体表现为降低黑色素瘤形成数量和/或平均重量。
所述用途4)中，细胞因子包括但不限于IL-6和IL-8，特别是IL-6。
上述产品可以为药物。
本发明的第二个方面，提供一种治疗黑色素瘤的药物组合物，所述药物组合物由真皮成纤维细胞与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。
在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的真皮成纤维细胞对黑色素瘤具有明显治疗作用。
其中，所述真皮成纤维细胞优选为激活转录因子3(ATF3)高表达的真皮成纤维细胞。
本发明的第三个方面，提供诱导和/或促进真皮成纤维细胞高表达ATF3的物质在制备治疗黑色素瘤产品中的应用。
其中，所述物质包括但不限于环孢菌素A和苯乙双胍。
本发明的第四个方面，提供一种体外抑制黑色素瘤细胞增殖和/或迁移的方法，所述方法包括：将高表达激活转录因子3的真皮成纤维细胞与黑色素瘤共培养。
其中，所述真皮成纤维细胞为人真皮成纤维细胞；为促使真皮成纤维细胞高表达甚至过表达激活转录因子3，可向共培养体系中添加诱导和/或促进真皮成纤维细胞高表达ATF3的物质，如环孢菌素A或苯乙双胍。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
首次报道了真皮成纤维细胞在治疗黑色素瘤中的应用。具体的，研究发现，在体外，高水平表达ATF3的真皮成纤维细胞能抑制黑素瘤细胞的增殖和迁移，并伴随着不同细胞因子(包括IL-6)的下调。在体内，具有高ATF3表达的真皮成纤维细胞降低了肿瘤的形成。向黑色素瘤细胞中添加重组IL-6可以逆转那些体外和体内的作用，这表明真皮成纤维细胞的ATF3表达可通过IL-6/STAT3途径调节黑色素瘤的进程。
上述技术方案实际提供了一种潜在新的黑素瘤治疗方法，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中ATF3在人黑色素瘤基质细胞中的低表达。其中，A、临床黑色素瘤组织中S100和ATF3的免疫组化染色。图中箭头表示黑色素瘤细胞和基质细胞。B、黑色素瘤标本的中ATF3和阴性对照(NC)的RNAscope原位杂交染色。箭头表示基质细胞。C、正常皮肤、黑色素细胞痣和黑色素瘤组织中ATF3和vimentin的双重免疫荧光染色。箭头表示波形蛋白和ATF3染色阳性的基质细胞；箭头表示波形蛋白阳性和ATF3染色阴性的基质细胞。D、对15例正常人皮肤、15例黑色素细胞痣和17例黑色素瘤组织进行ATF3蛋白表达测定的相关分值。*p<0.05，ns：不显著。所有标尺代表20μm。
图2为本发明实施例中在共培养实验中，ATF3过表达的人真皮成纤维细胞(HDFs)抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移。其中，A、ATF3mRNA水平的qRT-PCR分析；B、以GAPDH为加载对照，对三株感染ATF3表达(ATF3-OE)或控制新霉素(NEO)逆转录病毒的HDF进行的ATF3蛋白印迹分析。C-D、与3株高表达ATF3(ATF3-OE)或NEO的HDF菌株共培养指定天数后Mel-JuSo(C)和UACC62(D)黑色素瘤细胞的数量。E、与ATF3-OE或控制NEO-HDFs共培养24小时后迁移的Mel-JuSo和UACC62细胞的图像(左面板)和量化(图表)。标尺代表100μm。
图3为本发明实施例中过表达ATF3的HDFs条件培养基(CM)抑制黑色素瘤细胞生长和迁移；所有条件下均采用ATF3-OE或对照NEO HDF提取的条件培养基。其中，A-B、在指定时间分析Mel-JuSo(A)黑色素瘤细胞和UACC62(B)黑色素瘤细胞的增殖情况。C、进行细胞克隆形成试验；柱状图显示每组形成的细胞克隆的平均数量。D、培养24小时后迁移的黑色素瘤细胞；柱状图显示迁移细胞的平均数量。E-F、伤口愈合试验，左面板显示抓伤后即刻(0H)和抓伤后24h(24H)的Mel-JuSo(E)和UACC62(F)细胞图像，右面板显示24h伤口愈合百分比。标尺代表5mm(C)和100μm(D，E)。
