KR101556805B1 - 강심배당체를 사용한 암 화학요법에서 치료 반응의 확률을 측정하는 방법 - Google Patents

강심배당체를 사용한 암 화학요법에서 치료 반응의 확률을 측정하는 방법 Download PDF

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Abstract

예후 검정법 및 그를 사용하는 키트 및 방법이 제공된다. 상기 키트 및 검정법은 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병에서 강심배당체에 의한 처리에 대하여 치료 반응성을 갖는 병든 세포 또는 조직의 가능성을 측정하기 위해 사용된다. 상기 키트 및 검정법은 병든 세포 또는 조직으로부터 얻은 Na, K-ATPase의 α 서브유닛의 이소폼의 비율을 측정하기 위해 이용된다. 상기 키트는 강심배당체에 의한 처리에 대하여 피검체에서 암 또는 종양의 치료 반응성을 예측하기 위해 이용될 수 있다. 상기 키트 및 검정법은 강심배당체를 포함하는 조성물을 사용하여 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애를 치료하는 방법에 혼입될 수 있다.

Description

강심배당체를 사용한 암 화학요법에서 치료 반응의 확률을 측정하는 방법{Method of determining the probability of a therapeutic response in cancer chemotherapy with cardiac glycoside}
본 발명은 강심배당체를 사용한 암 화학요법에서 예후(prognosis)를 측정하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 시험관내 또는 체내 세포 질병 또는 장애가 강심배당체(cardiac glycosides)를 사용한 치료에 대하여 치료적으로 반응성인지 여부의 확률을 측정하는 방법에 관한 것이다.
다수의 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 및 장애는 치명적이다. 이들의 가장 일반적인 것은 암 및 종양이다. 비암 증식성 질병은 평생을 위협할 수 있거나, 또는 삶의 질 감소를 초래할 수 있다. 이들은 예를 들어 다음을 포함한다: 1) 항원-유도된 관절염 및 알레르기성 뇌척수염과 같은 자가면역 질병; 2) 류마티스성 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 만성 관절염, 골다공증, 및 건선과 같은 만성 염증성 증식 질병; 3) 섬유낭병을 비롯한 유방의 증식성 질병, 4) 양성 전립선 비대증(BPH)을 비롯한 전립선의 증식성 질병, 5) 증식성 당뇨망막병증을 비롯한 눈의 증식성 질병, 및 6) 죽상동맥경화증 및 심장동맥 협착을 비롯한 혈관 증식성 질병. 이들 질병 및 장애에 대한 치료적 또는 완화적 요법을 개발하기 위하여 다수의 노력이 행해졌다; 그러나, 다양한 상이한 암, 종양 및 기타 유형의 증식성 질병에 대해 효과적인 것으로 드러난 수많은 화학요법 방법이 존재함에도 불구하고 총괄적이거나 또는 일반적인 치료 요법은 개발되지 않고 있다.
화학요법제는 개별 환자의 필요에 맞춰진 처방을 개발하려는 노력으로 임상의에 의해 개별적으로 또는 조합적으로 처방된다. 그럼에도 이들 맞춤 처방을 개발하는데 있어 주요한 장애는 특정 암 또는 종양 표현형에 대한 화학요법제의 효능의 비예측성이다. 임상의들은 히트/미스(hit or miss) 방법에 의해 이들 치명적인 질병을 치료해야 한다. 이들은 특정 화학요법제의 인정되거나 또는 지시된 용도의 이력 관찰에 의지하여 특정의 단일 화학요법제 또는 화학요법제의 조합이 임상의들이 치료하고자 하는 암 또는 종양에 대해여 치료적으로 효과적인지 여부를 예측 또는 상상해야 한다. 이러한 통상적인 사항은 임상에서 제한적으로 성공하였다.
임상의들은 특정 암 또는 종양 표현형이 특정의 단일 화학요법제 또는 요법제의 조합에 대하여 치료적으로 반응성일지 여부에 대해 신뢰성있는 수준의 확실성을 가지고 예측할 수 있는 예후 검정법(prognostic assay)를 필요로 한다. 이러한 유형의 예후 검정법는 임상적 환경에 들어가는 것과 같은 제한된 사용 이력을 갖는 화학요법제에 대해 극히 유용하다. 이러한 1 이상의 화학요법제에 대한 예후 검정법를 갖는다면 임상의에게 아주 유효할 것이다.
환자 데이터의 임상전(preclinical) 연구 및 소급 조사는 예컨대 유방암, 폐암, 전립선암 및 백혈병을 비롯한 다양한 암의 치료에서 강심배당체(예컨대 부팔린, 디곡신, 디기톡신, 오우아바인 및 올레안드린)의 가능성있는 값을 제시하였다.
강심배당체의 작용의 약리학적 메카니즘 중의 하나는 이온 교환 펌프, Na, K-ATPase에 대한 결합 능력 및 상기 특정 효소의 활성을 억제하는 능력을 포함한다. Na, K-ATPase, 혈장 막을 통한 Na+ 및 K+ 의 능동 수송을 촉진하는 막관통(transmembrane) 단백질은 강심배당체에 대하여 잘 확립된 약리학적 수용체이다. 이 효소는 ATP를 가수분해하며 또 이들의 전기 화학적 구배에 대항하여 K+를 세포로 수송하고 또 Na+ 를 세포 밖으로 수송하기 위하여 자유 에너지를 이용한다(Hauptman, P. J., Garg, R., 및 Kelly, R. A. Cardiac glycosides in the next millieum. Prog. Cardiovasc. Dis. 41: 247-254, 1999).
Na, K-ATPase는 2개의 헤테로다이머 서브유닛, 즉 촉매적 α-서브유닛 및 당화된 β-서브유닛으로 구성된다. γ-서브유닛도 또한 존재하지만, 자세히 연구되지 않았다. α-서브유닛은 ATP, Na+, K+, 및 강심배당체에 대한 결합 부위를 갖는다. β-서브유닛은 촉매적 α-서브유닛을 안정화하는 작용을 하며 또한 조절 역할도 할 수 있다. 4개의 상이한 이소폼(α1, α2, α3, α4) 및 3개의 상이한 β 이소폼(β1, β2 및 β3)이 포유동물 세포에서 확인되었다. 각 유형의 상대적 발현은 정상 및 병든 상태에서 현저하게 변형된다. α 이소폼의 발현은 조직 유형 특이적이며 또 설치류 및 인간 조직에서 상이하다(Blanco, G. 및 Mercer, R. W. Isozymes of the Na, K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol. 275 (Renal Physiol. 44): F633-F650, 1998). 신장암, 폐암, 간세포 암, 및 결장암과 같은 인간 암에서 Na, K-ATPase 이소폼의 변형된 발현은 상응하는 정상 조직에서 그것과 대조하여 보고되었다(Rajasekaran, S. A., Ball, W. J., Bander, N. H., Pardee, J. D. and Rajasekaran, A.K. Reduced expression of beta subunit of Na/K-APTase in human clear cell renal cell carcinoma. J. Urol. 162: 574-580, 1999; Avila, J., Lecuona, E., Morales, M., Soriano, A., Alonso, T., and Martin-Vasallo, P. Opposite expression pattern of the human Na/K-ATPase beta-1 isoform in stomach and colon adenocarcinomas. Ann. N. Y. Acad. Sci. 834: 633-635, 1997; Espineda, C., Seligson, D. B., Ball, W. J., Rao, J., Palotie, A., Horvath, S., Huang, Y., Shi. T 및 Rajasekaran, A. K. Analysis of the Na, K-ATPase α- and β-subunit expression profiles of bladder cancer using tissue microarrays. Cancer 97: 1851868, 2003; Jung, M. H., Kim, S.C., Jeon, G. A., Kim, S. H., Kim, Y., Choi, K. S., Park, S. I., Joe, M. K., and Kimm, K. Identification of differentially expressed genes in normal and tumor human gastric tissue. Genomics 69: 281-286, 2000). 부가적으로, 상이한 α 이소폼에 대한 강심배당체의 분명한 친화성은 아주 상이하다. α1 이소폼에 대한 강심배당체의 결합은, 상기 유형의 약물에 의한 억제에 대하여 250배 또는 그 이상 더 민감한 α2 및 α3 이소폼에 의해 생기는 것에 비하여 덜하다(Blanco, G. and Mercer, R. W. Isozymes of the Na, K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol. 275 (Renal Physiol. 44): F633-F650, 1998). 사카이 등(FEBS Letters 563: 151-154, 2004)은 정상 직장결장 세포와 비교하여 인간 직장결장암 세포에서 α3 서브유닛 이소폼의 발현이 증가됨을 보고한다.
올레안드린 및 올레안드리게닌은 Na, K-ATPase의 억제를 통한 세포내 Ca2+ 의 증가에 적어도 부분적으로 기인하는 세포자살의 유도를 통한 인간 전립선 암세포의 증식을 억제한다(McConkey, D. J., Lin, Y.., Nutt, L. K., Ozel, H. Z., and Newman, R. A. Cardiac glycosides stimulate Ca2+ increases and apoptosis in androgen-independent, metastatic human prostate adenocarcinoma cells. Cancer Res. 60: 3807-3812, 2000). 올레안드린 및 올레안드리게닌은 또한 막 상호작용 및 Na, K-ATPase 활성 억제를 통한 섬유모세포 성장인자-2의 수송을 억제한다(Smith, J. A., Madden, T., Vijjeswarapu, M., and Newman, R. A. Inhibition of export of fibroblast growth factor-2 (EGF-1) from the prostate cancer cell lines PC3 and DU145 by Anvirzel and its cardiac glycoside component, oleandrin. Biochem. Pharmacol. 62: 469-472, 2001).
α1β1 착물이 '하우스키핑' 유전자로서 간주되기 때문에 많은 Na, K-ATPAase 서브유닛 α1은 다수의 조직에 존재하는 한편, α3은 흥분성 조직, 신피질, 연수, 및 유두 상뿐만 아니라 신경조직에서 주로 검출된다.
네륨 올레안더(Nerium oleander)는 아열대 아시아, 서남부 미국 및 지중해에 널리 분포된 관상용 식물이다. 그의 의약 및 독성학적 특성은 오랫동안 인식되어 있다. 예컨대 이것은 치핵, 궤양, 나병, 뱀 물림의 치료, 및 낙태 유도에서 사용되어 왔다. 올레안더 추출물의 주요 성분인 올레안드린은 인간 종양 세포 성장의 강력한 억제제이다 (Afaq F et al. Toxicol . Appl . Pharmacol. 195:361-369, 2004). 올레안드린-매개된 세포 치사는 칼슘 유입, 미토콘드리아로부터 사이토크롬 C의 방출, 카스파아제 8 및 3의 단백질 분해 과정, 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제 분해, 및 DNA 단편화와 관련된다.
올레안드린은 네륨 올레안더의 주요 세포 독성 성분인 것으로 드러났다(Newman, et al., J. Herbal Pharmacotherapy, vol. 13, pp. 1-15, 2001). 올레안드린은 외인성이며 보통 체내에 존재하지 않는 강심배당체이다. 올레안드린은 인간에서는 세포자살을 유도하지만 쥐 종양 세포주에서는 유도하지 않고(Pathak et al., Anti - Cancer Drugs, vol. 11, pp. 455-463, 2000), NF-κB의 활성화를 억제하며(Manna et al., Cancer Res., vol. 60, pp. 3838-3847, 2000), 또 사이토크롬 C의 칼슘-매개된 방출을 통하여 부분적으로 세포 치사를 매개한다(McConkey et al., Cancer Res., vol. 60, pp. 3807-3812, 2000). 열수 올레안더 추출물(즉, AnvirzelTM)의 I상 시험이 최근에 완성되었다(Mekhail et al., Am . Soc . Clin . Oncol ., vol. 20, p. 82b, 2001). 올레안더 추출물은 1.2 ml /m 2 / d 까지의 투여량으로 안전하게 투여될 수 있다고 결론지을 수 있다. 어떠한 투여량 제한적인 독성도 발견되지 않았다.
몸에 내생성인 강심배당체인 오우아바인은 A549 인간 폐 샘암종 세포의 시험관내 방사능민감성을 향상시키지만 정상 인간 폐 섬유모세포의 방사능반응을 변형하는데에는 효과가 없는 것으로 보고되었다(Lawrence, Int . J. Radiat . Oncol . Biol . Phys., vol. 15, pp. 953-958, 1988). 오우아바인은 편평상피세포 암종 및 흑색종을 비롯한 상이한 조직학적 유형의 인간 종양 세포를 방사능감작시키는 것으로 밝혀졌다(Verheye-Dua et al., Strahlenther . Onkol ., vol. 176, pp. 186-191, 2000). 강심배당체 올레안드린은 또한 이온화 방사선의 세포독성 작용에 대하여 세포의 민감성을 향상시키는 능력을 갖는다(뉴먼 등에 의한 U.S. 특허 출원 번호 10/957,875호 및 Nasu et al., Cancer Lett. Vol 185, pp.145-151, 2002). 뉴먼 등에 의한 U.S. 등록전(Pregrant) 특허 출원 공개 20호050112059호는 올레안드린의 투여에 의한 암 치료에서 방사능요법의 개선을 개시한다.
Chen 등(Breast Cancer Research and Treatment (2006), 96, 1-15)은 오우아바인 및 디기탈리스와 같은 강심배당체가 Na+, K+-ATPase 억제제 및 ER 길항제로서 항-유방암 약물을 개발하기 위하여 유용할 수 있음을 제시한다.
Smith 등(Biochemical Pharmacology (2000), 62, 1-4)은 ANVIRZEL, 및 그의 주요 강심배당체 성분 올레안드린이 전립선 암세포주 PC3 및 DU145로부터 종양 성장인자인 섬유모세포 성장인자-2 (FGF-2)의 수송을 억제함을 보고한다.
Newman 등(J. Experimental Therapeutics and Oncology (2006), 5, 167-181)은 인간 악성 흑색종 BRO 세포와 올레안드린의 배양이 미토콘드리아 손상, 세포성 글루타치온(GSH) 푸울의 손실 및 결국에는 종양 세포 치사를 매개하는 반응성 산소종인 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼의 시간-의존적 형성을 초래한다고 보고한다.
네륨 종의 식물로부터 배당체 추출은 네륨 올레안더로부터 약리학적/치료학적 활성 성분을 제공하였다. 그 중에서 올레안드린, 네린, 및 기타 강심배당체 화합물이 존재한다. 식물 추출물은 동물에서 세포 증식성 질병의 치료에 유용하다. 네륨 올레안더의 열수 추출에 의해 얻은 올레안드린 추출물은 상품명 ANVIRZELTM 로 시판되며 또 네륨 올레안더의 열수 추출물로부터 얻은 농축 형태 또는 분말 형태를 함유한다.
후아찬수(Huachansu)는 두꺼비 피부로부터 얻은 추출물이며 또 강심배당체인 부팔린과 같은 부파디에놀리데스를 포함한다. 후아찬수는 중국에서 암 치료를 위해 인가된 의약이다. 이것은 또한 간암, 위암, 폐암, 피부암 및 식도암을 비롯한 다양한 암을 치료하기 위해 사용되어 왔다.
세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애 치료에서 강심배당체의 중요한 유용성을 고려할 때, 강심배당체에 대한 질병 또는 장애의 치료 반응을 예측하는 방법에 대한 필요가 여전히 존재한다. 종래 기술에서는 이러한 방법이 개시되거나 제시된 바 없다.
발명의 요약
본 발명은 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애의 특정 표현형에 대한 강심배당체 또는 강심배당체를 함유하는 조성물의 효능을 예측하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 강심배당체를 사용한 치료에 대한 질병 또는 장애의 민감성 또는 치료 반응성은 그러한 질병 또는 증식성 장애를 갖는 세포 또는 조직에서 Na, K-ATPase 서브유닛의 α1 이소폼 발현에 대한 α3 이소폼의 비율에 의존적이라는 것을 발견하였다. 일반적으로, 세포 또는 조직에서 Na, K-ATPase 서브유닛의 α1 이소폼 발현에 대한 α3 이소폼의 비율이 높을수록, 이들 세포는 강심배당체에 대하여 더 민감성이다(치료적 반응). 즉, α1 이소폼(약물 민감성) 발현에 대한 α3 이소폼(약물 비민감성)의 비율이 높을수록, 세포 또는 조직은 강심배당체에 의한 증식의 억제에 대하여 더욱 민감성이다.
본 발명의 일 요지는 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애의 강심배당체 또는 강심배당체를 포함하는 조성물을 사용한 치료에 대한 생체내 치료 반응성을 예측하는데 유용한 시험관내 예후 검정법를 제공하는 것으로, 상기 검정법은,
과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애에 걸린 피검체의 병든 체내 세포 조직으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 얻은 것으로 Na,　K-ATPase의 서브유닛의 1 이상의 이소폼을 포함하는 샘플에서 Na,　K-ATPase α-서브유닛의 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율을 측정하고; 또
치료적으로 상대적 투여량의 강심배당체로 처리될 환자에서 치료 반응의 확률을 측정하는 것을 포함한다.
일부 구체예로서: 1) 상기 검정법은 또한 상기 비율이 적어도 1보다 크거나 또는 적어도 1과 동일하면 세포 조직이 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 치료적으로 반응성일 것이라 예측하는 것을 포함한다; 2) 상기 검정법은 또한 상기 비율이 0.5 내지 1.0이면 세포 조직이 강심배당체에 의한 처리에 치료적으로 적어도 부분적으로 반응성일 것이라 예측하는 것을 포함한다; 3) 상기 검정법은 또한 상기 비율이 0.3 미만이면 세포 조직이 강심배당체에 의한 처리에 대하여 실질적으로 비반응성일 것이라 예측하는 것을 포함한다; 4) 상기 검정법은 또한 1 내지 100 범위 내의 서브유닛 비율을 갖는 조직이 1 미만의 이소폼 비율을 갖는 조직에 비하여 치료적으로 더 반응성일 것이라고 예측하는 것을 포함한다; 5) 상기 검정법은 또한 검출가능한 α3 이소폼 만을 가지고 또 검출가능한 α1 이소폼은 갖지 않는 조직이 강심배당체에 대하여 가장 치료적으로 반응성일 것이라고 예측하는 것을 포함한다; 및/또는 6) 상기 검정법은 또한 상기 비율이 ≥2, ≥3, ≥4, ≥5, ≥7, ≥9, ≥10, ≥15, ≥20, ≥25, ≥40, ≥50, ≥75 또는 ≥100이면 세포 조직이 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 치료적으로 반응성일 것이라고 예측하는 것을 포함한다.
일부 구체예로서, 치료 반응이 있을 확률은 하기 표에 따라 Na, K-ATPase의 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율에 관련이 있다:
Figure 712014004054615-pct00001
상기 표에서, 치료 반응은 일부 또는 전체 치료반응이거나 또는 진행되기까지 시간지연될 수 있다.