图4为本发明实施例中ATF3过表达抑制HDFs中促炎细胞因子IL-6和IL-8的表达；其中，A、在ATF3-OE-HDFs和对照组NEO-HDFs环境下，采用qRT-PCR方法检测细胞因子、生长因子和CAF相关基因的mRNA水平。B、以A的同样方式，用qRT-PCR方法检测两个HDF池中CRISPR/Cas9介导的独立小分子rna(ATF3-SG1或ATF3-SG2)介导的ATF3缺失基因的mRNA水平，并与空白载体(CON-V)导入的对照组进行比较。C-D、在ATF3-OE或对照新高密度脂蛋白(C)条件培养基，和以CRISPR/Cas9介导的ATF3(ATF3-SG1或ATF3-SG2)或对照载体(CON-V)(D)缺失的高密度脂蛋白条件培养基中，用酶联免疫吸附法测定IL-6、IL-8和TNFα的蛋白浓度。
图5为本发明实施例中过表达HDFs的ATF3可通过调节IL-6/STAT3途径抑制黑色素瘤细胞增殖和迁移。A-F、源于ATF3-OE或对照新HDFs的条件培养基，与10ng/ml重组人IL-6(ATF3-OE+rhIL-6)孵育的ATF3-OE-HDFs，用于培养黑色素瘤细胞系Mel JuSo和UACC62，分析其生长(A-B)、细胞克隆形成(C)、反式迁移(D)，伤口愈合(E)和所示信号蛋白的磷酸化(活性)状态(F)。C-F分析的量化结果如右侧图所示。F中磷酸化STAT3的相对水平与相应的总的STAT3等次划分标准相一致。图像中的标尺表示5mm(C)和100μm(D，E)。
图6为本发明实施例中ATF3过表达HDF抑制体内黑色素瘤的形成和生长；其中，A、在规定条件下，移植后3周收集的小鼠和肿瘤，腹腔注射rhIL-6(100ng/只/天)。B、肿瘤形成的百分比。C、肿瘤的平均重量。D-E、在指定的时间收集经1.5mM苯乙双胍(Phen.)、10μMCs-A或DMSO载体(CON)预处理24小时的D-E.HDFs，以分析ATF3、IL-6和IL-8。F-G、分析从预处理的HDFs中提取条件培养基的IL-6和IL-8水平。H-I、在指定时间点，用预处理HDFs的条件培养基培养黑色素瘤细胞之后，CCK-8法即可检测。J-K.移植后3周按指定条件收集小鼠和肿瘤。肿瘤形成百分比和平均肿瘤重量在K中表示。标尺：5mm。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，尚无其在人皮肤成纤维细胞(Human dermalfibroblasts,HDFs)或黑色素瘤相关成纤维细胞中功能的报道。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供真皮成纤维细胞在制备治疗黑色素瘤产品中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述真皮成纤维细胞优选为激活转录因子3(ATF3)高表达的真皮成纤维细胞。
根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗黑色素瘤相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
本发明的又一具体实施方式中，所述治疗黑色素瘤至少表现在具有如下任意一种或多种用途：
1)抑制黑色素瘤细胞的增殖；
2)抑制黑色素瘤细胞的迁移；
3)抑制黑色素瘤的形成和生长；
4)细胞因子下调表达。
本发明的又一具体实施方式中，所述用途3)中，抑制黑色素瘤的形成和生长具体表现为降低黑色素瘤形成数量和/或平均重量。
本发明的又一具体实施方式中，所述用途4)中，细胞因子包括但不限于IL-6和IL-8，特别是IL-6。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述真皮成纤维细胞在制备抑制黑色素瘤细胞增殖的产品中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述真皮成纤维细胞在制备抑制黑色素瘤细胞迁移的产品中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述真皮成纤维细胞在制备抑制黑色素瘤形成和生长的产品中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，上述产品可以为药物。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗黑色素瘤的药物组合物，所述药物组合物由真皮成纤维细胞与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等，特别优选的是人。
在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的真皮成纤维细胞对黑色素瘤具有明显防治作用。
本发明的又一具体实施方式中，所述真皮成纤维细胞优选为激活转录因子3(ATF3)高表达的真皮成纤维细胞。
本发明中，所述激活转录因子3(ATF3)高表达的真皮成纤维细胞意为促使真皮成纤维细胞过量表达(过表达)激活转录因子3。
本发明的又一具体实施方式中，提供诱导和/或促进真皮成纤维细胞高表达ATF3的物质在制备治疗黑色素瘤产品中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述物质包括但不限于环孢菌素A和苯乙双胍。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种体外抑制黑色素瘤细胞增殖和/或迁移的方法，所述方法包括：将高表达激活转录因子3的真皮成纤维细胞与黑色素瘤共培养。
其中，所述真皮成纤维细胞为人真皮成纤维细胞；为促使真皮成纤维细胞高表达甚至过表达激活转录因子3，可向共培养体系中添加诱导和/或促进真皮成纤维细胞高表达ATF3的物质，如环孢菌素A或苯乙双胍。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
1、材料与方法
1.1体外细胞培养
根据先前描述的方案(Qian et al.,2019,Wen et al.,2018)，从包皮组织中分离出原代HDFs。将HDFs和人黑色素瘤细胞系Mel JuSo和UACC62分别在37℃和5％CO2的环境中，用杜尔贝科改良的鹰氏培养基(DMEM，Gibco，美国)进行培养，加入10％FBS(生物工业，以色列)、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100μg/ml)(ThermoFisher，美国)(全培养基)。
1.2体内肿瘤实验
肿瘤异体移植物的生长和检测如前期文章所述(Wu et al.,2010)。为了测试过表达ATF3的HDFs增加/降低IL-6对8周龄雌性裸鼠(Charles River实验室，威尔明顿，美国马萨诸塞州)体内黑色素瘤细胞生长的抑制作用，以100ng/kg/天/小鼠的剂量，将UACC62黑色素瘤细胞与不同表达水平的ATF3增加/降低人的IL-6的HDFs混合注射入小鼠体内。为检测经环孢素A(Cs-A)预处理的HDFs是否影响黑色素瘤细胞生长，将经10μm Cs-A或DMSO(作为对照)预处理的HDFs与UACC62细胞混合后24小时注射于裸鼠体内。移植后3周无痛致死小鼠，以分析肿瘤体积和肿瘤重量。
2、结果
2.1临床黑色素瘤基质细胞低水平表达ATF3
如图1C所示，在良性痣和正常皮肤组织中观察到表达波形蛋白的基质细胞表达ATF3(图1C)，而在恶性黑色素瘤中大多数波形蛋白阳性的细胞不表达ATF3(图1C)。最后，在黑色素瘤肿瘤、黑素细胞痣和正常皮肤组织样品中进行了波形蛋白和ATF3的双重免疫荧光染色。接下来，通过RNAscope技术检测细胞内的ATF3 mRNA水平。如图1B(右图)所示，在肿瘤细胞中发现了强ATF3表达信号，而在基质细胞中却未发现，并且没有阳性染色(图1B，左图)。结果显示，S100染色阳性的肿瘤细胞(图1A，左图)可表达一定量的ATF3(图1A，右窗格)，而纺锤形和S100蛋白检测阴性的黑素瘤基质细胞中ATF3表达量极弱(图1A，右图)。