일부 구체예로서 다음을 들 수 있다: 1) 상기 측정 단계는 시험관내 샘플 또는 생검 샘플에서 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼 및 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼의 발현 정도를 정량하고, 또 그의 비율을 산출하는 것을 포함하며; 2) 상기 측정 단계는 시험관내 샘플에서 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼의 양에 대한 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 양을 측정하고, 또 그의 비율을 산출하는 것을 포함한다; 3) 상기 검정법은 또한 상기 비율이 측정되는 데이터에 기초한 통계적 분석을 실시하는 것을 포함한다; 4) 상기 샘플은 세포 조직, 세포 덩어리(mass), 세포 용해물, 이들로부터 제조된 막 제제, 또는 그의 고정된 조직병리학적 슬라이드이다; 5) 상기 샘플은 시험관내 샘플이며; 6) 상기 샘플은 Na,　K-ATPase의 α 서브유닛의 적어도 2개의 이소폼을 포함하고; 7) 상기 샘플은 Na,　K-ATPase의 α 서브유닛의 적어도 α1 및 α3 이소폼을 포함한다; 8) 상기 방법은 또한 세포, 조직 또는 생검 샘플을 용해 또는 파쇄하거나 또는 병든 체내 세포 조직으로부터 조직병리학적 조사를 위하여 조직 부분을 고정하여 샘플을 형성하는 것을 포함한다; 9) 상기 방법은 샘플 상에서 웨스턴 블럿 검정 또는 면역조직화학적 염색 검정을 실시하여 샘플에서 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼에 대한 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 양과 상대적 발현을 측정하고 또 그의 비율을 산출하는 것을 포함한다; 10) 상기 방법은 또한 샘플에서 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼의 함량에 대한 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 함량을 측정하기 위하여 겔에서 방사능 측정(radiometric) 또는 밀도측정(densitometric)을 실시하는 것을 포함한다; 11) 상기 방법은 또한 샘플에서 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 함량 및 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼의 함량의 존재를 검출하고 또 그 함량을 정량하기 위하여 겔의 방사능측정 또는 밀도측정 분석을 실시하는 것을 포함한다; 12) 양성 대조용 샘플 및/또는 음성 대조용 샘플에서 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 함량 및 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼의 함량에 대한 샘플 중의 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 함량 및 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼 함량을 비교하거나; 및/또는 13) α3 및 α1 서브유닛 이소폼 중의 하나의 발현이 대조용으로서 생기는 것으로 알려진 조직 샘플에서 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 함량 및 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼의 함량을 비교하는 것.
일부 구체예로서: 1) 병든 세포 조직은 포유동물과 같은 피검체로부터 얻는다; 2) 병든 세포 조직은 인간, 소, 개, 고양이, 말, 돼지 또는 상업적 가치에 상관없이 기타 가축동물로부터 얻는다; 3) 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애는 인간 또는 동물의 생활의 질에 나쁜 영향을 미치는 암 또는 종양 또는 기타 증식성 질병이다; 및/또는 4) 상기 암 또는 종양은 직장결장암, 머리 및 목암, 부신피질암, 항문암, 담관암, 방광암, 뼈암, 뼈 전이, 뼈육종, 뇌암, 유방암, 경부암, 비-호지킨 림프종, 직장암, 식도암, 안암, 담낭암, 위장관 카르시노이드 종양, 임신영양모세포병, 호지킨 질병, 카포씨 육종, 신장암, 후두 및 하인두 암, 간암, 폐암 (비소형세포 및 소형 세포 암종), 폐 카르시노이드 종양, 악성 중피종, 전이암, 다발골수종, 골수형성이상증후군, 비강 및 부비동 암, 코인두암, 신경모세포종, 중앙신경계의 신생물, 구강 및 입인두암, 뼈육종, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체암, 전립선암, 망막모세포종, 침샘암, 육종, 피부암, 위암, 고환암, 가슴샘암, 갑상샘암, 요관암; 자궁 육종, 질암, 음문암 또는 빌림스 종양으로 구성된 군으로부터 선택된다;
일부 구체예로서: 1) 상기 방법은 또한 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애를 갖는 피검체를 확인하는 것을 포함한다; 2) 상기 방법은 또한 피검체로부터 병든 세포 샘플을 얻는 단계를 포함한다; 3) 상기 방법은 Na, K-ATPase의 α3 및 α1 이소폼에 대한 분석을 실시하는 방법을 특정하는 정보를 제공하는 것을 포함한다; 및/또는 4) 상기 방법은 예후 데이터를 해석하는 방법을 자세히 나타내는 정보를 제공한다.
일부 구체예로서, 증식성 질병은 비제한적으로 다음을 포함한다: 1) 항원-유도된 관절염 및 알레르기성 뇌척수염과 같은 자가면역 질병; 2) 류마티스성 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 만성 관절염, 골다공증, 및 건선과 같은 만성 염증성 증식 질병; 3) 섬유낭병을 비롯한 유방의 증식성 질병; 4) 양성 전립선 비대증(BPH)을 비롯한 전립선의 증식성 질병; 5) 증식성 당뇨망막병증을 비롯한 눈의 증식성 질병; 및 6) 죽상동맥경화증 및 심장동맥 협착을 비롯한 혈관 증식성 질병. 일부 구체예로서, 2 이상의 증식성 질병이 동시에 치료된다.
인간 종양 세포주를 사용한 실험실 연구를 기초로 하여 강심배당체와의 처리에 대하여 특히 반응성일 것으로 생각되는 암은 전립선암, 폐암, 유방암, 방광암, 골원성 육종, 뇌암 (다형성아교모세포종) 및 결장암을 포함한다. 암은 인간, 비-인간 또는 동물 기원일 수 있다.
일부 구체예로서: 1) 상기 강심배당체는 올레안드린, 오우아바인, 부팔린, 디기톡신, 디곡신, 시노부파탈린, 시노부파긴, 및 레시부포게닌으로 구성된 군으로부터 선택된다; 2) 상기 강심배당체는 식물 또는 동물 공급원의 추출을 통하여 유도된 것인지, 합성된 것인지 또는 유용 강심배당체의 화학적 개질을 통하여(예컨대 유도화) 제조된 것이든 순수한 형태로 존재한다; 3) 상기 강심배당체는 추출물로 존재할 수 있다; 4) 상기 강심배당체는 약리학적 배합물 또는 조성물로 존재할 수 있다; 5) 상기 강심배당체는 올레안더 식물 덩어리(mass)로부터 얻을 수 있다; 6) 상기 올레안더 식물 덩어리는 네륨 종, 예컨대 네륨 올레안더(Nerium oleander) 또는 테베티아 종(Thevetia species), 예컨대 테베티아 네리폴리아(Thevetia nerifolia)(황색 올레안더로도 공지됨)를 포함한다; 및/또는 7) 상기 강심배당체 추출물은 경우에 따라 변형제 존재하에서 초임계적 유체(SCF) 추출에 의해 제조하였다.
일부 구체예로서: 1) 상기 SCF 추출은 또한 강심배당체로부터 얻은 것 이외에 적어도 1개의 다른 약리학적 활성제를 포함한다; 2) 상기 활성제는 상기 추출물을 피검체에 투여할 때 강심배당체의 치료 효능에 공헌할 수 있다; 3) 상기 기타 활성제는 강심배당체의 치료 효능에 부가적으로 또는 상승작용적으로 공헌하는 작용을 한다; 및/또는 4) 상기 추출물은 두꺼비 피부 또는 그들로부터 유도된 분비물로부터 얻었다.
본 발명의 다른 요지는 본 발명의 예후 검정법를 실시하는데 적합한 키트를 제공한다. 상기 키트는 다음을 포함한다: a) Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼에 대하여 결합 친화성을 갖는 제1 일차항체; 및 b) Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 일차항체. 상기 키트는 웨스턴 블럿 겔 전기영동 검정을 실시하는데 및/또는 면역조직화학적 염색 검정을 실시하는데 사용하기에 적합할 수 있다.
상기 키트는 경우에 따라 다음을 또한 포함한다: a) 용해 조성물; b) Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼을 포함하는 양성 대조용 샘플; c) Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼 및 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼을 포함하는 양성 대조용 샘플; d) Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼은 포함하지만 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼은 포함하지 않는 음성 대조용 샘플; e) 이차항체, 염소 항-마우스 IgG-HRP (예컨대 목적으로 하는 단백질을 가시화하기 위하여 사용될 수 있음); f) 겔 전기영동 분석에 적합한 겔 형성 물질; g) 방사성 라벨링된 또는 착색된 (육안으로 또는 기구적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 발색) 분자량 마커; h) 키트 사용법 및 예후 검정법의 실시에 대한 지시사항; i) 밀도측정계 또는 방사능측정계; j) 수성 액체 배지; k) 겔/막 제조 키트; l) 블로킹 용액; m) 세척 완충액; n) 웨스턴 블럿 분석 키트를 포함하는 물질 또는 o) 이들의 조합물.
키트의 일부 구체예로서: a) 상기 제1 일차 항체는 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는다; b) 상기 제2 일차항체는 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼에 대하여 특이적 결합 친화성을 갖는다; c) 이차항체는 염소 α 마우스 IgG 서양고추냉이 퍼옥시다아제이거나 또는 서양고추냉이 퍼옥시다아제와 같은 부착된 적절한 마커를 갖는 마우스 IgG에 대하여 생긴 마우스 이외의 종으로부터 얻은 다른 이차 항체를 포함한다; 및/또는 d) 상기 일차 항체는 모노클로날 항체이다.
일부 구체예로서, 상기 면역조직화학적 염색 검정 키트는 다음을 포함한다: a) 항원 마스킹해제(unmasking) 용액 (고 pH 또는 시트르산을 기본으로 할 수 있음); b) 완충액; c) 내인성-퍼옥사이드 활성-켄칭 물질 (경우에 따라 메탄올 중에서 과산화 수소를 포함할 수 있음); d) 항-Na,K-ATPase α3 서브유닛 이소폼 항체 및/또는 항-Na,K-ATPase α3 서브유닛 이소폼 항체; e) 비-면역 마우스 IgG1 항체; f) 항-토끼 IgG 및 항-마우스 IgG 시약의 혼합물을 포함하는 유니버샬 항체 시약; g) 디아미노벤지딘과 같은 일차 화학 염색제(stain); h) 일반 카운터-화학 염색제(stain), 예컨대 해마톡실린 또는 에오신; i) 특정 세포 기관 염색제, 예컨대 핵을 염색하기 위해 사용됨(예컨대 에티듐 브로마이드, 비스벤즈이미다졸 또는 황산 알루미늄 칼륨) 또는 미토콘드리아를 염색하기 위해 사용됨(예컨대 미토 트랙커 레드, 10-노닐 아크리딘 오렌지); j) 키트를 면역조직화학적으로 염색하는 것을 포함하는 물질; 또는 k) 이들의 2 이상의 조합물. 조직 또는 세포의 인접 부분을 사용한 α1 서브유닛 이소폼의 염색은 α1 서브유닛 이소폼 및 α3 서브유닛 이소폼에 대한 적절한 특정 일차 항체가 사용되는 α3 서브유닛 이소폼을 염색하기 위해 사용되는 것과 유사한 방식으로 실시할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 특정 세포 기관 염색은 세포(인간, 비-인간 또는 동물)에서 특정 유형의 기관(미토콘드리아, 핵, 핵성, 골지체, 액포 등)에 대해 사용된 물질 또는 물질의 조합물이다.
일부 구체예로서, 상기 면역조직화학적 염색 검정은 다음 단계를 포함한다: a) 포유동물 조직 샘플을 제공하는 단계; b) 샘플에 존재하는 Na, K-ATPase의α3 이소폼 및 α1 이소폼을 면역화학적으로 염색하는 단계; c) 샘플에 존재하는 Na, K-ATPase의 α3 이소폼의 함량 및 α3 이소폼의 함량을 측정하는 단계; 및 d) 샘플에 존재하는α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율을 측정하는 단계.
일부 구체예로서, 상기 면역조직화학적 염색 검정은 다음 단계를 포함한다: a) 포유동물 조직 샘플을 제공하는 단계; b) 조직 상에서 항원 회수 과정을 실시하는 단계; c) 조직에서 내인성 퍼옥사이드 활성을 켄칭하는 단계; d) 켄칭된 조직을 항-Na,K-ATPaseα3 서브유닛 이소폼 및/또는 항-Na,K-ATPase α1 서브유닛 이소폼 일차 항체에 노출시키는 단계; e) 상기 항체-처리된 조직을 이차 항-토끼 IgG, 항-마우스 IgG 항체 또는 이들의 조합물에 노출시키는 단계; f) IgG-처리된 조직을 일차 염색제에 노출시키는 단계; g) 상기 염색된 조직을 카운터-염색제에 노출시켜 면역조직화학적으로 염색된 조직을 형성하는 단계; h) 상기 면역조직화학적으로 염색된 조직을 육안으로 또는 광도계 수단에 의해 분석하는 단계; 및 i) 포유 동물 조직에 존재하는 α3 및/또는 α1 이소폼의 양을 정량하는 단계. 이소폼 항체 염색의 정량은 예컨대 이차 항체가 바이오티닐화되면 실시될 수 있다. 이어 벡타스타틴 ABC 염색제를 부가하여 30분간 배양할 수 있다. 염색된 부분을 세척한 다음, 이들을 디아미노벤지딘 기질과 함께 배양하여 염색의 적절한 수준을 나타낸다. 염색된 조직의 정량은 염색제의 세기를 등급을 매기는 것에 의해 수동으로 실시할 수 있거나 또는 관심을 두고 있는 컴퓨터화된 영상 포획 및 디지탈 주사를 이용하여 전자적으로 실시할 수 있다. 정량은 시판되고 있는 디지탈 영상 소프트웨어를 이용하여 실시될 수 있다. 일부 구체예로서, 상기 검정법은 또한 다음 단계를 포함한다: j) 단계 a)로부터 생긴 조직을 세척하는 단계; k) 단계 c)로부터 생긴 조직을 세척하는 단계; l) 음성 대조용 부분을 "일차 없음" 대조군으로서 제공하는 단계(종양 또는 암을 갖지 않는); m) 음성 대조용 부분을 비-면역 마우스 IgG1 항체에 노출시키는 단계; n) 상기 단계 e)로부터 생긴 조직을 세척하는 단계; o) 단계(f)로부터 생긴 조직을 세척하는 단계; 및/또는 단계 g)로부터 생긴 조직을 세척하는 단계. 상기 세척은 물, 완충수 및/또는 TBS(약 50 mM 트리스 HCl, 약 300 mM NaCl, 약 0.1% Tween 20, pH 약 7.6)를 사용하여 실시할 수 있다.
양성 대조 샘플은 조직, 세포 덩어리, 세포 용해물 또는 생검 또는 기타 외과적 절제 수단에 의해 얻을 수 있는 것으로부터 얻은 막 제제일 수 있다. 음성 대조 샘플은 조직, 세포 덩어리, 또는 세포 용해물 또는 이전의 분석을 통하여 Na, K-ATPase의 α-서브유닛의 α3 이소폼을 함유하지 않는 것으로 알려진 이들로부터 제조된 막 제제일 수 있다. 일부 구체예로서, 상기 음성 대조군은 시험관에서 성장한 설치류(마우스 또는 래트) 종양 조직 또는 마우스 또는 래트 세포의 세포 덩어리로 구성된다.
상대적 Na, K-ATPase α 서브유닛 이소폼 조성물 및 비율을 측정하는 다른 수단인 분석 방법은 α1 이소폼에 대한 α3 비율을 측정하기 위하여 본 발명에 따라 적용될 수 있다. 이들은 예컨대 ELISA (효소 결합된 면역흡착 검정법) 또는 단백질 조직 또는 세포 용해물 어레이에서 적절한 항체의 사용으로 구성된다. 다르게는, 상이한 Na, K-ATPase α-서브유닛 이소폼에 대한 mRNA 측정을 위한 노던 블럿 분석 및 관련 수법(예컨대 rtPCR, 리얼 타임 폴리머라제 연쇄 반응)을 이용할 수 있다. 면역조직화학적 염색 검정을 이용하여 샘플에 존재하는 α 서브유닛의 α3 이소폼 및 α1 이소폼의 양을 정량할 수 있다.
본 발명의 요지는,
과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애에 걸린 피검체의 병든 체내 세포 조직으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 얻은 것으로 Na,　K-ATPase의 α 서브유닛의 1 이상의 이소폼을 포함하는 샘플에서 Na,　K-ATPase의 서브유닛의 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율을 측정하고; 또
상기 비율이 ≥0.3, ≥0.5, ≥1 또는 ≥10이면, 강심배당체를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 지시하는 것을 포함하는, 강심배당체를 포함하는 조성물을 사용하여 피검체에서 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 요지는 ,
과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병에 걸린 피검체로부터 Na,　K-ATPase의 α 서브유닛의 1 이상의 이소폼을 포함하는 병든 조직 샘플을 얻고;
샘플 중에서 Na,　K-ATPase의 α 서브유닛의 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율을 측정하고; 또
상기 비율이 ≥0.3, ≥0.5, ≥1 또는 ≥10이면 강심배당체를 포함하는 조성물을 피검체에게 투여하는 것을 지시하는,
강심배당체를 포함하는 조성물을 사용하여 피검체에서 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 구체예는 다음을 포함한다: 1) 상기 피검체에는 강심배당체를 포함하는 조성물이 치료적으로 관련된 투여량으로 처방되고 투여된다; 2) 상기 피검체에는 처방된 투여량에 따라 강심배당체를 포함하는 조성물이 투여된다; 3) 상기 피검체에는 강심배당체를 포함하는 추출물을 포함하는 조성물이 투여된다; 4) 상기 추출물은 또한 1 이상의 다른 치료적으로 효과적인 물질을 포함한다; 5) 상기 조성물은 1 이상의 다른 치료적으로 효과적인 물질을 더 포함한다; 6) 상기 피검체에는 강심배당체를 함유하는 식물 또는 동물 공급원의 열수 추출물이 하루에 2 mg 내지 22.5 mg 투여된다; 또는 7) 강심배당체의 식물 또는 동물 공급원의 농축된 추출물(예컨대 초임계적 CO2 추출물)은 0.6 내지 4.8 mg 범위임; 또는 8) 강심배당체의 순수한 단일 화학 형태는 10 내지 500 ㎍ 범위이다.
본 발명의 방법의 개별 단계는 별개의 시설에서 또는 동일 시설에서 실시될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 본 발명의 요지, 구체예 및 서브-구체예의 모든 조합을 포함한다.
이하의 도면은 본 발명의 상세한 설명의 일부를 형성하며 또 청구된 발명의 예시적 구체예를 기재한다. 당업자라면 이들 도면 및 상세한 설명을 읽어본다면 과도한 실험없이 본 발명을 실시할 수 있을 것이다.
도 1a는 Na, K-ATPase의 α-서브유닛의 α1 및 α3 이소폼의 상대적 정량을 위한 인간 및 마우스 세포주의 웨스턴 블럿 분석의 일부로서 얻은 겔 전기이동도의 관련 밴드의 사진을 도시한다.
도 1b는 올레안드린(nM)의 농도 대 인간 및 마우스 종양에 대한 세포 성장 억제의 %의 플럿을 도시한다.
도 2는 정상 및 악성 인간 결장 세포의 웨스턴 블럿 검정의 일부로서 얻은 겔 전기이동도의 관련 밴드의 사진을 도시한다.
도 3a는 Na, K-ATPase 서브유닛의 α1 및 α3 이소폼의 상대적 발현에서 올레안드린(nM)의 농도 대 다양한 상이한 종양 세포주에 대한 세포 성장 억제의 % 의 플럿을 도시한다.