为了研究ATF3在人黑素瘤基质细胞中的表达水平，本实施例利用免疫组织化学的方法通过对临床黑色素瘤样品的S100(Ohsie et al.,2008,Wermker et al.,2015,Xionget al.,2019)和ATF3抗体进行染色并对其结果进行了分析。
这些染色结果的定量分析证实，波形蛋白阳性的细胞中黑色素瘤的ATF3表达量最低(图1D)。这些数据表明恶性黑色素瘤的发展与波形蛋白阳性的基质细胞中ATF3的表达下降有关。
2.2高表达ATF3的HDFs在共培养试验中抑制黑素瘤细胞增殖和迁移
接下来，调查成纤维细胞中过表达ATF3对体外黑色素瘤功能的影响。通过逆转录病毒转导，稳定过表达ATF3的实验组(ATF3-OE)与空病毒对照组(NEO)的细胞在三种不同的原代HDFs中成功构建，这三组原代HDFs中ATF3的表达增加了5-8倍(图2A，2B)。为了最小化由过表达的ATF3引起的人工效应，在病毒(菌株0808)感染后，具有最低ATF3表达的HDF品系用于以下研究。共培养试验表明，与过表达ATF3的HDFs共培养的Mel-JuSo和UACC62黑色素瘤细胞的数量明显少于与对照HDFs共培养的黑色素瘤细胞的数量(图2C，2D)。
随后，测试了过表达ATF3在HDFs中对黑色素瘤细胞迁移的影响。如图2E所示，与过表达ATF3的HDFs共培养时，Mel-JuSo和UACC62黑素瘤细胞的迁移数量比与过表达NEF的HDFs共培养时明显减少。这些结果表明HDF中过表达ATF3可以抑制黑素瘤细胞的增殖和迁移。
通过慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑方法敲除真皮成纤维细胞中的ATF3来检测低表达ATF3的HDFs对黑色素瘤增殖和迁移的影响。通过蛋白质印迹证实了ATF3蛋白的有效敲除。结果发现敲除ATF3的HDFs与Mel-JuSo或UACC62黑色素瘤细胞的共培养不会影响黑色素瘤细胞的增殖或迁移，这表明体外培养的HDFs中内源性ATF3水平不足以显着影响黑色素瘤的增殖或迁移。
2.3过表达ATF3的HDFs通过旁分泌信号通路抑制黑素瘤细胞的生长和迁移
前述共培养结果表明，过表达ATF3的HDFs通过旁分泌信号通路抑制了黑色素瘤细胞的增殖和迁移。为了进一步证实该假设，用过表达ATF3的HDFs的条件培养基(CM)培养了黑色素瘤细胞。发现，与来自表达NEO的对照HDFs的CM相比，来自过表达ATF3的HDFs的CM显着抑制了Mel-JuSo和UACC62细胞的增殖(图3A，3B)。此外，细胞集落分析也表明，源自过表达ATF3的HDF的CM显着抑制了黑色素瘤细胞的增殖(图3C)。
随后，进行了CM是否会影响黑色素瘤细胞迁移的实验。结果表明，与来自表达NEO的HDFs的CM(图3D)相比，来自过表达ATF3的HDFs的CM抑制了Mel-JuSo和UACC62黑色素瘤细胞的迁移(图3D)。
综上所述，HDFs中ATF3的过表达减少了一些能起关键作用的可溶性因子的分泌从而对黑色素瘤细胞生长和迁移产生影响。
其次，进行了酶联免疫吸附测定实验(ELISA)以检测HDF条件培养基中细胞因子的蛋白水平。同时，CM中IL-6，IL-8和TNFα的蛋白水平不受HDF中ATF3缺失的影响(图4D)，与ATF3缺失后IL-6和IL-8mRNA的微小但明确的增加有所不同。
综上所述，HDF中ATF3的过表达显着抑制了包括IL-6和IL-8在内的细胞因子的表达和分泌。
2.4ATF3的过表达可显着降低HDFs中IL-6，IL-8和其他细胞因子的表达
有研究表明ATF3下调许多细胞因子的表达，包括IL-6和IL-8(Kim et al.,2017)。因此，检测了ATF3水平对HDFs中潜在相关细胞因子和生长因子表达的影响。
首先，通过qRT-PCR分析发现，在过表达ATF3的HDF中，白介素基因(如IL-1β，IL-6和IL-8以及环氧合酶基因COX1和COX2)的表达水平明显低于对照组的HDFs(图4A)。同时对HDF中的ATF3进行敲除，qRT-PCR验证后，检测ATF3的缺失是否会影响HDFs中这些基因的表达。有趣的是，发现ATF3敲除后仅有IL-6和IL-8的表达显着增加(图4B)，这也可以解释为什么敲除ATF3基因的HDFs对黑素瘤细胞的增殖和迁移没有显著影响。发现，ATF3过表达导致IL-6和IL-8水平显着降低，但不影响CM中的TNFα水平，与这些细胞因子的qRT-PCR结果一致(图4C)。同时，CM中IL-6，IL-8和TNFα的蛋白水平不受HDF中ATF3缺失的影响(图4D)，与ATF3缺失后IL-6和IL-8mRNA的微小但明确的增加有所不同。
综上所述，HDF中ATF3的过表达显着抑制了包括IL-6和IL-8在内的细胞因子的表达和分泌。
2.5抑制IL-6的表达对于过表达ATF3的HDF对黑素瘤细胞增殖和迁移的抑制作用至关重要
已有文献证明在肿瘤微环境中产生的细胞因子在癌症发展的不同阶段起着重要作用。因此，在过表达ATF3的HDF中细胞因子产量的下降很可能对抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移至关重要。
IL-6是一种促炎性细胞因子，它已被充分证明在黑色素瘤的发生和发展中起重要作用，其表达在过表达ATF3的HDF中明显降低。因此，补充测试了IL-6是否可以抵消过表达ATF3的HDF对黑素瘤细胞增殖和迁移的影响。
向源自过表达ATF3的HDF的CM中添加了人重组IL-6蛋白(rhIL-6)，并进行了增殖，细胞克隆形成实验和迁移分析。发现，从过表达ATF3的HDF向CM中添加rhIL-6可以逆转CM对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用(图5A，5B)，并通过恢复UACC62(图5C)和Mel-JuSo以控制级别。最后，细胞迁移和划痕试验均显示，添加rhIL-6可以阻止来自过表达ATF3的HDFs的CM对黑素瘤细胞迁移的抑制作用(图5D，5E，3C)。
综上所述，IL-6表达的抑制在过表达ATF3的HDF对黑素瘤细胞增殖和迁移的抑制作用中起关键作用。
众所周知，IL-6通过激活Janus激酶/信号转导子和转录激活因子3(JAK/STAT3)信号通路的下游来驱动癌症的许多“标志”(Chong etal.,2019,Hodge et al.,2005)。与之前的研究一致，发现在用源自过表达ATF3的HDFs的CM进行培养后，Mel-JuSo和UACC62黑色素瘤细胞中p-STAT3显着降低。有趣的是，相同条件下CM培养的黑色素瘤细胞中其他信号传导途径，包括NF-κB，PI3K/AKT和MAPK途径均没有改变(图5F)。
综上所述，过表达ATF3的人真皮成纤维细胞分泌IL-6水平降低，低水平的IL-6通过阻断STAT3信号通路，最终抑制黑色素瘤的增殖和迁移。
2.6过表达ATF3的HDF抑制体内黑色素瘤细胞肿瘤的形成和生长
为了说明具有高水平表达ATF3的HDFs的体内生物学功能，将ATF3过表达的HDFs或表达NEO的对照HDF与UACC62黑色素瘤细胞混合，并皮下注射到裸鼠的背部皮肤中。然后将注射有ATF3过表达的HDFs的小鼠分为两组，进行或不进行腹膜内注射rhIL-6(图6A)。注射后3周，收集肿瘤并称重。用过表达ATF3的HDFs(不含rhIL-6)所生长的肿瘤的平均大小小于用过NEO的对照HDFs，同时也小于用过ATF3的HDFs(加腹腔膜内注射rhIL-6)所生长的肿瘤的平均大小(图6A)。在不注射rhIL-6的条件下，接受注射过表达ATF3的HDF的小鼠中形成的肿瘤的数量和平均重量显着低于其他两组(图6B，6C)。
这些体内实验通过显示高表达ATF3的HDFs可以抑制黑素瘤细胞肿瘤的形成和生长的原因可能是通过IL-6产生的负反馈调节来证实的体外发现。
2.7在HDF中诱导ATF3高表达可抑制体内外黑素瘤细胞的生长
高表达ATF3的HDFs对黑素瘤形成和生长的体内抑制作用表明，在临床上治疗黑素瘤的潜在新方法是诱导肿瘤基质细胞增加ATF3的表达。为了测试这种治疗的可行性，筛选并鉴定了两种化合物的作用，即环孢素A(Cs-A)和苯乙双胍，它们可以显着诱导HDFs中ATF3mRNA的表达。选择1.5mM苯乙双胍和10μMCs-A作为进一步研究的最佳浓度，这些浓度在2h内便可诱导ATF3蛋白表达。特别是10μMCs-A处理可诱导ATF3上升约4倍的表达，这与HDFs通过菌株0808过表达ATF3的表达水平相似(图2A)。