도 3b는 2개의 상이한 종양 세포주 그룹: 즉 α1 서브유닛 이소폼에 대한 α3 서브유닛 이소폼 비율이 1 이상인 제1 그룹; 및 α1 서브유닛 이소폼에 대한 α3 서브유닛 이소폼 비율이 1 미만인 제2 그룹에서 세포 성장 억제에 대한 올레안드린의 평균 IC50 의 바 차트를 도시한다.
도 4a는 형질감염되지 않은 인간 종양 세포 및 형질감염된 인간 종양 세포의 웨스턴 블럿 검정의 일부로서 얻은 겔 전기이동도의 관련 밴드의 사진을 도시한다.
도 4b는 도 4a의 형질감염되지 않은 세포 및 형질감염된 세포에서 α3 이소폼의 관련 발현을 도시하는 바 차트이다.
도 4c는 도 4a의 세포에 대한 올레안드린의 농도(nM) 대 암 세포 성장 억제의 %의 플럿을 도시한다.
도 5a는 형질감염되지 않은 Panc-1 세포 및 형질감염된 Panc-1 세포의 웨스턴 블럿 검정의 일부로서 얻은 겔 전기이동도의 관련 밴드의 사진을 도시한다.
도 5b는 도 5a의 형질감염되지 않은 세포 및 형질감염된 세포에서 α3 이소폼의 관련 발현을 나타내는 바 차트를 도시한다.
도 5c는 도 5a의 세포에 대한 올레안드린의 농도(nM) 대 암세포 성장 억제 %의 플럿을 도시한다.
도 6의 A-F는 DI 13782로부터 얻은 면역조직화학적으로 염색된 정상 피부 세포의 사진을 도시한다.
도 7의 A-H는 면역조직화학적으로 염색된 흑색종 피부 세포의 사진을 도시한다: A-B는 DI 15041 세포를 도시하고; C-D는 DI 15832 세포를 도시하며; E-F는 DI 15833 세포를 도시하고; G-H는 DI 15834 세포를 도시한다.
본 발명은 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애에 걸린 피검체가 강심배당체-함유 조성물을 사용하여 피검체를 치료하는 것에 의해 질병 또는 장애로부터 임상적 이득을 받을지 여부를 예측하는 방법을 제공한다. 이 방법은 피검체 중의 질병 또는 장애가 강심배당체-함유 조성물을 사용한 치료에 대하여 치료적으로 반응성인지 여부를 측정하기 위해 이용된다. 다시 말해, 상기 방법은 1 이상의 강심배당체의 치료적으로 관련된 투여량(또는 유효량)으로 치료한 이후 피검체에서 치료 반응의 확률을 측정하기 위해 이용된다.
간단히 말해, 샘플은 피검체 중의 병든 조직으로부터 얻는다. 이러한 샘플은 Na,　K-ATPase의 α 서브유닛의 1 이상의 이소폼을 포함하며 또 Na, K-ATPase의 α 서브유닛의 α3 및 α1 이소폼의 상대적 양 또는 농도를 측정하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같이 검정법한다. 이어 상기 상대적 양 또는 농도의 비율을 산출한다. α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율이 0.3보다 커거나 또는 0.3과 동일하면, 상기 방법은 질병 또는 장애가 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 치료적으로 반응성일 확률 증가를 예측한다. 예컨대, 상기 비율이 0.3 - 0.45 +/- 0.05이면,질병 또는 장애가 강심배당체와의 처리에 반응할 확률이 적어도 20% 또는 20% 내지 30% 미만이다. 상기 비율이 0.2 미만 또는 0.3 미만이면, 상기 방법은 질병 또는 장애가 강심배당체와의 처리에 치료적으로 반응성인 확률이 20% 미만일 것으로 예측된다. 일반적으로, 상기 비율이 더 높을수록, 치료 반응의 확률이 더 커진다. 예컨대, 상기 비율이 0.5 - 0.95 +/- 0.05이면, 질병 또는 장애가 강심배당체와의 처리에 반응할 확률이 적어도 30% 또는 30% 내지 50% 존재한다. 상기 비율이 1 +/- 0.05 보다 커거나 또는 그와 동일하면, 질병 또는 장애가 강심배당체와의 처리에 반응할 확률이 적어도 50% 존재한다. 상기 비율이 10 +/- 0.05 보다 크면, 질병 또는 장애가 강심배당체와의 처리에 반응할 확률이 적어도 75% 존재한다.
"치료적으로 반응성"이라는 것은 질병 또는 장애에 걸린 피검체가 강심배당체와의 처리 결과로서 이하의 임상적 이득 중의 적어도 1개를 얻는다는 것을 의미한다: 질병 또는 장애의 완화, 질병 또는 장애와 관련된 증상 발생 감소, 질병 또는 장애의 부분적인 차도, 질병 또는 장애의 완전한 차도, 또는 진행 시간의 증가. 즉, 치료 반응은 완전한 치료반응 또는 부분적인 치료반응일 수 있고, 또 상기 방법은 완전 반응 또는 부분 반응인지에 상관없이 치료 반응의 확률을 측정하기 위해 이용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "진행 시간"이라는 것은 질병이 진단(또는 치료)된 후 질병이 더 나빠지기 시작할 때까지(종양이 자라기 시작하거나 계속 자랄 때까지)의 시간의 길이, 또는 지속시간을 의미한다. 질병의 수준이 질병의 더 이상의 진행 없이 유지되는 동안의 시기이며, 또 이 시기는 질병이 다시 진행하기 시작할 때 끝난다. 질병의 진행은 요법을 개시하기 전에 또는 개시할 때 세포 증식성 질병에 걸린 피검체의 "단계" 측정에 의해 결정된다. 예컨대, 피검체가 가진 종양의 크기, 위치 및 개수를 요법을 개시하기 전에 또는 개시할 때 측정한다. 이어, 피검체는 강심배당체에 의해 처리되며, 또 종양의 크기 및 개수를 주기적으로 모니터링한다. 나중의 한 시점에서, 종양의 크기 및/또는 개수는 증가할 수 있으므로, 질병의 진행 및 진행시기의 끝을 표기한다. 질병이 진행하지 않는 시기 또는 질병의 수준 또는 심각성이 나빠지지 않는 동안의 시기는 진행 시간이다.
치료 반응은 피검체에 대한 치료적으로 관련된 투여량에서 전체적 또는 일부 반응일 수 있음이 알아야 한다. 즉, 예상된 치료 반응의 수준은 강심배당체가 투여되는 피검체에 대하여 치명적이지 않은 투여량에서 결정된다. 따라서 치료적으로 관련된 투여량은 강심배당체에 의한 치료에 대한 질병 또는 장애의 치료 반응이 관측되고 또 피검체가 과도한 원하지 않은 또는 유해한 부작용없이 강심배당체가 투여될 수 있는 치료 투여량이다. 치료적으로 관련된 투여량은 환자에서 일부 부작용을 유발할 수 있지만 피검체에 대하여 치명적이지는 않다. 강심배당체가 투여되는 피검체에 대한 임상적 이득 수준이 강심배당체의 투여에 기인한 피검체가 경험한 유해한 부작용의 수준을 초과하는 투여량이다. 치료적으로 관련된 투여량은 다양한 확립된 약리학적, 약역학적 및 약동학적 원리에 따라 피검체와 피검체에 따라 다를 수 있다. 그러나, 치료적으로 관련된 투여량(예컨대, 올레안드린에 대한)은 전형적으로 25, 100, 250, 500 또는 1000 마이크로그램 강심배당체/일(day)을 초과하지 않거나 또는 25-500 또는 25 - 1000 마이크로그램 강심배당체/일 범위일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 피검체가 치료적으로 관련된 투여량으로 투여될 때 질병 또는 장애의 치료 반응성을 예측하기 위하여 이용될 수 있다. 피검체에서 표적 치료 결과를 제공하는데 필요한 약물의 실제 양은 약학의 기본적인 원리에 따라 피검체와 피검체에 따라 다를 수 있다.
치료적으로 관련된 투여량은 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애의 치료에 전형적으로 이용되는 투여 처방에 따라 투여될 수 있다. 치료적으로 관련된 투여량은 하루에 1회, 2회, 3회 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 이틀 마다, 삼일 마다, 4일 마다, 반 주마다, 1주 마다, 2주 마다, 3주 마다, 4주 마다, 1달 마다, 2달 마다, 반 달마다, 3달 마다, 4달 마다, 반 년마다, 해마다 또는 상기의 조합에 따라 투여될 수 있다. 예컨대, 치료적으로 관련된 투여량은 1 또는 그 이상의 주 동안 매일 1회 투여될 수 있다.
"용해 조성물"이라는 것은 세포 막을 용해하여 세포 용해물을 형성하거나 또는 세포 함량의 완전한 용해를 할 수 있는 1 이상의 물질을 의미한다. 용해 조성물은 1 이상의 다음 성분을 포함할 수 있다: 수성 액체 배지, 완충제, 염, 킬레이트제, 계면활성제, 소포제, 프로테아제 억제제, 및 포스파타아제 및 ATPase 억제제.
키트와 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이, "양성 대조 샘플"은 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼을 포함한다. 양성 대조군은 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼을 더 포함할 수 있다. 각 서브유닛 이소폼의 양 또는 농도는 독립적으로 미리 결정되거나 또는 공지될 수 있다. 서브유닛 이소폼의 양 또는 농도는 양성 대조 검정법에 사용된 특정 방법에 따라 결정되는 바와 같은 서브유닛 이소폼의 존재에 대한 양성 반응을 제공하기에 충분할 것이다. 예컨대, 웨스턴 블럿 검정에서, 양성 대조에서 서브유닛 이소폼의 양 또는 농도는 서브유닛의 존재가 예컨대 농도측정 또는 방사능측정에 의해 결정될 때 서브유닛 이소폼의 존재에 대한 양성 반응을 얻을 수 있도록 상응하는 항체와 반응하기에 충분할 것이다. 면역조직화학적 염색 검정(실시예 27에서 자세히 나타낸 바와 같은)의 경우, 양성 대조군에서 서브유닛 이소폼의 양 또는 농도는, 겔에 적용될 때, 전기영동을 이용하여 다른 단백질로부터 분리된 다음 앞서 기재한 바와 같이 일차 및 이차 항체 사용으로 염색되거나 또는 디지탈 포착 및 정량적 영상 분석 소프트웨어를 이용하는 현미경 조사하에서 정량적 분석에 적용될 때 손쉬운 가시화 및 정량화를 허용하기에 충분할 것이다. 대조 샘플 중의 서브유닛 이소폼의 양 또는 농도가 분석 이전에 공지되거나 또는 미리 결정되면, 양성 반응의 수준은 서브유닛 이소폼에 대한 검량 곡선을 제공하도록 양 또는 농도에 관련될 수 있다.
양성 대조 샘플 중에 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼이 존재하면, α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율은 일반적으로 0.3 내지 100 범위 또는 그 이상일 수 있다. 상기 비율에 대한 적합한 범위는 0.3 대 0.5, 0.5 대 1.0, 1.0 대 20, 및 20 대 100을 포함한다.
키트와 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이, "음성 대조 샘플"은 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼을 포함하지만, Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼은 배제한다. α1 서브유닛 이소폼의 양 또는 비율은 웨스턴 블럿 검정와 같은 검정법에 이용된 특정 방법에 따라 결정되는 바와 같이 음성 대조군으로서 이소폼의 존재에 대한 양성 반응을 제공하기에 충분할 것이다. 상기 양 또는 농도는 공지되거나 또는 미리 결정될 수 있으며, 또 그렇다면, 이소폼에 대한 검량 곡선을 만들기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 키트의 검증의 일부로서, 본 발명자들은 다양한 암 및 종양 표현형의 치료에 대한 강심배당체-함유 조성물의 임상전 평가(preclinical evaluation)를 실시하였다. 상기 평가는 생체내, 생체 밖, 시험관내 및 이종이식 동물 모델을 이용하여 실시하였다. 평가한 각 표현형의 경우, 조직 또는 세포 덩어리의 세포 샘플은 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼에 대한 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 비율을 측정하도록 분석하였다. 강심배당체에 대하여 반응성인 표현형 및 다수의 인간 종양 세포주에서 각 표현형에 대한 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼에 대한 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 비율 사이의 상관관계를 측정하였다. 치료적으로 반응성인 암 또는 종양 표현형 (또는 치료반응의 확률 증가를 갖는 것)은 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼에 대한 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 비율이 적어도 0.3이라고 결론지었다.
설치류(래트 또는 마우스) 암 세포는 음성 대조 샘플로 사용될 수 있다. 도 1a는 설치류종양 세포주의 웨스턴 블럿 분석의 겔에 대하여 생긴 필름을 도시한다. 본 발명자들의 데이터는 지금까지 시험된 모든 설치류(마우스 및 래트) 종양 세포주는 α3 서브유닛 이소폼이 결여되고 또 이들의 시험관내 증식은 강심배당체(예컨대 오우아바인, 올레안드린, 부팔린, 등)과 함께 배양하는 것에 의해서는 현저히 억제되지 않음을 나타내었다. 인간 종양 세포주는 일반적으로 쥐의 종양 세포에 비하여 강심배당체-함유 조성물에 의한 처리에 대하여 더욱 민감하다(도 1b). 본 발명자들은 치료 반응성의 차이는 상기 나타낸 바와 같이 2개의 상이한 종에서 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율 차이에 기인하는 것으로 믿고 있다.
α3 이소폼에 대한 항체는 양성 대조 샘플에서 α3 항원결정기에 대하여 동일한 활성(즉, 결합)을 나타낸 Affinity Bioreagents (Golden, CO), Novus (Littleton, CO) 또는 Sigma hemical Co. (St Louis, MO)를 비롯한 상이한 공급자로부터 유도될 수 있음이 중요하다.
인간에서, Na, K-ATPase의 α 서브유닛에서 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼 비율은 조직의 공급원 및 악성 상태에 따라 다양할 수 있다. 정상 및 악성 결정 조직으로부터 얻은 조직 샘플은 총 14명의 개인 피검체로부터 취하였다. 각 조직 샘플에서 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼 비율은 본 명세서에 기재된 바와 같이 측정된다. 도 2 및 하기한 표에 나타낸 데이터는 정상 조직에서 α3 이소폼의 상대적 결여 및 악성 조직의 약 66-70%에서 α3 이소폼의 존재를 나타낸다. 정상 및 악성 조직 모두 α1 서브유닛 이소폼을 함유한다.
Figure 712014004054615-pct00002
Na, K-ATPase의 α 서브유닛에 있어서 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼 비율은 배양된 세포주 뿐만 아니라 실제 종양 생검 샘플에서 다양한 인간 암 및 종양 표현형에 대하여 측정되었다. 또한, 강심배당체-함유 조성물에 의한 치료에 대한 각 표현형의 상대적 민감성은 시험관내 세포 배양 실험으로부터 유도된 데이터를 이용하여 측정하였다. 올레안드린-함유 조성물에 대한 데이터는 하기 표 및 도 3a에 자세하게 기재하였다.
Figure 712014004054615-pct00003
*는 125 nM 이하 농도에서 달성된 50% 미만 성장 억제를 나타낸다
**는 62 nM에서 달성된 50% 내지 75% 성장 억제를 나타냄
***는 62 nM에서 달성된 75% 이상의 성장 억제를 나타냄
상기 표에 정의한 바와 같이, "시험관내 반응"은 소정 종양 세포주의 증식이 소정 기간의 시간에 걸쳐 약물(강심배당체)의 소정 농도에 의해 억제되는 정도를 나타낸다. "반응없음"의 표시는 시험된 다중 약물 농도에서 50% 미만의 성장 억제를 나타낸다. 즉, 어떠한 농도도 IC50 값(실험의 소정 기간의 시간에 걸쳐 50%까지의 세포 성장 억제를 내는 농도)으로 확인될 수 없었다. 따라서, 상기 종양 세포주가 인간과 같은 포유동물에서 성장하는 것이라면, 상기 약물은 종양 성장의 현저한 억제를 내는데에는 효과가 없을 것이다. 상기 표에서 "부분적 반응"이라는 표시는 미처리 종양 세포 성장에 대하여 세포 증식을 50% 내지 75% 억제하는 올레안드린 또는 부팔린과 같은 소정 강심배당체의 능력을 나타낸다. 따라서, 인간과 같은 포유동물에서 종양 성장을 치료하기 위하여 강심배당체가 사용되면, 강심배당체에 대한 종양의 완전한 치료 반응에 비하여 부분적이거나 또는 덜 완전하다. 마지막으로, 상기 표에서 "완전 반응"의 표시는 미처리 종양 세포 집단에 대하여 종양 세포 증식을 75% 이상 억제하는 것을 나타낸다. 따라서, 포유동물에서 종양 성장(또는 완전한 치료반응)의 전체적 억제를 달성할 수 있다.
상술한 이소폼 비율을 기본으로 하여, 상기 방법은 다음을 예상한다: 1) MDA231, BXPC3 및 MCF7 세포주는 치료적으로 관련된 양의 강심배당체와의 처리에 대하여 실질적으로 비-반응성일 것이다; 2) SUM149 및 HCT116 세포주는 치료적으로 관련된 양의 강심배당체와의 처리에 대하여 적어도 부분적 반응성을 나타낼 것이다; 및 3) CACO2, HT29, LS174T, BRO, DOD-1 및 PANC1 세포주는 치료적으로 관련된 양의 강심배당체와의 처리에 대하여 완전한 치료 반응을 나타낼 것이다.
도 3a는 올레안드린(올레안드린으로 제공됨)의 농도(nM) 대 대조군의 성장 %를 도시한 것이다. 이 데이터는 평가된 세포주가 인간 종양 세포주 증식의 상대적 억제에 의해 결정되는 바와 같이 강심배당체 처리에 대한 이들의 반응에 따라서 3개의 상이한 그룹으로 분류될 수 있음을 나타낸다: 그룹 I - 125 nM 이하의 강심배당체의 농도에서 50% 미만의 성장 억제를 나타내는 세포; 그룹 II- 62 nM 이하의 강심배당체 농도에서 50% 이상의 성장억제를 나타내는 세포; 및 그룹 III- 62 nM 이하의 강심배당체 농도에서 75% 이상의 성장 억제를 나타내는 세포. 상기 그룹에 대한 예시적 세포주는 다음과 같다: 그룹 I- MDA231, BXPC3, MCF-7; 그룹 II - SUM149, BRO; 그룹 III- Panc-1, CaCo2. 반응 데이터는 이소폼 비율 데이터에 의해 예측되었다. 본 발명의 방법 및 키트의 견고함을 확립하기 위하여, 세포 반응 데이터의 통계학적 분석을 실시하였다. 도 3b의 데이터는 시험관에서 인간 종양 세포 증식을 억제하는 올레안드린-함유 조성물의 상대적 능력을 도시한다. 상기 데이터는 평균 ±SD로 도시한다. 올레안드린 매개된 세포 억제는 상대적 서브유닛 함량 α3/α1 이소폼 비율이 >1.0인 10개 세포주(다양한 고형 종양을 나타냄) 및 α3/α1 이소폼 비율이 < 1.0인 6개 세포주에서 조사하였다. 그 데이터는 상기 그룹 사이에 8-배 (800%) 차이가 있음을 나타낸다. 즉, α3/α1 이소폼 비율이 ≥ 1.0인 세포 주에서, 올레안드린은 α3 서브유닛 이소폼이 거의 발현되지 않는 세포주에 비하여 훨씬 더 효과적인 약물로 밝혀졌다. 이 데이터는 α3/α1 서브유닛 이소폼의 비율을 이용하여 강심배당체-함유 조성물에 의한 처리에 대한 암 또는 종양 세포주의 반응성을 예측할 수 있음을 증명한다.