为了研究HDFs中ATF3表达的诱导是否可以抑制黑素瘤细胞的生长，用Cs-A或苯乙双胍预处理了HDFs，然后去除药物条件，并在基本培养基中继续培养HDF。发现HDFs中的ATF3表达在去除化合物后的24小时内仍保持较高水平(图6D)，值得注意的是，两种化合物在撤药后至少48小时都抑制了IL-6和IL-8mRNA的水平(图6E)，以上结果通过ELISA进行了确认(图6F，6G)。为了测试用Cs-A或苯甲双胍预处理的HDFs是否会影响黑色素瘤细胞的生长，用phenformin或Cs-A处理过的HDF的CM培养了黑色素瘤细胞24小时，然后继续没有经过药物处理的CM中培养48h，之后对培养基进行收集。发现，用苯乙双胍或Cs-A预处理的HDFs中的CM可以显着抑制Mel-JuSo和UACC62黑色素瘤细胞的生长(图6H，6I)。接下来，用Cs-A或DMSO预处理HDFs，将其与等量的UACC62黑色素瘤细胞混合，然后皮下注射到裸/裸小鼠的背部皮肤中。注射后三周，发现接受Cs-A预处理的HDFs小鼠中可检测到肿瘤的小鼠数量百分比以及平均肿瘤大小重量均显着降低(图6J，6K)。
综上，本发明的研究不仅表明正常HDFs中人为地过表达ATF3会抑制黑色素瘤细胞的生长，而且还发现，通过用环孢素A或苯乙双胍预处理HDFs从而诱导ATF3的表达还可以在体内外抑制黑素瘤细胞的生长，此结果提示HDF中ATF3表达量增加在临床上可能会阻止肿瘤细胞的生长。为将来开发一种新的治疗策略提供了机会，以特异性诱导肿瘤基质细胞中的ATF3表达，从而用于黑色素瘤的治疗。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.真皮成纤维细胞在制备治疗黑色素瘤产品中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述真皮成纤维细胞为激活转录因子3高表达的真皮成纤维细胞。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述治疗黑色素瘤至少表现在具有如下任意一种或多种用途：
1)抑制黑色素瘤细胞的增殖；
2)抑制黑色素瘤细胞的迁移；
3)抑制黑色素瘤的形成和生长；
4)细胞因子下调表达。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于，用途3)中，抑制黑色素瘤的形成和生长具体表现为降低黑色素瘤形成数量和/或平均重量；或，用途4)中，细胞因子包括但IL-6和IL-8，优选为IL-6。
5.真皮成纤维细胞在制备抑制黑色素瘤细胞增殖、迁移和/或黑色素瘤的形成和生长的产品中的应用；
优选的，所述真皮成纤维细胞为激活转录因子3高表达的真皮成纤维细胞。
6.权利要求1-5任一项所述应用，其特征在于，所述产品为药物。
7.一种治疗黑色素瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由真皮成纤维细胞与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成；
优选的，所述真皮成纤维细胞为激活转录因子3高表达的真皮成纤维细胞。
8.诱导和/或促进真皮成纤维细胞高表达激活转录因子3的物质在制备治疗黑色素瘤产品中的应用；优选的，所述物质包括环孢菌素A和苯乙双胍。
9.一种体外抑制黑色素瘤细胞增殖和/或迁移的方法，其特征在于，所述方法包括：将高表达激活转录因子3的真皮成纤维细胞与黑色素瘤共培养。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述真皮成纤维细胞为人真皮成纤维细胞；
优选的，向共培养体系中添加诱导和/或促进真皮成纤维细胞高表达激活转录因子3的物质，包括环孢菌素A和苯乙双胍。
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