강심배당체와의 처리에 대한 표적 악성 조직에 의한 치료 반응의 예상에 대한 α3/α1 이소폼 비율의 상대적 중요성의 다른 증거는 다음과 같이 확립하였다. 인간 췌장암 세포에서 α3 이소폼의 발현의 인위적인 하향 조절, 즉 Na, K-ATPase의 서브유닛의 이소폼 함량의 조작은 상기 세포를 α3 이소폼에 특이적인 siRNA(사일런싱 RNA)에 의해 형질감염시키는 것에 의해 달성하였다. 이 데이터는 α3 이소폼의 발현에서 감소를 나타낸다(웨스턴 블럿에 의해 나타낸 바와 같이(도 4a)). 웨스턴 블럿에 의한 α3의 발현 감소의 정량은 도 4b에 도시된 바와 같다. 도 4c는 α3 발현이 감소된 형질감염된 세포가 올레안드린에 의한 처리에 대한 민감성을 상실함을 나타낸다.
강심배당체와의 처리에 대한 표적 악성 조직에 의한 치료 반응의 확률에 대한 α3/α1 이소폼 비율의 상대적 중요성의 다른 증거는 Panc-1 세포를 α1 서브유닛 이소폼에 의해 형질감염시키는 것에 의해 확립하였다. Na, K-ATPase α1 서브유닛 이소폼은 정상적으로 α1 발현이 결여된 Panc-1 세포로 형질감염되었다. 도 5a 중의 대조 샘플은 형질감염되지 않은 Panc-1 세포이며, 또 도 5a 중의 α1 cDNA 샘플은 α1 이소폼에 의해 형질감염되었다. 그 결과 α1에 대한 α3의 비율은 형질감염된 Panc-1 세포에서 감소하였다(도 5b). 올레안드린 처리에 대한 형질감염된 Panc-1 세포의 민감성을 평가하였다. 올레안드린 처리에 대한 이들 형질감염된 세포의 민간성은 α1 형질감염된 세포(도 5c)에서 4.1 nM의 형질감염되지 않은 Panc-1 세포에서부터 50nM 이상으로 올레안드린의 IC50 값의 이동에 의해 드러나는 바와 같이 감소하였다. 따라서, 올레안드린의 항증식 활성은 α1 서브유닛 이소폼에 의해 형질감염된 Panc-1 세포에서 현저하게 감소하였다.
Na, K-ATPase 서브유닛의 α3 및 α1 이소폼의 검출 및 정량은 실시예 27에 자세히 나타낸 바와 같은 면역조직화학적 염색에 의해 달성될 수 있다. 세포는 면역조직화학적으로 염색되어서 α3 및 α1 이소폼이 상이하게 염색된다. 각 이소폼 형태의 함량을 정량하고 또 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼 함량의 비율을 측정한다. α3 및 α1 이소폼의 상이한 면역조직화학적 염색은 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예로서, 조직 샘플은 상이한 2개의 염색제(stain)에 의해 염색되며, 그 하나는 α3 이소폼에 대하여 선택적으로 또는 특이적으로 사용되고 또 나머지 하나의 염색제는 α1 이소폼에 대하여 선택적으로 또는 특이적으로 사용된다. 일부 구체예로서, 2개의 밀접하지만 상이한 샘플을 동일한 조직으로부터 얻고 염색하여서 제1 샘플은 α3 이소폼을 염색하도록 처리되고 및 제2 샘플은 α1 이소폼을 염색하도록 처리된다. α3 및 α1 이소폼의 양을 정량하고, 또 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율을 측정하였다. 상기 비율을 기초로 하여, 강심배당체에 의한 처리에 대한 조직의 치료반응의 가능성에 대한 예측을 실시한다.
면역조직화학적으로 염색된 샘플(세포 또는 조직 슬라이드)에서 Na, K-ATPase 서브유닛의 α3 이소폼 및 α1 이소폼의 정량은 수동 또는 자동 과정을 통하여 달성될 수 있다. 이들은 비제한적으로 적절하게 염색된 슬라이드의 세트 영역의 염색 세기를 개별적으로 등급매킨 다음 조사된 영역의 세트 번호의 평균 염색 세기[예컨대 상대적 염색 세기(예컨대 0-5의 세기, 이때 0은 검출될 수 없는 염색이고 또 5는 강력한 염색을 나타낸다)를 목측 관찰하는 것을 이용하여]를 집계하고 또 α1 에 대해 염색된 슬라이드에 대하여 α3 염색의 상대적 염색을 대조하며, 샘플 중에서 α1에 대한 α3의 비율을 산출하는 것을 포함한다. α1 및 α3의 상대적 염색의 정량(즉, 샘플에 존재하는 α1에 대한 α3의 비율)은 염색된 슬라이드의 세트 영역의 현미경 조사의 이용 및 상대적 염색 세기를 측정하기 위한 디지탈 분석 소프트웨어의 이용을 통하여 달성될 수 있다. 마찬가지로 컴퓨터 보조된 디지털 비데오 분석은 상대적 이소폼 염색을 측정하기 위해 및 α1 염색 세기에 대한 α3 염색 세기의 비율을 계산함으로써 샘플에 존재하는 α1 이소폼 함량에 대한 α3 이소폼의 비율을 측정하기 위해 실시될 수 있다.
예컨대, 도 6의 A-F는 DI　13782로부터 얻은 정상 피부 세포의 사진을 도시한다. 도 6의 A, C 및 E는 Na+/K+ATPase 면역반응성(면역조직화학적으로 착색됨)의 α 서브유닛을 도시한다. 도 6의 B, D 및 F는 상응하는 비-면역 (대조군) IgG 배양된 영역의 사진을 도시한다. 면역반응성의 강한 2+ 또는 3+ 수준은 정상 피부의 모든 공여자에서 발견되었다. 편평상피, 모근 상피세포, 피지선의 기저막, 땀 코일(sweat coils) 및 혈관 중의 단핵 림프구는 모두 양성적으로 염색되었다. 입모근은 약하게 면역활성이었다.
도 7의 A-H는 흑색종 세포의 사진을 도시한다. 도 7의 A, C, E 및 G는 Na+/K+ATPase 면역반응성(면역조직화학적으로 착색됨)의 α 서브유닛을 도시한다. 도 7의 B, D, F 및 H는 상응하는 비-면역 (대조군) IgG 배양된 영역을 도시한다. 도 7의 A 및 B는 DI 15838 세포를 도시한다. 도 7의 C 및 D는 DI 15840 세포를 도시한다. 도 7의 E 및 F는 DI 15842 세포를 도시한다. 도 7의 G 및 H는 DI 15844 세포를 도시한다. 모든 BCC 샘플은 다양한 정도의 세기를 갖는 Na+/K+ATPase에 대해 양성이었다. 모든 면역반응성은 종양 세포의 핵 및 세포질에 편재화되었다. 조직의 미분 면역조직화학적 염색에 이어, α1 서브유닛 이소폼에 대한 α3 서브유닛 이소폼의 비율이 결정될 수 있고 또 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 치료 반응성에 대한 예측도 행할 수 있다.
다른 강심배당체에 대한 본 발명의 방법의 상관성을 평가하였다. 후아찬수(Huachansu)는 부파디에놀리데스로 공지된 강심배당체를 함유하는 두꺼비 피부추출물이다. 후아찬수를 사용한 치료에 대한 2개의 인간 췌장 세포주 (SW1990 및 Panc-1)의 반응성을 평가하였다. 상기 표에 주어진 데이터를 기초로 하여, SW1990 세포는 후아찬수에 대하여 치료적으로 반응성이 아닐 것이고, Panc-1 세포는 후아찬수에 대하여 치료적으로 반응성일 것이라고 예측할 것이다. 이러한 반응 데이터는 예상된 결과를 제공하였다.
하기 실시예는 암 및 종양 관련 질병 및 장애의 치료에서 강심배당체의 효능의 증거를 포함한다. 실시예 21은 전이 췌장 가스트리노마를 갖는 환자 치료의 케이스 이력을 포함한다. 본 발명의 예후 검정법, 방법 및 키트는 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애 분야에서 공지된 1 이상의 다른 예후 또는 진단 검정법, 방법 및 키트와 조합하여 사용될 수 있다. 예컨대, 임상의가 강심배당체와 다른 화학요법제 또는 방사능 요법과 조합하여 암 또는 종양을 갖는 피검체를 치료하고자 하면, 피검체가 갖는 암 또는 종양의 특정 표현형이 상술한 다른 화학요법제 또는 방사능 요법에 의한 치료에 대하여 적어도 부분적으로 치료적으로 반응성이라는 것이 공지되어 있으며, 본 발명은 강심배당체를 사용하여 치료될 때 피검체에서 암 또는 종양의 적어도 부분적 치료반응의 확률을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 상기 결과가 암 또는 종양이 강심배당체와의 처리에 대하여 치료적으로 반응성일 것이라는 확률 증가가 있음을 나타내면, 임상의는 강심배당체와 기타 치료제 또는 방사능요법 또는 이들의 조합에 의해 암 또는 종양의 치료를 처방 및/또는 투여할 수 있다.
상기 강심배당체는 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애의 치료에서 치료 활성을 갖는 것으로 알려진 임의의 강심배당체일 수 있다. 이러한 강심배당체는 순수한 형태 또는 1 이상의 다른 화합물과의 혼합물로서 존재할 수 있다. 상기 강심배당체는 추출물로서 존재할 수 있다. 상기 추출물은 초임계적 유체(SCF) 이산화탄소(CO2) 추출에 의해 제조되거나 또는 이러한 추출물의 화학적으로 변형된 형태일 수 있다(예컨대 에탄올을 포함하는 추출물 또는 SCF CO2 및 에탄올을 사용하여 제조된 것). 상기 추출물은 식물 또는 동물 물질로부터 얻을 수 있다. 동물 물질은 두꺼비(유럽두꺼비(Bufo bufo))의 삼출물일 수 있다. 식물 물질은 네륨 올레안더와 같은 네륨 종 또는 테베티아 네리폴리아(Thevetia nerifolia) 또는 테베티아 푸루비아나(Thevetia puruviana)(다르게는 황색 올레안더로 알려짐)와 같은 테베티아(Thevetia) 종으로부터 얻을 수 있다. 상기 추출 과정은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 포함되거나 본 명세서에 기재된 방법에 의해 실시되는 현재 계류중인 미국 가출원 번호. 60/653,210호(애딩톤의 이름으로 2005년 2월 15일 출원) 또는 미국 출원 번호 11/340,016호(애딩톤의 이름으로 2006년 1월 26일 출원), 미국 출원 번호 11/191,650호(애딩톤의 이름으로 2006년 7월 28일 출원)(현재 2008년 7월 22일자로 미국특허 7,402,325호로 등록됨) 또는 PCT 국제 특허 출원 번호 PCT/US06/29061호(2006년 7월 26일 출원)에 기재된 방법에 따라서 제조된 네륨 올레안더 잎의 건조된 분말 상에서 실시하였다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "올레안드린"은 다르게 특정되지 않는 한 올레안드린의 모든 공지 형태를 의미하는 것으로 이해된다. 올레안드린은 라세미체, 광학적으로 순수한 형태 또는 광학적으로 농축된 형태로 존재할 수 있다. 네륨 올레안더 식물 물질은 예컨대 텍사스 아타스코사에 소재하는 알드리지 너서리와 같은 상업적 식물 공급자로부터 얻을 수 있다.
상기 추출물은 강심배당체-함유 식물 덩어리의 변형된(예컨대 에탄올) 또는 비변형 초임계적 유체 추출에 의해 얻을 수 있다. 상기 초임계적 유체 추출물은 추출물을 피검체에 투여할 때 강심배당체의 치료 효능에 공헌하는 적어도 1개의 다른 약리학적 활성제를 포함할 수 있다. 이것은 강심배당체의 치료 효능에 대하여 부가적으로 또는 상승작용적으로 공헌할 수 있다.
상기 추출물은 다양한 공지 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 추출물은 물 중의 식물 추출물의 제조 방법을 개시하는 후세인 지야 오젤 박사(미국 특허 제5,135,745호)에 의해 개발된 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 수성 추출물은 분자량이 2KD 내지 30 KD인 몇 개의 다당류, 올레안드린 및 올레안드리게닌, 오도로시드 및 네리탈로시드를 함유하는 것으로 보고되어 있다. 상기 다당류는 산성 호모폴리갈락투로난 또는 아라비노갈락투로난을 포함한다. 셀바라지 등에 의한 미국 특허 제5,869,060호는 네륨 종의 열수 추출물 및 그의 제조 방법을 개시한다. 생성한 추출물은 동결건조되어 분말을 생성할 수 있다. 미국 특허 제6,565,897호(셀바라지 등에 의한 미국 등록전 공고 번호 20020114852호 및 PCT 국제 공개 번호 WO 2000/016793호)는 실질적으로 멸균 추출물의 열수 추출 방법을 개시한다. 에르데모글루 등(J. Ethnopharmacol. (2003) Nov. 89(1), 123-129)은 통증억제제 및 항-염증 활성을 기본으로 하여 네륨 올레안더를 비롯한 식물의 수성 및 에탄올 추출물의 대조 결과를 개시한다. 네륨 올레안더의 유기 용매 추출은 Adome 등(Afr . Health Sci. (2003) Aug. 3(2), 77-86; 에탄올성 추출물), 엘-샤즐리 등(J. Egypt Soc . Parasitol. (1996), Aug. 26(2), 461-473; 에탄올성 추출물), 베굼 등 (Phytochemistry (1999) Feb. 50(3), 435-438; Methanol Extract), 지아 등 (J. Ethnolpharmacol. (1995) Nov. 49(1), 33-39; 메탄올성 추출물), 및 블라센코 등(Farmatsiia . (1972) Sept.-Oct. 21(5), 46-47; 알코올성 추출물)에 기재되어 있다. 싱흐 등에 의한 미국 등록전 특허 출원 공개 20040247660호는 암 치료에 사용하기 위한 올레안드린의 단백질 안정화된 리포좀 제형의 제조를 개시한다. 싱흐 등에 의한 미국 등록전 특허 출원 공개 20050026849호는 시클로덱스트린을 함유하는 올레안드린의 수용성 제형을 개시한다. 싱흐 등에 의한 미국 등록전 특허 출원 공개 20040082521호는 열수 추출로부터 얻은 올레안드린의 단백질 안정화된 나노입자 제형의 제조를 개시한다.
SCF 추출은 식물 덩어리로부터 소망하는 화합물 추출을 향상시키도록 에탄올과 같은 초임계적 유체 중, 변형제(modifier) 존재하에서 실시할 수 있다. 변형제는 일반적으로 추출될 초임계적 유체 및 화합물 사이에 휘발성을 보유하며, 또 이들은 초임계적 유체와 혼화성이어야 한다. 일부 구체예로서, 상기 변형제는 주위 조건에서 액체이다. 예시적으로 또 비제한적으로, 변형제는 에탄올, 메탄올, 프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 염화 메틸렌 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 추출물은 올레안드린 또는 기타 강심배당체, 올레아시드, 및 기타 식물 물질과 같은 약리학적 활성 화합물의 혼합물이다. 초임계적 유체 공정으로부터의 올레안드린 추출물은 이론적 중량 범위로 0.9중량% 내지 2.5 중량%로 함유한다. 다양한 양의 올레안드린을 포함하는 SCF 추출물을 얻었다. 일 구체예로서, SCF 추출물은 약 2 중량%의 올레안드린을 포함한다.
본 명세서에 제시된 데이터에 의해 분명한 바와 같이, 상기 SCF 추출물은 다양한 성분의 혼합물을 포함한다. 이들 성분의 일부는 올레안드린, 올레아시드 A, 올레안드리게닌, 네리탈로시드, 오도르시드 (Wang X, Plomley JB, Newman RA and Cisneros A. LC/MS/MS analyses of an Oleander extract for cancer treatment, Analytical Chem. 72: 3547-3552, 2000), 및 기타 미확인 성분를 포함한다. 상기 SCF 추출물의 SCF 추출성 미확인 성분은 SCF 추출물 중의 올레안드린이 효능에 기여하는 적어도 1개의 다른 약리학적 활성성분을 포함하는 것으로 보인다. 즉, 적어도 1개의 다른 SCF 추출가능한 성분은 올레안드린과 부가적으로 또는 상승작용적으로 작용하여 관찰된 효능을 제공한다.
상기 추출물은 몇 개 종양 세포주에 대한 효능에 의해 측정되는 바와 같은 상대적 성능에서 다를 수 있다. 그런 경우, 강심배당체가 치료적으로 관련된 투여량을 제조할 수 있는 추출물 중의 충분히 높은 양 또는 농도로 존재하면, 상기 추출물은 본 발명의 일부로 간주된다. 하기 표는 강심배당체 올레안드린의 3개의 상이한 형태에 대한 상대적 효능 데이터의 일부를 요약한 것이다.
Figure 712014004054615-pct00004
* 시험된 화합물의 IC50은 이들 추출물에서 농도에 상응하는 마이크로몰(mM) 올레안드린으로서 제공된다. 즉, 상기 데이터는 미처리 세포와 비교하여 종양 세포 성장의 성장 또는 증식을 50% 억제하는데 필요한 자유 화학물질 또는 추출물의 일부로서 올레안드린의 농도를 나타낸다.
상기 표에 나타낸 바와 같이, 임계적 CO2 추출물의 IC50 값은 Panc-1 및 BRO 세포 모두에서 올레안드린 단독의 값의 50%에 불과하며, 이는 올레안더의 초임계적 CO2 추출물이 Panc-1 또는 BRO 세포의 성장 억제에 대한 올레안드린 단독의 값에 비하여 적어도 2배 더 강하다(더욱 강력한)는 것을 제시한다. 대조적으로, 열수 추출물은 시험된 3개 성분 중에서 가장 약하다. 상기 데이터는 다음과 같이 생기는 상대적 효능을 갖는 추출물뿐만 아니라 올레안드린에 의해 인간 종양 세포주에 대하여 강력한 세포 독성을 나타낸다: 초임계적 CO2 추출물> 올레안드린> 열수 추출물. 이들 데이터는 초임계적 CO2 추출물의 세포독성은 올레안드린 이외에 SCF 추출물에서 적어도 1개의 다른 약리학적 활성 성분의 존재에 기인함을 암시하며 또 초임계적 CO2 추출물의 효능은 열수 추출물의 효능에 비하여 훨씬 더 큰(7.4 배) 것을 암시한다. 상기 데이터는 열수 추출물 및 올레안드린 단독에 대하여 SCF 추출물의 효능에서 실질적인 향상을 분명히 나타낸다. 효능의 개선은 SCF 추출물 중의 올레안드린의 농도 증가시에만 얻어질 수 있는 예상된 개선을 초과하였다.
본 발명은 또한 본 발명의 SCF 또는 물 추출물과 같은 추출물 유효량으로 세포를 처리하는 것에 의해 암 또는 종양 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
상기 강심배당체는 적합한 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화될 수 있다. 비경구적, 귀, 눈, 코, 흡입성, 볼내, 설하, 장내, 국소, 입, 경구, 및 주사가능한 투여 형태가 특히 유용하다. 특히 투여 형태는 고체 또는 액체 투여 형태를 포함한다. 예시적으로 적합한 투여 형태는 정제, 캡슐, 환약, 당의정, 트로체, 사쉐, 및 기타 약학 분야의 당업자에게 공지된 투여 형태를 포함한다.
본 발명의 단위 투여량에 혼입된 올레안드린의 양은 적어도 1개의 투여 형태일 수 있고 또 약학의 공지 원리에 따라 선택할 수 있다. 치료 화합물의 치료적으로 유효량 또는 치료적으로 관련된 양을 특별히 고려할 수 있다. 용어 "유효량"이라는 것은 예컨대 약제의 경우 약제학적 유효량을 고려할 수 있다. 약제학적 유효량은 필요한 또는 소망하는 치료 반응에 충분한 활성 성분의 양, 또는 즉 환자에게 투여될 때 인지가능한 생물학적 반응을 유도하기에 충분한 양이다. 인지가능한 생물학적 반응은 활성 물질의 단일 또는 다수 단일 투여량을 투여한 결과로 생길 수 있다. 단위 투여량은 1 이상의 투여 형태를 포함할 수 있다. 환자에 대한 특정 투여량 수준은 처리할 질병, 질병의 심각도, 환자 건강, 연령, 성별, 체중, 영양 상태, 약리학적 반응, 적용한 특정 투여 형태를 비롯한 다수의 인자 및 기타 인자에 따라 다름을 이해해야 할 것이다.
경구 투여를 위해 필요한 투여량은 5 이하의 투여 형태이지만, 최소 1회 최대 10회 투여 형태를 투여할 수 있다. 투여 형태의 예는 투여 당 총 0.6 내지 60 mg (1 내지 10회 투여 수준)에 대하여 0.6 mg의 SCF 추출물/투여 형태를 함유한다.
상기 강심배당체는 12 내지 1200 ㎍ 정도의 올레안드린의 초기 투여량을 피검체에 제공하기에 충분한 양의 투여 형태로 존재할 수 있다.
포유동물 처리에서 사용하는 경우, 상기 강심배당체는 투여 형태에 포함될 수 있다. 투여 형태의 일부 구체예는 장용 코팅되지 않으며 또 0.5 내지 1 시간 이하의 기간 내에 강심배당체를 방출한다. 투여 형태의 일부 구체예는 장용 코팅되고 또 빈창자, 회장, 소장 및/또는 대장(결장)과 같은 위장 아래의 배당체를 방출한다. 장용 코팅된 투여 형태는 경구 투여한 후 1-10시간 이내에 전신 순환에 강심배당체를 방출할 것이다.
예비적 동물 투여 데이터를 기본으로 하여, 50 내지 75%의 투여량의 올레안더 추출물은 경구적으로 이용가능할 것으로 예상되므로, 투여형태당 0.25 내지 0.4 mg, 0.1 내지 50 mg, 0.1 내지 40 mg, 0.2 내지 40 mg, 0.2 내지 30 mg, 0.2 내지 20 mg, 0.2 내지 10 mg, 0.2 내지 5 mg, 0.2 내지 2.5 mg, 0.2 내지 2 mg, 0.2 내지 1.5 mg, 0.2 내지 1 mg, 0.2 내지 0.8 mg, 0.2 내지 0.7, 또는 0.25 내지 0.5 mg의 올레안드린을 제공할 것이다. 성인에서 5리터의 평균 혈액 부피를 고려할 때, 예상되는 올레안드린 혈장 농도는 0.05 내지 2 ng/ml, 0.005 내지 10 ng/mL, 0.005 내지 8 ng/mL, 0.01 내지 7 ng/mL, 0.02 내지 7 ng/mL, 0.03 내지 6 ng/mL, 0.04 내지 5 ng/mL, 또는 0.05 내지 2.5 ng/mL 범위일 것이다. SCF 추출물에 존재하는 올레안드린의 추천된 매일 투여량은 일반적으로 매일 약 0.25 내지 약 50 mg 2회, 또는 매일 2회 또는 12시간 마다 약 0.9 내지 5 mg이다. 상기 투여량은 약 0.5 내지 약 100 mg/일, 약 1 내지 약 80 mg/일, 약 1.5 내지 약 60 mg/일, 약 1.8 내지 약 60 mg/일, 약 1.8 내지 약 40 mg/일일 수 있다. 최대 허용 투여량은 올레안드린을 함유하는 약 100 mg/일, 약 80 mg/일, 약 60 mg/일, 약 40 mg/일, 약 38.4 mg/일 또는 약 30 mg/일의 올레안더 추출물일 수 있고 또 최소 효과 투여량은 약 0.5 mg/일, 약 1 mg/일, 약 1.5 mg/일, 약 1.8 mg/일, 약 2 mg/일, 또는 약 5 mg/일 일 수 있다.
본 발명의 키트 또는 조성물은 분석적으로 또는 약제학적 용도에 적합한 임의의 부형제를 포함할 수 있다.
본 명세서의 기재된 화합물은 본 발명의 제형에서 1 이상의 기능을 보유하는 것으로 알아야 한다. 예컨대, 상기 화합물은 계면활성제 및 수혼화성 용매로서 작용하거나 또는 계면활성제 및 수불혼화성 용매로서 작용할 수 있다.
액체 조성물은 1 이상의 약제학적으로 허용되는 또는 분석적으로 허용되는 액체 담체를 포함할 수 있다. 액체 담체는 수성, 비수성, 극성, 비극성, 및/또는 유기 담체일 수 있다. 액체 담체의 예는 비제한적으로 수 혼화성 용매, 물 비혼화성 용매, 물, 완충액 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "수용성 용매" 또는 "수혼화성 용매"는 상호 교환적으로 이용되며, 물과 이상 혼합물을 형성하지 않거나 또는 물에 충분히 용해성이어서 액체 상의 분리 없이 적어도 5%의 용매를 함유하는 수성 용매 혼합물을 제공하는 유기 액체를 지칭한다. 이러한 용매는 인간 또는 동물에 투여하기에 적합하다. 수용성 용매의 예는 비제한적으로 PEG(폴리(에틸렌 글리콜)), PEG 400(폴리(분자량이 약 400인 에틸렌 글리콜), 에탄올, 아세톤, 알칸올, 알코올, 에테르, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 트리아세틴, 폴리(프로필렌 글리콜), PVP(폴리(비닐 피롤리돈)), 디메틸설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 피리딘, 프로판올, N-메틸아세트아미드, 부탄올, 솔루포르 (2-피롤리돈), 파마솔브 (N-메틸-2-피롤리돈)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "수불용성 용매" 또는 "수 불혼화성 용매"는 상호 교환적으로 사용되는 용어로서 물과 이상(biphasic) 혼합물을 형성하거나 또는 물 중의 용매의 비율이 5%를 초과할 때 상 분리를 제공하는 유기 액체를 지칭한다. 상기 용매는 인간 또는 동물에 투여하기에 적합하다. 예시적인 수불용성 용매는 비제한적으로 중쇄/장쇄 트리글리세리드, 오일, 피마자유, 옥수수유, 비타민 E, 비타민 E 유도체, 올레산, 지방산, 올리브오일, softisan 645 (Di글리세릴 카프릴레이트/카프레이트/스테아레이트/히드록시 스테아레이트 아디페이트), 미글리올, Captex (Captex 350: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/라우레이트 트리글리세리드; Captex 355: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 트리글리세리드; Captex 355 EP/NF: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 중쇄 트리글리세리드)를 포함한다.
적합한 용매는 "International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guidance for industry Q3C Impurities : Residual Solvents" (1997)에 수록되어 있으며, 약제학에서 안전한 것으로 간주되는 잔류 용매의 양을 추천하고 있다. 예시된 용매는 클래스 2 또는 클래스 3 용매로 수록된다. 클래스 3 용매는 예컨대, 아세트산, 아세톤, 아니솔, 1-부탄올, 2-부탄올, 부틸 아세테이트, tert-부틸메틸 에테르, 큐멘, 에탄올, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 에틸 포르메이트, 포름산, 헵텐, 이소부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 메틸 아세테이트, 메틸-1-부탄올, 메틸에틸 케톤, 메틸이소부틸 케톤, 2-메틸-1-프로판올, 펜탄, 1-펜탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 또는 프로필 아세테이트을 포함한다.
본 발명에서 물과 혼화될 수 없는 용매로서 사용될 수 있는 다른 물질은 다음을 포함한다: Captex 100: 프로필렌 글리콜 디카프레이트; Captex 200: 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트; Captex 200 P: 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트; 프로필렌 글리콜 디카프릴로카프레이트; Captex 300: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트; Captex 300 EP/NF: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 중쇄 트리글리세리드; Captex 350: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/라우레이트; Captex 355: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트; Captex 355 EP/NF: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 중쇄 트리글리세리드; Captex 500: 트리아세틴; Captex 500 P: 트리아세틴(약제 등급); Captex 800: 프로필렌 글리콜 디(2-에틸헥사노에이트); Captex 810 D: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/리놀레에이트; Captex 1000: 글리세릴 트리카프레이트; Captex CA: 중쇄 트리글리세리드; Captex MCT-170: 중쇄 트리글리세리드; Capmul GMO: 글리세릴 모노올레에이트; Capmul GMO-50 EP/NF: 글리세릴 모노올레에이트; Capmul MCM: 중쇄 모노- 및 디글리세리드; Capmul MCM C8: 글리세릴 모노카프릴레이트; Capmul MCM C10: 글리세릴 모노카프레이트; Capmul PG-8: 프로필렌 글리콜 모노카프릴레이트; Capmul PG-12: 프로필렌 글리콜 Mono라우레이트; Caprol 10G10O: 데카글리세롤 데카올레에이트; Caprol 3GO: 트리글리세롤 모노올레에이트; Caprol ET: 혼합된 지방산의 폴리글리세롤 에스테르; Caprol MPGO: 헥사글리세롤 디올레에이트; Caprol PGE 860: 데카글리세롤 모노-, 디올레에이트.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "계면활성제"는 극성 또는 하전된 친수성 잔기 뿐만아니라 비극성 소수성 (친유성) 잔기를 포함하는 화합물을 지칭하며; 즉, 계면활성제는 양쪽성이다. 용어 계면활성제는 1개 화합물 또는 화합물의 혼합물을 지칭할 수 있다. 계면활성제는 용해제, 유화제 또는 분산제를 포함한다. 계면활성제는 친수성 또는 소수성일 수 있다.
친수성 계면활성제는 약제학적 조성물에 적합한 친수성 계면활성제일 수 있다. 이러한 계면활성제는 비이온성 친수성 계면활성제가 현재 바람직하지만, 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성 또는 비이온성일 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, 이들 비이온성 친수성 계면활성제는 일반적으로 약 10 보다 큰 HLB 값을 가질 것이다. 친수성 계면활성제의 혼합물은 본 발명의 범위에 속한다.
유사하게, 소수성 계면활성제는 약제학적 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 소수성 계면활성제일 수 있다. 일반적으로, 적합한 소수성 계면활성제는 약 10 미만의 HLB 값을 가질 것이다. 소수성 계면활성제의 혼합물은 본 발명의 범위에 속한다.
부가적으로 적합한 용해화제의 예는 다음을 포함한다: 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 벤질 알코올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄디올 및 이들의 이성질체, 글리세롤, 펜타에리트리톨, 소르비톨, 만니톨, 트랜스큐톨, 디메틸 이소소르바이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 기타 셀룰로오스 유도체, 시클로덱스트린 및 시클로덱스트린 유도체와 같은 알코올 및 폴리올; 테트라히드로푸르푸릴 알코올 PEG 에테르 (글리코푸롤, 테트라글리콜이란 상품명으로 BASF에 의해 시판됨) 또는 메톡시 PEG (Union Carbide)와 같은 약 200 내지 약 6000의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜의 에테르; 2-피롤리돈, 2-피페리돈,카프로락탐, N-알킬피롤리돈, N-히드록시알킬피롤리돈, N-알킬피페리돈, N-알킬카프로락탐, 디메틸아세트아미드, 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 아미드; 에틸 프로피오네이트, 트리부틸시트레이트, 아세틸 트리에틸 시트레이트, 아세틸 트리부틸 시트레이트, 트리에틸 시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 카프릴레이트, 에틸 부티레이트, 트리아세틴, 프로필렌 글리콜 모노아세테이트, 프로필렌 글리콜 디아세테이트, 카프로락톤 및 이들의 이성질체, 발레로락톤 및 이들의 이성질체, 부티로락톤 및 이들의 이성질체와 같은 에스테르; 및 디메틸 아세트아미드, 디메틸 이소소르바이드(Arlasolve DMI (ICI)), N-메틸 피롤리돈(파마솔브(ISP)), 모노옥타노인, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르(트랜스큐톨이란 상품명으로 Gattefosse로부터 입수가능)와 같은 기타 당해 분야에 공지된 용해화제, 및 물을 포함한다. 용해화제의 혼합물도 또한 본 발명의 범위에 속한다.
지시된 것을 제외하고는, 본 명세서에 언급된 화합물은 표준 상업적 공급원으로부터 용이하게 얻을 수 있다.
투명 액체 조성물은 조성물의 전체 중량을 기준으로 5 중량% 미만, 3 중량% 미만 또는 1 중량% 미만의 현탁된 고체를 함유하므로 육안 목측으로 투명할 것이다.
필수적인 것은 아니지만, 본 발명의 조성물 또는 키트는 킬레이트화제, 보존제, 산화방지제, 흡수제, 산성화제, 알칼리화제, 소포제, 완충제, 착색제, 전해질, 염, 안정화제, 장성 조절제(tonicity modifier), 희석제, 기타 약제학적 부형제, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "산화방지제"는 산화를 억제하는 물질로서 산화 과정에 의한 제제의 악화를 방지하기 위해 사용된다. 이러한 화합물의 예는 비제한적으로 아스코르브산, 아스코르빅 팔미테이트, 비타민 E, 비타민 E 유도체, 부틸화된 히드록시아니솔, 부틸화된 히드록시톨루엔, 차아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 아스코르브산 나트륨, 아황산 나트륨, 나트륨 포름알데히드 설폭실레이트, 나트륨 메탈비설파이트 및 기타 당업자에게 공지된 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "킬레이트화제"는 용액에서 금속 이온을 킬레이트화하는 화합물을 의미한다. 킬레이트화제의 예는 EDTA(테트라나트륨 에틸렌디아민 테트라아세테이트), DTPA(펜타나트륨 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트), HEDTA(N-(히드록시에틸)-에틸렌디아민 트리아세트산의 트리나트륨 염), NTA(트리나트륨 니트릴로트리아세테이트), 디나트륨 에탄올디글리신(Na2EDG), 나트륨 디에탄올글리신(DEGNa), 시트르산, 및 기타 당업자에게 공지된 화합물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "흡착제"는 물리적 또는 화학적 (화학흡착) 수단에 의해 표면 상으로 다른 분자를 붙잡을 수 있는 물질을 지칭한다. 이러한 화합물의 예는 비제한적으로 분말화된 및 활성화된 목탄 및 기타 당업자에게 공지된 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "알칼리화제"는 알칼리성 매질을 제공하기 위하여 사용되는 화합물을 지칭한다. 이러한 화합물의 예는 비제한적으로 암모니아 용액, 탄산 암모늄, 디에탄올아민, 모노에탄올아민, 수산화 칼륨, 붕산나트륨, 탄산 나트륨, 중탄산 나트륨, 수산화 나트륨, 트리에탄올아민, 및 트롤아민 및 당업자에게 공지된 기타 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "산성화제"는 산성 매질을 제공하기 위해 사용되는 화합물을 지칭한다. 이러한 화합물의 예는 비제한적으로 아세트산, 아미노산, 시트르산, 푸마르산 및 기타 알파 히드록시산, 염산, 아스코르브산, 및 질산 및 당업자에게 공지된 기타 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "소포제"는 충전 조성물의 표면 상에 형성되는 거품의 양을 방지 또는 감소시키는 화합물 또는 화합물들을 지칭한다. 이러한 소포제의 예는 비제한적으로 디메티콘, 시메티콘(SIMETHICONE), 옥톡시놀 및 당업자에게 공지된 기타 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "완충제"는 희석시 또는 산 또는 알칼리 부가시 pH 변화에 견디기 위하여 사용되는 화합물을 지칭한다. 이러한 화합물의 예는 비제한적으로 메타인산 칼륨, 인산 칼륨, 일염기성 아세트산 나트륨 및 시트르산 나트륨 무수물 및 탈수물 및 당업자에게 공지된 기타 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "희석제" 또는 "충전제"는 정제 및 캡슐의 제제에서 소망하는 부피, 유동 특성 및 압축 특징을 얻기 위하여 충전제로서 사용되는 불활성 물질을 지칭한다. 이러한 화합물은 비제한적인 예로서 이염기성 인산 칼슘, 카올린, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 미세측정성 셀룰로오스, 분말화된 셀룰로오스, 석출된 탄산 칼슘, 소르비톨, 및 녹말 및 기타 당업자에게 공지된 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "보존제"는 미생물의 성장을 억제하기 위해 사용되는 화합물을 지칭한다. 이러한 화합물은 비제한적인 예로서 염화 벤즈알코늄, 염화 벤제토늄, 벤조산, 벤질 알코올, 염화 세틸피리디늄, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 페닐질산 수은, 페닐머큐릭 아세테이트, 티메로살, 메타크레솔, 염화 미리스틸감마 피콜리늄, 칼륨 벤조에이트, 소르브산 칼륨, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 프로피오네이트, 소르브산, 티몰, 및 메틸, 에틸, 프로필, 또는 부틸 파라벤 및 당업자에게 공지된 기타 공지물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "착색제"는 약제학적 제제에 색을 부여하기 위하여 사용되는 화합물을 지칭한다. 이러한 화합물은 비제한적인 예로서 FD&C 적색 3호, FD&C 적색 20호, FD&C 황색 6호, FD&C 청색 2호, FD&C 녹색 5호, FD&C 오렌지 5호, FD&C 적색 8호, 카라멜, 및 산화철 (흑색, 적색, 황색), 기타 FD&C 염료 및 포도 껍질 추출물, 비트 적색 분말, 베타-카로텐, 아나토(annato), 카르민, 투메릭(turmeric), 파프리카, 이들의 조합과 같은 천연 착색제 및 기타 당업자에게 공지된 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "안정화제"는 물질의 활성을 감소시킬 수 있는 물리적, 화학적, 또는 생화학적 과정에 대한 활성제를 안정화시키기 위해 사용되는 화합물을 지칭한다. 적절한 안정화제는 비제한적인 예로서 알부민, 시알산, 크레아티닌, 글리신 및 기타 아미노산, 니아신아미드, 나트륨 아세틸트립토포네이트, 산화아연, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카프릴레이트 및 나트륨 사카린 및 당업자에게 공지된 기타 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "장성 조절제"는 액체 제형의 긴장성을 조절하기 위해 사용될 수 있는 화합물 또는 화합물들을 의미한다. 적합한 장성 조절제는 글리세린, 락토오스, 만니톨, 덱스트로오스, 염화나트륨, 황산나트륨, 소르비톨, 트레할로오스 및 기타 당업자에게 공지된 것을 포함한다.
실시예 3 및 6은 예시적 캡슐 투여 형태를 기재한다. 실시예 12는 예시적 정제 투여 형태를 기재한다.
본 발명의 조성물은 고정된 오일, 땅콩 오일, 참기름, 면실유, 옥수수유 및 올리브오일과 같은 오일; 올레산, 스테아르산 및 이소스테아르산과 같은 지방산; 및 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 지방산 글리세리드 및 아세틸화 지방산 글리세리드와 같은 지방산 에스테르를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한 에탄올, 이소프로판올, 헥사데실 알코올, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜과 같은 알코올; 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올과 같은 글리세롤 케탈; 폴리(에틸렌 글리콜) 450과 같은 에테르; 무기오일 및 바셀린(petrolatum)과 같은 석유 탄화수소; 약제학적으로 적합한 계면활성제, 현탁제 또는 유화제; 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다.
약제학적 제형 분야에 사용되는 화합물은 일반적으로 다양한 기능 또는 목적을 나타내는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 본 명세서에 예시한 화합물을 오직 1회 언급하거나 또는 본 명세서에 1 이상 정의하여 사용하면, 그의 목적 또는 기능은 예시한 목적 또는 기능만으로 제한되지 않음을 이해해야 한다.
제형의 1 이상의 성분은 자유 형태 또는 약제학적으로 또는 분석적으로 허용되는 염 형태로 존재할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 또는 분석적으로 허용되는 염은 필요에 따라 산과 반응하여 이온적으로 결합된 쌍을 형성하는 것에 의해 변형되는 화합물을 지칭한다. 허용되는 염의 예는 예컨대, 비독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 통상적인 비독성 염을 포함한다. 적합한 비독성 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 설폰산, 설팜산, 인산, 질산 및 당업자에게 공지된 기타 물질과 같은 무기산으로부터 유도된 것을 포함한다. 아미노산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, ㅌ타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모익산, 말레산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 이세티온산 및 당업자에게 공지된 기타 물질과 같은 유기산으로부터 제조된 염을 포함한다. 다른 적합한 염의 목록은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th. ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418에 기재되어 있으며, 이 관련 부분은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 건전한 의과적 판단 범위에서 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 또 과도한 독성, 자극, 앨러지 반응 또는 기타 문제 또는 복합증 없이 사용하기에 적합하며, 합리적인 이점/위험 비율이 균형잡힌 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
상기 기재한 내용 및 하기 실시예의 측면에서, 당업자들은 과도한 실험 없이 청구된 바와 같이 본 발명을 실시할 수 있을 것이다. 상기 내용은 본 발명의 구체예의 제조를 위한 특정 과정을 자세히 나타내는 하기 실시예를 참조하면 더욱 잘 이해될 것이다. 이들 실시예에 대한 모든 참조문헌은 예시적으로 목적으로 제공된 것이다. 하기 실시예는 완전한 것은 아니며, 본 발명에 의해 숙고된 다수의 구체예의 일부를 예시적으로 나타낸 것이다.
올레안드린 및 MTT는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. BODIPY-올레안드린, Mito-Tracker Red CM-H2XRos, 칼세인 아세톡시메틸 (CAM) 에스테르 및 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)은 Molecular Probes-Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA)으로부터 얻었다. 항 β-액틴 항체는 시그마(Sigma)로부터 구입하였다.
인간 췌장암 세포: Panc-1, BxPC3, MiaPaca; 인간 결장 암 세포주: CaCO-2, DOD-1, HCT-116, HT29, RKO 및 LST174; 설치류 흑색종 B16 세포; 인간 유방암 세포: SUM149, MCF-7 및 MDA231; 인간 구강암 세포: SCC9 및 CAL-27; 인간 난소암 ES3, TOV1120 및 SKOV 세포 및 인간 비-소형 세포 폐암 A549 및 H1299 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (Manassas, VA)으로부터 입수하였고 또 5% CO2를 함유하는 가습 분위기 하, 37℃에서 유지하였다. 인간 흑색종 BRO 세포는 스테린 파운데이션 (Houston, TX)으로 선물로 받았다. 상이한 상피세포 기원으로부터 유도된 세포주는 보통 10% 열 불활성화된 소태아 혈청 (FBS) 하이클론 라보라토리스 인코포레이티드, 유타 로간 소재), 50 IU/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신, 및 GIBCO (인비트로겐)로부터 2 mM L-글루타민이 보충된 조직 배양 배지(인비트로겐 코포레이션, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재) (표 1)에서 통상적으로 배양하였다.
실시예 1
분말화된 올레안더 잎의 초임계적 유체 추출
방법 A. 이산화탄소를 사용함.
분말화된 올레안더 잎은 올레안더 잎 물질을 수집하고, 세척 및 건조시킨 다음 그 올레안더 잎 물질을 미국특허 5,236,132호, 5,598,979호, 6,517,015호 및 6,715,705호에 기재된 바와 같은 분쇄 및 탈수 장치를 통과시켜 제조하였다. 사용한 출발 물질의 중량은 3.94 kg이었다.
이 출발 물질을 300 바아 (30 MPa, 4351 psi)의 온도 및 50℉(122℃)의 온도에서 추출 장치 내에서 순수한 CO2 와 조합하였다. 총 197 kg의 CO2를 사용하여 원료에 대한 용매의 비율 50:1을 얻었다. CO2 및 원료의 혼합물은, 혼합물의 압력 및 온도가 변화된 분리 장치를 통과시키고 또 이산화탄소로부터 추출물을 분리하였다.
이 추출물(65 g)은 좋은 향기를 갖는 갈색의 점착성의 점성 물질로서 얻었다. 색은 클로로필에 의해 유발된 것으로 보인다. 정확한 수율을 측정하기 위하여, 튜브와 분리기를 아세톤으로 헹구고, 또 그 아세톤을 증발시켜 부가의 9 g의 추출물을 얻었다. 전체 추출물 양은 74 g이었다. 출발 물질의 중량을 기준으로 하여, 추출물의 수율은 1.88%이었다. 추출물 중의 올레안드린의 함량은 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분광계에 의해 560.1 mg 또는 0.76%의 수율로 산출되었다.
방법 B. 이산화탄소 및 에탄올의 혼합물 사용
분말화된 올레안더 잎은 올레안더 잎을 수집, 세척 및 건조시킨 다음 그 올레안더 잎을 미국특허 5,236,132호, 5,598,979호, 6,517,015호 및 6,715,705호에 기재된 바와 같은 분쇄 및 탈수 장치를 통과시켜 제조하였다. 사용한 출발 물질의 중량은 3.85 kg이었다.
상기 출발 물질을 280 바아 (28 MPa, 4061 psi)의 압력 및 50℉(122℃)의 온도에서 추출 장치에서 변형제로서 순수한 CO2 및 5% 에탄올과 조합하였다. 총 160 kg의 CO2 및 8 kg 에탄올을 사용하여 용매 대 원료 비율 43.6:1을 얻었다. CO2, 에탄올 및 원료의 혼합물을 분리기 장치를 통과시키며, 혼합물의 압력과 온도를 변경하고 이산화탄소로부터 추출물을 분리하였다.
상기 추출물 (207 g)은 에탄올을 제거한 후에 분명히 클로로필을 일부 함유하는 짙은 녹색의 점착성, 점성 덩어리로 얻었다. 출발 물질의 중량을 기준으로 하여, 추출물의 수율은 5.38%이었다. 추출물 중의 올레안드린의 함량은 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분광계를 이용하여 1.89 g, 또는 2.1% 수율로 산출되었다.
실시예 2
분말화된 올레안더 잎의 열수 추출
열수 추출은 올레안더 잎으로부터 올레안드린 및 기타 활성 성분을 추출하기 위해 전형적으로 사용된다. 열수 추출 과정의 예는 미국 특허 번호 5,135,745호 및5,869,060호에서 찾아 볼 수 있다.
열수 추출은 5 g의 분말화된 올레안더 잎을 사용하여 실시하였다. 10 부피의 비등 수(올레안더 출발 물질 중량 기준)를 상기 분말화된 올레안더 잎에 부가하고 또 그 혼합물을 6시간 동안 계속 교반하였다. 이 혼합물을 여과한 다음 잎 잔류물을 수집하고 또 동일 조건하에서 다시 추출하였다. 여액을 모으고 동결건조시켰다. 추출물의 외관은 갈색이었다. 건조된 추출물 중량은 약 1.44 g이었다. 34.21 mg의 추출물을 물에 용해시키고 또 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분광계를 이용하여 올레안드린 함량 분석 처리하였다. 올레안드린의 양은 3.68 mg으로 측정되었다. 추출물의 양을 기준으로 한 올레안드린 수율은 0.26%로 산출되었다. 하기 표는 실시예 1의 2회의 초임계적 이산화탄소 추출 및 열수 추출에 대한 올레안드린 수율을 대조한 것이다.
Figure 712014004054615-pct00005

실시예 3
세포주
인간 췌장암 세포: Panc-1, BxPC3, MiaPaca; 인간 결장암 세포주: CaCO-2, DOD-1, HCT-116, HT29, RKO 및 LST174; 설치류 흑색종 B16 세포; 인간 유방암 세포: SUM149, MCF-7 및 MDA231; 인간 구강암 세포: SCC9 및 CAL-27; 인간 난소암 ES3, TOV1120 및 SKOV 세포 및 인간 비-소형 세포 폐암 A549 및 H1299 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(버지니아 마나사스 소재)으로부터 입수하였고 또 37℃에서 5% CO2 를 함유하는 가습 분위기에서 유지시켰다. 인간 흑색종 BRO 세포는 스텔린 파운데이션(텍사스 휴스톤 소재)으로부터 받은 선물이었다. 상이한 상피세포 기원으로부터 유도된 세포주는 10% 열 불활성화된 소태아 혈청(FBS) 하이클론 라보라토리스 인코포레이티드, 유타 로간 소재), 50 IU/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신, 및 GIBCO(인비트로겐)로부터 얻은 2 mM L-글루타민으로 보충된 조직 배양 배지(인비트로겐 코포레이션, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재) (표 1)에서 통상적으로 배양하였다.
실시예 4
세포 독성의 시험관내 측정.
세포는 1x 104 세포/웰의 밀도로 하기 표에 나타낸 바와 같이 이들의 관련 배지에서 성장시켰다. 24시간의 배양 기간 이후, 세포를 다양한 농도의 올레안드린(1 내지 500 nM)으로 처리하였다. 추가의 72시간 후, 세포 증식 억제를 MTT 검정법(23)에 의해 평가하였다. V-Max 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Inc. 제조, 캘리포니아 서니베일 소재)를 이용하여 파장 570 nm 및 참조 파장 650 nm에서 흡수를 판독하였다. 강심배당체 화합물(들)을 함유하는 올레안더 추출물 또는 기타 식물 추출물의 소정 농도 존재에 기인한 세포 증식의 억제의 상대적 정도는 세포 성장을 허용하는 소정 시간(예컨대 24-72 시간) 후 비-처리 세포 수에 대하여 처리 세포수를 비교함으로써 유도될 수 있다.
Figure 712014004054615-pct00006
주: DMEM = 듈베코의 변성 이글 배지; MEM = 최소 필수 배지; FBS = 소태아 혈청; NEAA = 비필수 아미노산; EGF = 상피세포 성장인자.
실시예 5
강심배당체의 세포 흡수의 측정
Panc-1(α3:α1 이소폼의 최고 비율) 세포 및 BxPC3 세포 (α3:α1의 최저 비율)에서 올레안드린 및 오우아바인의 흡수는 올레안드린의 형광성 유사체인 BODYPI-올레안드린에 의한 처리 후 형광 현미경에 의해 측정하였다. 96-웰 플레이트 중의 세포는 0, 5, 20, 및 50 nM 올레안드린으로 2h 또는 24h 동안 처리하였다. DMEM/F12 배지 중의 0.5% 소 태아 혈청에서 처리를 실시하였다. 세포는 MitoTracker Red CM-H2XRos(1μM), 및 DAPI (1 ng/ml), 선택적 핵 염료 (Molecular Probes)와 함께 동시에 배양하였다. 핵 형태, DNA 및 미토콘드리아 염료 흡수는 올림푸스 IX-70 역전 현미경을 이용하여 형광 현미경에 의해 평가하였다. Quantix 하전된 커플드 디바이스 카메라 및 IP Labs 소프트웨어(Scanalytics, Inc., Fairfax, VA)를 이용하여 영상 습득을 달성하였다. α3 siRNA 에 의해 형질감염된 야생형 및 Panc-1 세포에서 올레안드린 흡수는 라미닌 코팅된 커버슬립 상에서 배양되고 또 BODIBY-올레안드린에 의해 1시간 동안 처리된 세포에서 측정되었다.
실시예 6
α3 및 α1 이소폼 발현으로서 Na, K-ATP의 측정
세포는 용해 완충액(20 mM MOPS, 2 mM EGTA, 5 mM EDTA, 30 mM NaF, 40 mM β-글리세로포스페이트, 20 mM 피루브산 나트륨, 0.5% 트리톤 X-100, 및 1 mM 나트륨 오르토바나데이트와 함께 프로테아제 억제제 칵테일) 존재하에서 냉 PBS로 세척하고 또 긁어내었다. 세포 용해물은 얼음 상에서 3분간 초음파 처리시킨 다음, 1400 g (4℃에서 10분간)에서 원심분리하기 전에 4℃에서 10분간 더 배양하였다. 단백질 수준은 BioRad Dc 단백질 검정법(BioRad, Inc., Hercules, CA)를 통하여 정량하였다. 동일 수준의 단백질(50 mg)을 프리캐스트 겔(BioRad)에 부가한 다음 표준방법에 따라 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 전달하였다. 0.1% 트윈 20에 의해 트리스-완충된 염수에서 제조된 5% 비지방 건조 밀크 블로킹 완충액에서 1 내지 2시간 배양 기간 이후, 막을 블로킹 완충액에서 1:2,000으로 희석된 일차 항체 α3 (Affinity Bioreagents, Golden, CO) 및 α1(Upstate, Lake Placid, NY) 이소폼에 프로빙처리하였다. 단백질 밴드는 ECL+검출 키트 및 하이퍼-필름(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 이용하여 화학발광을 통하여 가시화하였다. 샘플 로딩은 β-액틴의 존재에 대하여 웨스턴 블러팅에 의해 나타났다. 단백질 밴드는 알파 DigiDoc 1000 소프트웨어 (알파 이노테크 코포레이션, 캘리포니아 샌 레안드로 소재)를 이용하여 정량하였다.
실시예 7
흑색종, 기저 세포 암종, 및 편평상피세포 암종의 치료를 비롯한 암과 같은 피부 관련 질병뿐만 아니라 광화학 각화증, 건선, 및 습진을 비롯한 비암 염증 피부 질병의 치료
상술한 바와 같은 악성 또는 비악성 증식성 피부 질병에 걸린 피검체에 SCF 추출물을 투여하였다. SCF 추출물은 크림 또는 연고로 투여되거나 또는 단위 투여량 당 0.01 mg 내지 10 mg의 SCF 추출물을 함유한다. 피검체에는 1 내지 14일 동안 매일 3회까지 단위 투여량으로 투여되거나 또는 피부 질병이 완화될 때까지 투여된다. 이러한 치료는 질병으로 유도하는 염증 및 악성 과정을 현저히 완화시키거나 또는 경감시킬 것으로 기대된다. 피검체는 피부 병반의 심각도의 감소와 결국 피부 질병 자체의 해소를 경험해야 한다. 악성 질병은 질병의 심각도에서 증가율 감소 또는 억제될 것으로 기대된다. 확립된 악성 병반의 실제 퇴행이 예상될 수 있다.
실시예 8
피부암과 같은 피부 관련 질병의 예방
자외선(햇빛) 또는 화학물질에 의한 발암물질에 자주 노출되는 사람과 같이 피부암 형성 기질이 있는 피검체에 SCF 추출물을 투여하였다. SCF 추출물은 단위 투여량 당 0.01 내지 10 mg의 SCF 추출물을 함유하는 피부 패치내에 함유된 크림 또는 연고로서 투여된다. 피검체에는 발암물질 증진이 예상되는 매 노출시(햇빛에 노출) 매일 3회까지 단위 투여량으로 투여된다. 이러한 투여는 예컨대 햇빛 UV 노출을 차단하기 위한 스크린 및 피부 조직에서 종양 예방을 위한 SCF 추출물로서 투여될 수 있다. 피부 제품에서 SCE의 사용은 악성 피부 질병 또는 비악성 피부 장애의 형성 및/또는 증진을 차단할 것으로 기대되며, 상기 증진은 질병 과정(예컨대 광화학 각화증, 건선 및/또는 습진)의 악화를 초래한다.
실시예 9
인간 또는 기타 척추 동물에서 고형 종양의 치료
강심배당체를 함유하는 식물 또는 동물의 SCF 추출물은 직장암, 항문암, 직장결장조직암, 머리암 및 목조직암, 식도조직암, 폐암(비소형 세포 및 소형 세포 암종), 유방암, 위암, 췌장암, 전립선암, 간암, 신장암, 방광암, 요관암, 난소조직암, 카르시노이드 종양, 뼈육종, 중피종, 및 중앙신경계의 신생물을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
SCF 추출물은 상술한 바와 같이 고체 악성 질병에 걸린 피검체에 투여된다. SCF 추출물은 단위 투여량 당 1 내지 50 mg의 SCF 추출물을 함유하는 경구 투여 형태로서 투여된다. 상기 피검체에는 28일/치료 주기 동안 매일 2회까지 단위 투여량으로 투여된다. 3회까지의 치료 주기가 필요할 수 있다. 상기 피검체는 증식 속도를 느리게 하거나 또는 퇴행하는 종양 성장을 경험해야 한다. 종양의 완전한 해결이 생길 수 있다. SCF 추출물에 의한 요법은 단일제로서 사용되거나 또는 세포 독성 화학요법 또는 방사선 처리와 조합되어 사용될 수 있거나 또는 통상의 요법의 소망하는 항종양 효과에 대하여 과도한 간섭을 유발하지 않는 적절한 면역요법과 조합될 수 있다.
실시예 10
2개의 인간 종양 세포주에서 초임계적 CO2 를 이용하여 제조된 SCF 추출물에 대한 네륨 올레안더(Nerium oleander)의 열수 추출물의 세포독성의 대조
양쪽 추출물의 세포독성을 올레안드린의 세포독성과 직접적으로 대조하였다. 상기 샘플은 올레안드린의 농도는 추출물에 존재하는 올레안드린의 농도에 따라 다양할 수 있지만, 동일 양의 올레안드린을 함유한다.
BRO(인간 흑색종) 및 Panc-1(인간 췌장암) 세포 (8 x 103/웰)을 96웰 플레이트에 플레이팅하고 또 철야로 부착하였다. 약물 또는 추출물을 상기 세포에 부가하였다. 72시간의 배양 후, 상대적 세포 증식(대조 미처리 세포에 대하여)은 크리스탈 바이올렛 염색 방법에 의해 평가하였다.
실시예 11
올레안드린을 함유하는 용액의 HPLC 분석
샘플(올레안드린 표준, SCF 추출물 및 열수 추출물)은 다음 조건을 이용하여 HPLC(Waters)상에서 분석하였다: 대칭(Symmetry) C18 칼럼(5.0㎛, 150 x 4.6 mm I.D.; Waters); 이동상 MeOH:물 = 54: 46(v/v) 및 유동속도 1.0 ml/분. 검출 파장은 217 nm로 설정하였다. 상기 샘플은 화합물 또는 추출물을 적절한 표적 농도의 올레안드린을 달성하는 하기 위한 고정된 양의 HPLC 용매에 용해시켜 제조하였다. 실 시예 12
SCF 추출물의 항바이러스 활성의 평가
이 시험은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)에서 HIV-1의 ROJO 균주의 증식을 억제하기 위한 올레안더 추출물 또는 양성 대조군(AZT)의 상대적 능력을 결정하는 것으로 이루어진다. 감염된 세포를 약물 또는 추출물에 48시간 동안 노출시켰다. 이 시험은 인간 PBMC를 치사시킬 수 있는 추출물의 농도에 대한 올레안더 추출물의 IC50 (바이러스 증식의 50% 억제를 내는 추출물의 농도)를 결정하기 위해 이용하였다. 즉, 실제로, 추출물의 치료 지수를 측정한다. 이것은 추출물이 PBMC 세포 자체를 치사시키지 않고 HIV-1를 치사킬 수 있는지 여부를 측정한다.
100 ㎍/ml 만큼 높은 농도에서도 세포를 치사시키는데 필요한 농도는 도달하지 않아야 하는 한편, 약 5.0 ㎍/ml 이하의 바이러스 증식에 대하여 IC50 을 관찰해야 한다. 얻어진 데이터는 올레안더 추출물이 HIV-1 바이러스 증식 또는 PBMC 세포 내에 들어있는 바이러스의 감염성 억제에 유용해야 한다.
실시예 13
α3 siRNA를 사용한 Panc-1 세포의 형질감염
Panc-1 세포를 6 및 48웰 플레이트에 플레이팅하고 철야로 부착하였다. α3 siRNA 분자의 일시적 형질감염은 siPORTTM 아민 형질감염제(Ambion Austin, TX) 및 0.4 μM α3 스플라이싱 RNA(Santa Cruz Biotech)를 사용하여 제조자의 지시에 따라서 실시하였다. 형질감염된지 24시간 후, 세포들을 10 내지 50 nM 올레안드린으로 48시간 동안 처리하였다. 웨스턴 블럿 분석을 위해 6웰 플레이트로부터 단백질을 수집하고 또 세포 생존 평가는 Calcien AM 염색에 의해 실시하였다.
실시예 14
정상 및 결장 생검 조직에서 α3 및 α1 발현의 측정
플래쉬 냉동 정상 결장 점막 및 종양 조직 생검을 얻고 액체 질소 냉각된 몰타르를 이용하여 분말화하였다. 이 샘플을 상기 나타낸 바와 같이 용해 완충액에 노출시켰다. 이 용해물을 얼음 상에서 3분간 초음파 처리시키고, 4℃에서 10분간 배양하고 또 14,000 rpm에서 원심분리(4℃에서 10분)시킨 다음 앞서 기재한 바와 같이 α-서브유닛의 α3 및 α1 이소폼의 웨스턴 블러팅 분석을 실시하였다.
실시예 15
통계학적 분석
다양한 실험 그룹 사이의 통계학적 차이를 결정하기 위하여 스투덴트 시험을 이용하였다: P < 0.05 값은 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 16
α3 항체의 민감성의 측정
상이한 α3 항체의 민감성을 비교하기 위하여, 양성 및 음성 대조 샘플의 동량의 동일 용해물을 3개의 프리캐스트(precast) 겔(BioRad, Inc., Hercules, CA)에 로딩한 다음 표준 방법에 따라서 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 전달하였다. 0.1% 트윈 20 (TBS-T)에 의해 트리스-완충된 염수에서 제조된 5% 건조 밀크 차단 완충액에서 1-2시간 배양한 다음, 차단 완충액에서 1:2000 희석으로 Sigma(St Luoise, MO), Affinity Bioreagents(Golden, CO) 및 Novus(Littleton, CO)으로부터 얻은 α3 항체에 의해 막을 프로브처리하였다. 단백질 밴드는 Chemiglow West 검출 키트 및 Alpha Imager(Alpha InnotechCorp, San Leandro, CA)를 이용한 화학발광을 통하여 가시화하였다. 단백질 밴드를 정량하고 또 Alpha DigiDoc 1000 소프트웨어 (Alpha InnotechCorp, San Leandro, CA)를 이용하여 3개 항체 사이를 비교하였다. 동일 로딩의 샘플은 β-액틴에 대한 웨스턴 블러팅에 의해 나타내었다. 이 데이터는 α3 에 대한 각 선택된 항체의 민감도가 실질적으로 동일함을 나타낸다.
Figure 712014004054615-pct00007
*평균 밀도는 Alpha DigiDoc 1000에 의해 정량된 규정된 영역으로 나눠진 절대 밀도값을 기초로 산출하였다.
실시예 17
예후 검정법를 실시하기 위한 키트
이 키트는 실시예 18에 자세히 기재된 바와 같은 웨스턴 블럿 수법을 이용한 예후 검정법를 실시하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 이용될 수 있다.
1. 용해 조성물
Figure 712014004054615-pct00008
2. 일차 항체: (블로킹 용액 중의 1:2000)
알파 3 (Affinity Bioreagent Cat# Mα3-915)
알파 1 (Upstate Cat# 05-369)
3. 이차 항체: 염소 항-마우스 IgG HRP (Santa Cruz Cat# sc-2005)
4. 겔/막 제제:
7.5-10% 겔 (BioRad Precast)
BioRad Laemmli 샘플 완충액 (Cat# 161-0737)
분자량 마커 (Cat# 161-0318)
러닝 완충액 (BioRad 10X Tris/글리신/SDS) (Cat# 161-0732)
막 (Biorad PVDF)
전달 완충액:
3.03g 트리스 (최종 농도 - 25mM)
14.4g 글리신 (최종 농도 - 0.192mM)
200ml 메탄올 (20%)
1L까지 H2O
5. 블로킹 용액: TBS 중의 5% 우유 (20 mM Tris HCl, 150 mM NaCl)
6. 세척 완충액: TBS-T (20 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)
8. 양성 대조 세포: 인간 췌장암 Panc-1 세포의 세포 용해물
9. 음성 대조용 세포: 마우스 흑색종 B16 세포
10. α-서브유닛의 이소폼의 웨스턴 블러팅 분석에 대한 자세한 순서를 비롯한 브로셔
실시예 18
세포 조직의 샘플 제조
방법 A. 세포 펠릿으로부터
2 내지 4백만 세포를 함유하는 세포 펠릿을 얻었다. 생리학적으로 균형이 이뤄진 용액(PBS)를 사용하여 헹구어서 매질을 제거하였다. 항상 차갑게 (얼음 상) 유지한다. 실시예 18에서 초음파 단계로 계속.
방법 B. 플레이트 상의 세포로부터
100 mm 조직 배양 플레이트 상에서 24시간 동안 1.2 내지 1.5백만 세포로 생장시켰다. 조심스럽게 기우려서 세포 성장 매질을 제거하였다. 플레이트를 1 ml PBS로 2회 헹구었다. 100ul 용해 완충액을 부가하고, 플레이트로부터 세포를 벗겨내고 또 튜브에 수집하였다. 항상 차갑게(얼음 상) 유지시켰다. 실시예 18에서 초음파 단계로 계속.
방법 C. 조직으로부터 냉동 조직을 분쇄하였다. 분쇄된 조직을 튜브에 넣었다. 100ml의 냉각 용해 완충액을 최소 5 mg의 분쇄 조직에 부가하였다. 항상 차갑게(얼음 상) 유지하였다. 실시예 18에서 초음파 단계로 계속.
실시예 19
웨스턴 블럿에 의한 샘플에서 α-서브유닛의 이소폼의 함량 측정
본 발명의 방법을 이용하여 샘플 중의 Na, K-ATPase의 α 서브유닛의 이소폼의 함량을 검출하고 정량하였다. 단계의 순서는 필요에 따라 변형될 수 있다.
웨스턴 블럿 분석
1. 얼음 냉각조에서와 같이 냉각하면서 세포 용해물을 초음파처리하였다.
2. @ 4℃에서 10분 동안 14,000 rpm으로 용해물을 스핀처리하였다.
3. 상층액을 수집하고 항상 냉각되게 유지시킨다.
4. 단백질 검정법에 의해 단백질 수준을 측정하였다. (참조: BioRad® 단백질 검정법 키트 지시)
5. 단백질 검정법 상을 기초로 하여 겔 상에 로딩하기 위한 샘플 제조 (웰 당 50㎍의 단백질).
a. 양성 및 음성 대조 용해물을 샘플과 함께 제조
i. 양성 대조: Panc-1 단백질 용해물
ii. 음성 대조: Panc-2 또는 B16 단백질 용해물
b. 램리(laemmli) 샘플 완충액 (LSB)을 샘플 및 대조군에 부가함 (참조: LSB지시)
c. 샘플 및 대조군을 @ 95℃에서 5분간 가열함.
d. 샘플을 스핀 다운.
6. 겔을 로딩함.
7. 염료가 겔 바닥까지 흘러갈때 까지 200 볼트에서 겔을 러닝.
8. 100 볼트에서 1-2시간 동안 전달
9. 블로킹 완충액 중 @ RT에서 30분간 내지 1시간 동안 막을 블로킹함.
10. 막을 4℃에서 철야 배양함.
11. 막을 세척 완충액으로 세척함.
3회의 신속한 세척, 1-15분간 세척, 2-10분 세척
12. II°항체 중, 실온에서 45분 내지 1시간 동안 막 배양.
13. 세척 완충액으로 막 세척
3회 신속 세척, 1-15분 세척, 2-10분 세척
14. ECL+ (Amersham Cat# RPN2132)에서 5분간 막 배양
15. 막을 필름(Amersham Cat# RPN3114k)에 노출시키고 또 필름 현상기기 상에서 현상시킴
16. Alpha Digi Doc 소프트웨어 (또는 현재의 영상기기)를 이용하여 Alpha Imager에 의해 노출된 필름의 사진을 찍는다.
17. Alpha Digi Doc에서 분석 기기의 Spot Denso 적용을 이용하여, 알파 1 및 알파 3 영상의 상응하는 밴드를 선택한다.
18. 각 밴드에 대한 통합된 밀도 값(IDV)을 얻는다.
19. α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율을 산출.
실시예 20
Na,K-ATPase 특이적 알파 서브유닛에 대한 mRNA를 측정하기 위한 RT-PCR 방법
RNA STAT-60 시약(Tel-Test, Inc., Friendswood, TX)을 사용하여 총 RNA를 추출하고, 이것을 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 분석에 처리하기 이전에 DNase I로 처리하였다. 1 마이크로그램의 RNA는 마우스 포유동물 종양 바이러스 RT(Life Technologies, Inc., Rockville, MD)에 의해 역전사시켰다. α3-371bp 서열은 프라이머 세트 α3-NKA3VSAS-2-F 5'-NNNNNNNNNN-3' (정방향) (서열번호 3) 및 -R 5'-NNNNNNNN-3'(역방향)에 의해 증폭시켰다. 이들 세트 및 부가적인 프라이머 세트를 설계하고 또 Oligo 6.7 Molecular Biology Insights (Cascade, CO)를 사용하여 확인하였다. 프라이머 쌍
Figure 712014004054615-pct00009
(서열번호 1);
Figure 712014004054615-pct00010
(서열번호 2))을 RT-PCR 분석에 사용하여 GAPDH mRNA를 검출하였다.
실시예 21
전이 췌장 가스트린종의 치료를 위한 다른 항암 약물과 강심배당체-함유 추출물의 조합물의 임상적 평가
다음은 전이 췌장 가스트린종에 걸린 환자를 강심배당체-함유 추출물로 처리한 케이스 히스토리이다.
63세 남성은 췌장 질병을 의심하여 2002년 8월 30일 엠.디. 앤더슨 암 센터에 있는 클리닉을 방문하였다. CT 스캔은 췌장의 꼬리에서 덩어리를 나타내었다. 2002년 9월 17일 환자는 강심배당체를 함유하는 실험 약물, 원칙적으로 올레안드린을 자가 투여하기 시작하였다. 2002년 10월 9일 환자는 췌장의 잘 분화된 섬세포 종양으로 진단되었다. 환자에게 아드리아마이신, 스트렙토조신 및 5-FU의 8주기의 화학요법을 추천한 다음 3 주기의 스트렙토조신 및 5-FU를 추천하였다. 2002년 11월 13일, 환자는 올레안드린을 함유하는 약물을 계속 자가 투여하는 한편 추천 요법을 시작하였다. 2003년 7월 23일, 환자는 추천된 화학요법 처방을 결론지었다. 그의 원래 진단에서는 아무런 변화가 확인되지 않았다. 환자는 2003년 7월 23일 이후로는 화학요법을 받지 않았다. 환자는 강심배당체를 함유하는 추출물을 계속 자가 투여한 다음 화학요법 처방을 완료하였다. 환자는 방사능적으로 안정한 질환을 갖는 2007년 2월 16일로 기재되었다. 환자는 올레안드린과 같은 강심배당체를 함유하는 추출물을 계속 자가 투여하며, 무증상이며 카르노프스카이 스케일로 100%로 보고되었다.
실시예 22
샘암종을 치료하기 위하여 강심배당체-함유 추출물의 임상적 평가
35세 남성이 규정식 이후에 복통과 가스팽만(bloating)을 경험하였다. 그는 개인병원을 찾았고 척추 복부 컴퓨터 보조된 토모그래피(CAT) 스캔을 실시하였다. 그 결론은 췌장 머리의 부피 증가, 실질 밀도의 이질성, 및 췌장 머리의 내측부에서 다발성 임파절종대(multiple lymphadenopathies)이었다. 자기공명영상(MRI) 주사는 이들 발견을 확인시켜주었다. 초음파 보조된 얇은 바늘 통기(thin needle aspiration) 생검을 동일 날짜에서 실시하였다. 초음파 조사는 췌장 머리에서 39 x 33 mm의 종양 덩어리를 나타내었다. 생검 시편의 조직병리학적 조사에 의하면 상기 진단은 샘암종으로 밝혀졌다. 화학요법을 추천하였으나, 환자는 거부하였다.
1개월 후, 상기 환자는 매우 소량의 올레안드린을 함유하는 식물성 추출물 요법을 자가 투여하기 시작하였다. 1개월 이내에 찍은 상복부 MRI에 의하면 췌장의 머리에서 35 x 25 mm의 병반을 뚜렷히 보유함을 나타났다. 최대 크기가 5 mm인 수많은 임파절종대는 또한 췌장 머리의 내측부 및 위날문 후방 부위에서 나타났다.
3개월 이후에 얻은 MRI 영상은 췌장에 있는 종양 크기가 30 x 25 mm임을 나타내보였다. 소량의 올레안드린을 함유하는 추출물의 투여량을 이번에 증가시켰다. 3주 후에 뼈 신티그래프(scintigraphy)를 실시하였다. 전이성 질병에 대해서는 그리 현저하지 않았다. 7주 후 얻은 상복부 및 하복부 MRI 영상은 췌장 머리 및 모든 임파절종대에 있는 종양 덩어리의 차도를 나타내었다. 2주후에 얻은 상복부 및 하복부 MRI는 췌장샘암종 및/또는 임파절종대에 대해 그리 현저하지 않았다. 4개월 후에 상복부 및 하복부 MRI를 실시하였다. 췌장샘암종 및 전이성 질병에 대해서는 여전히 현저하지 않았다.
2007년 3월 이후로, 환자는 계속 차도를 나타되고 있다.
실시예 23
암 및 종양 세포의 배양
특정 암 또는 종양 세포의 배양을 최적화하기 위하여 하기 과정은 변형될 수 있다. Panc-1 인간 췌장암 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(Manassas, VA)으로부터 구입하였다. 세포는 10-15% 소태아 혈청 (인비트로겐, Carlsbad, CA), 100 U/ml의 페니실린 (인비트로겐), 및 2.5 ug/ml의 항진균제(푼지존; 인비트로겐)에 의해 보충된 DMEM 배지 중, 5% CO2 중, 37℃에서 배양하였다. 일련의 농도의 각 약물의 연속적인 약물에 72시간 노출한 이후에 올레안드린 및 아드리아마이신에 의한 세포 증식의 상대적 억제를 측정하였다. MTT 검정법을 앞에서 기재(Mosmann, 1983)한 바와 같이 이용하여 미처리 Panc-1 세포 증식에 대한 세포 성장을 평가하였다. 세포 성장을 평가하기 이전에, 세포를 미처리(대조군), 올레안드린 또는 아드리아마이신에 72시간 동안 노출시켰다.
실시예 24
세포 염색
아크리딘 오렌지를 사용하여 세포를 염색하기 위하여 하기 과정을 이용하였다.
세포를 1 ug/ml 아크리딘 오렌지에 의해 37℃에서 15분간 염색하였다. 이 세포를 PBS로 세척하고, 플레이트로부터 트립신처리하며, PBS를 사용하여 PBS에서 수집한 다음 플로우 사이토메트리(flow cytometry)를 통하여 분석하였다.
실시예 25
세포 주기 분석
세포 주기를 측정하기 위하여 하기 과정을 이용하였다.
Panc-1 세포를 올레안드린 (0, 20 및 40 uM)에 의해 72시간 동안 처리한 다음, 트립신처리하고, 4℃ 70% 에탄올로 고정한 다음 세포성 DNA 플로우 사이토메트리 분석 시약 세트(로체)를 사용하여 프로피듐 요오다이드에 의해 염색시킨 다음 FACScan(Becton Dickinson, San Jose, CA)에 의해 DNA 함량을 분석하였다. 데이터는 Cell Quest 소프트웨어 (Becton Dickinson)에 의해 분석하였다. 각 샘플에 대하여 적어도 100,000 세포를 분석하였다.
실시예 26
비소형 세포 폐암 치료를 위하여 강심배당체-함유 추출물의 임상 평가
81세 남성이 좌측 상부 엽의 비소형 세포 폐암으로 진단되었다. 환자에게는 방사능 요법에 이어 화학요법이 추천되었다. 7주 후, 환자는 방사능요법을 개시하였고 또 24일 이내에 치료를 완료하였다. 이어 환자는 6일 이내에 5회의 화학요법 처방을 개시하였고 또 8개월 이후에 완료하였다. 완료되기 27일 이전에, 그 환자는 좌측 상부 엽의 비소형 세포 폐암으로 이전에 진단 받은 것에 대한 재진단받기 위해 내원하였다. 전신 PET 스캔을 실시하였고 또 환자의 공지된 악성과 일치하는 좌측 상부 엽을 포함한 비정상 과대사 활성의 대면적에 대해 확정적이었다. 또한 우측 문 및 앞쪽 격막을 포함한 과대사 활성의 약한 영역은 절(nodal) 관련을 반영하였다. 가슴 CT 스캔은 상부 좌측 엽에서 5-cm 연조직 밀도를 확인시켜 주었다. 뒤이어 화학요법 처방을 개시하였다. 1개월 이내에, 환자의 불용인으로 인하여 화학요법을 중지시켰다. 1주 후, 가슴의 CT 스캔을 대조를 위해 실시하였다. 좌측 상부 엽의 후측 절편에서 약 4 cm 연조직 덩어리가 있었다. 좌측 상부 엽 덩어리의 전체 크기의 간격 감소가 있었다. 5주 이내에, 환자는 올레안드린을 함유하는 식물성 추출물의 자가 투여를 시작하였다. 3개월 후, 이후의 가슴 PA 및 측면부(lateral)를 이전의 스캔과 대조하고 또 좌측 상부 엽에서 종양 덩어리 밀도는 변화가 없었다. 1년 후 가슴 PA 및 측면부를 3개월 이전의 스캔과 비교하며 문 위의 좌측 상부 엽에서 약 4 cm 의 종양 덩어리 밀도는 변하지 않았다.
환자는 올레안드린을 함유하는 식물성 추출물 자가 투여를 계속하였다. 4개월 이내에, IV 콘트라스트를 이용하여 가슴의 CT 스캔을 실시하였다. 상부 좌측 엽의 중앙 덩어리의 크기에서 약 20% 감소가 관찰되었다. 지금까지, 환자는 올레안드린을 함유하는 식물성 추출물 자가 투여를 계속하며 또 높은 카르노프스카이(Karnofsky) 점수를 보고한다. 임상적 데이터는 식물성 추출물이 치료 효능이 있음을 제시하며, 이는 중앙 덩어리의 크기 변화가 환자의 마지막 화학요법 이후 다수의 개월 후에 생기기 때문이다.
실시예 27
면역조직화학적 염색에 의해 샘플에서 α-서브유닛의 이소폼의 함량 측정
이하의 과정은 본 발명의 방법을 이용하여 샘플 중의 Na, K-ATPase의 α 서브유닛의 이소폼의 함량을 검출하고 또 정량하기 위해 이용되는 다른 방식이다. 상기 단계의 순서는 필요에 따라 변형될 수 있다. 이 검정법에서 사용된 물질은 벡터 라보라토리스 (Burlingame, CA 또는 Peterborough, England)로부터 입수할 수 있다.
면역조직화학적 분석
인간 조직의 새로운 냉동 부분을 사용하였다. 이들 부분은 크실렌(각 5분), 감소하는 에탄올 시리즈 (99% x 2, 90% x 2, 각 5분)로 재수화시키고, 또 증류수로 웰을 헹구는 3회 변화에 의해 파라핀분해처리하였다. 열 매개된 항원 회수 방법은 벡터 항원 마스킹해제 용액(Vector-AMS), 고 pH (벡터 라보라토리스 카탈로그 # H-3301)의 비등 용액에서 3 x 5분간 부분을 배양하는 것에 의해 완료하였다.
항원 회수에 이어, 상기 부분은 50 mM Tris HCl, 300 mM NaCl, 0.1%, pH 7.6 (TBS)을 사용하여 2 x 5 분간 세척하였다. 내인성 퍼옥사이드 활성은 상기 부분을 메탄올 중의 0.3% 9 v/v) 과산화수소 중에서 20분간 배양한 다음 TBS로 10분간 세척하는 것에 의해 켄칭하였다.
TBS 4 ug/ml 중 2.5% (v/v) 정상 말 혈청(2.5% NHS)으로 희석된 항- Na, K-ATPase α 서브유닛 이소폼 항체 (Sigma-Aldrich Cat # A273)와 함께 1시간 동안 상기 부분을 배양하였다. 음성 대조용 부분은 비-면역 마우스 IgG1 항체 (Biostat Diagnostics, Cat #093101)와 4 ug/ml 또는 2.5% NHS ("일차 아닌" 대조군)과 함께 배양하였다.
TBS를 사용하여 2 x 5분간 세척한 후, 상기 부분은 Vector ImmPressTM universal 항체 시약 (항-토끼 IgG 및 항-마우스 IgG 시약의 혼합물; 벡터 라보라토리스 리미티드 제조, Cat #MP-7500)과 함께 30분간 배양하였다. 상기 부분을 2 x 5 분간 세척하고 또 디아미노벤지딘 (DAB) 기질과 함께 배양한 다음 적합한 수준의 염색이 생길 때까지 모니터링하였다. 발색 반응은 증류수에 슬라이드를 침지시키는 것에 의해 중지되었다.
색소형성 이후에, 상기 부분은 해마톡실린으로 대조염색시키고, 상승하는 시리즈의 에탄올(90-99-100%)에서 탈수시킨 다음 크실렌 2회 변경으로 세정한 다음 DePeX하에 커버를 덮었다.
결장점막에서 사이토케라틴 면역반응성을 나타내는 검정법 대조는 ImmPressTM 및 색소생성 시약의 포함을 타당화시켰다. "일차 아닌" 대조군은 이차항체 및 기타 검정법 시약의 비특이적 결합 평가를 포함하였다. 염색된 부분을 분석하고 Leica DFC290 카메라를 구비한 Olympus BX51 현미경을 사용하여 적합한 디지탈 영상을 얻었다.
면역조직화학적으로 염색된 세포의 사진은 도 6의 A-F 및 도 7의 A-H에 도시한다. 서브유닛의 이소폼의 정량은 본 명세서에 기재된 바와 같이 달성할 수 있다. 샘플 중의 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율 측정에 이어, 강심배당체에 의한 치료에 대한 치료 반응일 가능성에 대한 측정을 실시하였다.
상술한 내용은 본 발명의 특별한 구체예를 자세하게 설명한 것이다. 본 발명의 특정 구체예를 들어 상세하게 기재하고 있으나, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 가능함은 잘 알고 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 첨부한 특허청구범위를 제외하고는 제한되지 않는다. 기재된 모든 구체예 및 본 명세서에 기재된 특허청구범위는 본 발명의 내용을 참조하여 과도한 실험없이도 용이하게 실시될 수 있다.

Claims (84)

  1. 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애에 걸린 병든 세포 조직으로부터 얻은 것으로 Na,　K-ATPase의 α-서브유닛의 1 이상의 이소폼을 포함하는 샘플에서 Na,　K-ATPase α-서브유닛의 α1 이소폼 함량에 대한 α3 이소폼 함량의 비율을 시험관내에서 측정하고; 또
    상대적 투여량의 강심배당체로 처리될 조직에서 치료반응의 확률을 측정하는 것을 포함하는,
    강심배당체 또는 강심배당체를 포함하는 조성물에 의한 치료에 대한 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애의 체내 치료 반응성을 예측하기에 유용하고,
    강심배당체는 올레안드린, 오우아바인, 부팔린, 디기톡신, 디곡신, 시노부파탈린, 시노부파긴, 및 레시부포게닌으로 구성된 군으로부터 선택되며,
    과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애가 1) 항원-유도된 관절염 및 알레르기성 뇌척수염을 포함하는 자가면역 질환 ; 2) 류마티스성 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 만성 관절염, 골다공증, 및 건선을 포함하는 만성 염증성 증식 질병; 3) 섬유낭병을 포함하는 유방의 증식성 질명; 4) 양성 전립선 비대증(BPH)을 포함하는 전립선의 증식성 질병; 5) 증식성 당뇨망막병증을 포함하는 눈의 증식성 질병; 6) 죽상동맥경화증 및 심장동맥 협착을 포함하는 혈관 증식성 질병; 및 7) 암 및 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는, 시험관내 예후 검정법(prognostic assay).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 비율이 1보다 크거나 또는 적어도 1과 동일하면 세포 조직이 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 치료적으로 반응성일 것으로 예측하는 것을 더 포함하는 검정법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 비율이 0.5 내지 1.0 범위내이면 세포 조직이 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 적어도 부분적으로 치료적으로 반응성일 것으로 예측하는 것을 더 포함하는 검정법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 비율이 0.3 미만이면 세포 조직이 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 치료적으로 비-반응성인 것으로 예측하는 것을 더 포함하는 검정법.
  5. 제 1항에 있어서, 1 내지 100 범위의 α-서브유닛 이소폼 비율을 갖는 병든 조직은 1 미만의 α-서브유닛 이소폼 비율을 갖는 조직에 비하여 더욱 치료적으로 반응성인 것으로 예측하는 것을 더 포함하는 검정법.
  6. 제 1항에 있어서, 검출가능한 α3 이소폼만 갖고 검출가능한 α1 이소폼을 갖지 않는 조직이 강심배당체에 대하여 가장 치료적으로 반응성일 것으로 예측하는 것을 더 포함하는 검정법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 비율이 ≥2이면 세포 조직은 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 적어도 부분적으로 치료적으로 반응성일 것으로 예측하는 것을 더 포함하는 검정법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 비율이 ≥10이면 세포 조직은 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 적어도 부분적으로 치료적으로 반응성일 것으로 예측하는 것을 더 포함하는 검정법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 비율이 ≥25이면 세포 조직은 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 적어도 부분적으로 치료적으로 반응성일 것으로 예측하는 것을 더 포함하는 검정법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 비율이 ≥75이면 세포 조직은 강심배당체를 사용한 치료에 대하여 적어도 부분적으로 치료적으로 반응성일 것으로 예측하는 것을 더 포함하는 검정법.
  11. 제 1항에 있어서, 적어도 부분적인 치료 반응이 있을 확률은 하기 표에 따라 Na, K-ATPase의 α1 이소폼에 대한 α3 이소폼의 비율과 관련된 검정법:
    Figure 712014004054615-pct00011
  12. 제 1항에 있어서, 상기 비율을 측정하는 단계는 시험관내 샘플 또는 생검 샘플에서 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼 및 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼 각각의 발현 수준을 정량하고 또 그의 비율을 산출하는 것을 포함하는 검정법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 비율을 측정하는 단계는 시험관내 샘플에서 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼의 양에 대하여 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 양을 측정하고, 또 그 비율을 산출하는 것을 포함하는 검정법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 비율이 측정되는 데이터를 기초로 통계학적 분석을 실시하는 것을 더 포함하는 검정법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 반응이 완전한 반응인 검정법.
  16. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 세포 조직, 세포 덩어리, 세포 용해물, 이들로부터 제조된 막 제제, 또는 그의 고정된 조직병리학적 슬라이드인 검정법.
  17. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 시험관내 샘플인 검정법.
  18. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 Na, K-ATPase의 α 서브유닛의 적어도 2개의 이소폼을 포함하는 검정법.
  19. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 Na, K-ATPase의 α 서브유닛의 적어도 α1 이소폼 및 α3 이소폼을 포함하는 검정법.
  20. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 조직 또는 생검 샘플을 용해 또는 파쇄하거나; 또는 병든 체내 세포 조직으로부터 조직병리학적 검사를 위한 조직 부분을 고정하여 샘플을 형성하는 것을 더 포함하는 검정법.
  21. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 상에서 웨스턴 블럿 검정, 면역조직화학적 염색 검정 또는 이 둘 모두를 실시하여 샘플 중에서 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼에 대한 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 양과 상대적 발현을 측정하고, 또 그의 비율을 산출하는 것을 포함하는 검정법.
  22. 제 1항 내지 제 14항중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼의 함량에 대한 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 함량을 측정하기 위하여 겔의 방사능 측정 또는 밀도계 측정을 실시하는 것을 포함하는 검정법.
  23. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼의 함량에 대한 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼의 존재 검출 및 함량을 정량하기 위하여 겔의 방사능 측정 또는 밀도계 측정을 실시하는 것을 포함하는 검정법.
  24. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 양성 대조 샘플, 음성 대조 샘플 또는 이 둘 모두에서 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼 및/또는 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼의 함량에 대하여 샘플 중의 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼 함량 및 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼 함량을 대조하는 것을 더 포함하는 검정법.
  25. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, α3 및 α1 서브유닛 중의 오직 1개의 발현이 대조용으로서 생기는 것으로 알려진 조직 샘플에서 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼 함량 및 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼 함량을 대조하는 것을 더 포함하는 검정법.
  26. 제 1항 내지 제 14항중 어느 한 항에 있어서, 병든 세포 조직은 포유동물로부터 얻는 검정법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 병든 세포 조직은 소, 개, 고양이, 말, 돼지 또는 상업적 가치에 상관없이 기타 가축동물로부터 얻는 검정법.
  28. 삭제
  29. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 직장결장암, 머리 및 목암, 부신피질 암, 항문암, 담관암, 방광암, 뼈암, 뼈 전이, 뼈육종, 뇌암, 유방암, 경부암, 비-호지킨 림프종, 직장암, 식도암, 안암, 담낭암, 위장관 카르시노이드 종양, 임신영양모세포병, 호지킨 질병, 카포씨 육종, 신장암, 후두 및 하인두 암, 간암, 폐암, 폐 카르시노이드 종양, 악성 중피종, 전이암, 다발골수종, 골수형성이상증후군, 비강 및 부비동 암, 코인두암, 신경모세포종, 중앙신경계의 신생물, 구강 및 입인두암, 뼈육종, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체암, 전립선암, 망막모세포종, 침샘암, 육종, 피부암, 위암, 고환암, 가슴샘암, 갑상샘암, 요관암; 자궁 육종, 질암, 음문암 또는 빌림스 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 검정법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 폐암, 유방암, 개의 골원성 육종 및 추론적 인간 골원성 육종, 인간 뇌암 및 인간 결장 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 검정법.
  31. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애를 갖는 피검체를 확인하는 것을 더 포함하는 검정법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 피검체로부터 병든 세포 샘플을 얻는 것을 더 포함하는 검정법.
  33. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, Na,K-ATPase의 α-서브유닛의 α1 이소폼 및 α3 이소폼에 대하여 분석을 실시하는 방법을 특정하는 정보를 더 포함하는 검정법.
  34. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 예후 데이터를 해석하는 방법을 자세히 나타내는 정보를 더 포함하는 검정법.
  35. 삭제
  36. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 강심배당체는 식물 또는 동물 공급원의 추출을 통하여 유도되거나, 유용 강심배당체의 화학적 개질을 통하여 합성되거나 제조된 순수한 형태로 존재하는 검정법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 강심배당체가 추출물로 존재하는 검정법.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 강심배당체 추출물은 경우에 따라 변형제의 존재하에서 초임계적 유체(SCF) 추출에 의해 제조되는 검정법.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 SCF 추출물은 강심배당체 이외에 적어도 1개의 다른 약리학적 활성제를 더 포함하는 검정법.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 다른 활성제는 추출물을 피검체에 투여할 때 강심배당체의 치료 효능에 공헌할 수 있는 검정법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 다른 활성제는 강심배당체의 치료 효능에 부가적으로 또는 상승작용적으로 공헌하는 검정법.
  42. 제 36항에 있어서, 상기 강심배당체가 약제학적 제형 또는 조성물로 존재하는 검정법.
  43. 삭제
  44. 제 36항에 있어서, 상기 강심배당체는 올레안더 식물 덩어리로부터 얻은 것인 검정법.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 올레안더 식물 덩어리는 네륨 올레안더(Nerium oleander), 또는 테베티아 네리폴리아(Thevetia nerifolia)를 포함하는 검정법.
  46. 제 37항에 있어서, 상기 추출물은 두꺼비 피부 또는 그로부터 유도된 분비물로부터 얻는 검정법.
  47. a) Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼에 대하여 결합 친화성을 갖는 제1 일차항체;
    b) Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 일차항체;
    c) 과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애의 강심배당체 또는 강심배당체를 포함하는 조성물을 사용한 치료에 대한 생체내 치료 반응성을 예측하기 위한 예후 검정법의 키트 및 실시에 이용하기 위한 지시사항; 및
    d) 상기 예후 검정법의 실시로부터 얻은 예후 데이터를 해석하기 위한 방법에 대한 정보를 포함하며,
    강심배당체는 올레안드린, 오우아바인, 부팔린, 디기톡신, 디곡신, 시노부파탈린, 시노부파긴, 및 레시부포게닌으로 구성된 군으로부터 선택되며,
    과도한 세포 증식과 관련된 병인을 갖는 질병 또는 장애가1) 항원-유도된 관절염 및 알레르기성 뇌척수염을 포함하는 자가면역 질환 ; 2) 류마티스성 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 만성 관절염, 골다공증, 및 건선을 포함하는 만성 염증성 증식 질병; 3) 섬유낭병을 포함하는 유방의 증식성 질명; 4) 양성 전립선 비대증(BPH)을 포함하는 전립선의 증식성 질병; 5) 증식성 당뇨망막병증을 포함하는 눈의 증식성 질병; 6) 죽상동맥경화증 및 심장동맥 협착을 포함하는 혈관 증식성 질병; 7) 암 및 종양으로 구성된으로부터 선택되는,
    예후 검정법를 실시하기 위한 키트.
  48. 제 47항에 있어서, 상기 키트는 웨스턴 블럿 겔 전기영동 검정을 실시하는데 사용하거나 면역조직화학적 염색 검정을 실시하는데 사용하기 위한 키트.
  49. 제 47항 또는 제 48항에 있어서, a) 용해 조성물; b) Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼을 포함하는 양성 대조 샘플; c) Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼 및 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼을 포함하는 양성 대조 샘플; d) Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼 및 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼을 포함하는 음성 대조 샘플; e) 이차항체, 염소 항-마우스 IgG-HRP (예컨대 목적으로 하는 단백질을 가시화하기 위하여 사용될 수 있음); f) 겔 전기영동 분석에 적합한 겔 형성 물질; g) 방사성 라벨링된 마커; h) 밀도계 또는 방사능계; i) 수성 액체 배지; j) 겔/막 제조 키트; k) 블로킹 용액; l) 세척 완충액; m) 웨스턴 블럿 분석 키트를 포함하는 물질 또는 n) 이들의 조합물을 더 포함하는 키트.
  50. 제 47항 또는 제 48항에 있어서, 상기 제1 일차 항체는 Na, K-ATPase의 α3 서브유닛 이소폼에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 키트.
  51. 제 47항 또는 제 48항에 있어서, 상기 제2 일차 항체는 Na, K-ATPase의 α1 서브유닛 이소폼에 대하여 특이적 결합 친화성을 갖는 키트.
  52. 제 49항에 있어서, 상기 이차 항체는 염소 α마우스 IgG 서양고추냉이 퍼옥시다아제이거나 또는 서양고추냉이 퍼옥시다아제의 부착된 마커를 갖는 마우스 IgG에 대하여 생긴 마우스 이외의 종으로부터 얻은 다른 이차 항체를 포함하는 키트.
  53. 제 47항 또는 제 48항에 있어서, 상기 일차 항체는 모노클로날 항체인 키트.
  54. 제 49항에 있어서, 상기 양성 대조 샘플은 조직, 세포 덩어리, 세포 용해물 또는 생검 또는 기타 외과적 절제 수단에 의해 얻을 수 있는 것으로부터 얻은 막 제제로 구성된 군으로부터 선택되는 키트.
  55. 제 49항에 있어서, 상기 음성 대조 샘플은 Na, K-ATPase의 α-서브유닛의 α3 이소폼을 함유하지 않는 조직, 세포 덩어리, 또는 세포 용해물, 또는 이러한 것들로부터 제조된 막 제제로 구성된 군으로부터 선택되는 키트.
  56. 제 55항에 있어서, 상기 음성 대조 샘플은 시험관에서 생장한 설치류(마우스 또는 래트) 종양 조직 또는 마우스 또는 래트 세포의 세포 덩어리를 포함하는 키트.
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