JP2011508184A - 強心配糖体を用いた癌の化学療法における治療応答の確率を求める方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図3A
Description
該アッセイが:
過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患を持つ対象物の疾病にかかったインビボの細胞組織から直接的に又は間接的に得られるサンプル中のNa、K−ATPアーゼのα−サブユニットのα1アイソフォームに対するα3アイソフォームの比を求めること、ここでサンプルはNa、K−ATPアーゼのαサブユニットの一つ又はそれ以上のアイソフォームを含む;及び
対象物が強心配糖体の治療上適切な用量を用いて治療されるとして、対象物における治療応答の確率を求めることを含む。
尚、本明細書における化合物は、本発明の処方において一つ又はそれ以上の機能を有してもよい。例えば、ある化合物が界面活性剤及び水混和性溶媒の両方として、又は界面活性剤及び水不混和性溶媒の両方として作用してもよい。
液体組成物は一つ又はそれ以上の薬学的に又は分析的に許容できる液体キャリアーを含み得る。液体キャリアーは水系、非水系、極性、非極性及び/又は有機キャリアーであり得る。液体キャリアーには、制限するものではないが例として、水混和性溶媒、水不混和性溶媒、水、緩衝液及びそれらの混合物が挙げられる。
粉末化されたセイヨウキョウチクトウの葉の超臨界流体抽出
方法A.二酸化炭素使用
セイヨウキョウチクトウの葉材料を収穫、洗浄及び乾燥し、次いでセイヨウキョウチクトウの葉材料を、米国特許第5,236,132号,第5,598,979号,第6,517,015,及び第6,715,705号に記載されているもののような粉砕脱水装置を通過させることによって、粉末化されたセイヨウキョウチクトウの葉を製造した。使用された出発原料の質量は3.94kgであった。
出発原料を、抽出装置中で、300バール(30MPa、4351psi)の圧力及び50℃(122oF)の温度で純粋なCO2と混ぜ合わせた。全部で197kgのCO2を使用し、原材料に対する溶媒の比を50:1とした。次いで、CO2及び原材料の混合物を分離装置に通過させ、混合物の圧力及び温度を変え、そして抽出物を二酸化炭素から分離した。
抽出物(65g)が、よい芳香を有する茶色の、粘っこい、粘着性の物質として得られた。その色はクロロフィルによってもたらされたようであった。正確な収量を求めるために、チューブ及び分離機をアセトンでゆすぎ出し、そしてアセトンを蒸発させたところ、追加の9gの抽出物を得た。全抽出物量は74gであった。出発原料の質量に基づくと、抽出物の収率は1.88%であった。抽出物中のオレアンドリンの含有量を高圧液体クロマトグラフィー及び質量分析を用いて計算したところ560.1mg、つまり0.76%の収率であった。
セイヨウキョウチクトウの葉材料を収穫、洗浄及び乾燥し、次いでセイヨウキョウチクトウの葉材料を、米国特許第5,236,132号,第5,598,979号,第6,517,015,及び第6,715,705号に記載されているもののような粉砕脱水装置を通過させることによって、粉末化されたセイヨウキョウチクトウの葉を製造した。使用された出発原料の質量は3.85kgであった。
出発原料を、抽出装置中で、280バール(28MPa、4061psi)の圧力及び50℃(122oF)の温度で、純粋なCO2及び改質剤として5%エタノールを混ぜ合わせた。全部で160kgのCO2及び8kgのエタノールを使用し、原材料に対する溶媒の比を43.6:1とした。次いで、CO2、エタノール及び原材料の混合物を分離装置に通過させ、混合物の圧力及び温度を変え、そして抽出物を二酸化炭素から分離した。
エタノールを除去した後、抽出物(207g)が、明らかに幾らかのクロロフィルを含有する、暗緑色の粘っこい、粘着性の塊として得られた。出発原料の質量に基づいて、抽出物の収率は5.38%であった。抽出物中のオレアンドリンの含有量を高圧液体クロマトグラフィー及び質量分析を用いて計算したところ1.89mg、つまり2.1%の収率であった。
粉末化されたセイヨウキョウチクトウの葉の熱水抽出
セイヨウキョウチクトウの葉からオレアンドリン及び他の活性剤を抽出するために熱水抽出が一般的に使用された。熱水抽出プロセスの例は米国特許第5,135,745号及び第5,869,060号において見出され得る。
5gの粉末化されたセイヨウキョウチクトウの葉を用いて熱水抽出を行った。(セイヨウキョウチクトウ出発原料の質量当たり)10倍の容積の沸騰水を粉末化されたセイヨウキョウチクトウの葉に加え、そして混合物を6時間、絶えず撹拌した。次いで、混合物をろ過して葉の残留物を集め、そして再び同じ条件下で抽出した。濾液を合わせて凍結乾燥させた。抽出物の外観は茶色であった。乾燥された抽出物の質量は約1.44gであった。34.21mgの抽出物を水中に溶解させ、高圧液体クロマトグラフィー及び質量分析を用いてオレアンドリン含有量分析にかけた。オレアンドリンの量は3.68mgであった。抽出物の量に基づいて、オレアンドリンの収率を計算したところ0.26%であった。下表は実施例1の二つの超臨界二酸化炭素抽出物及び熱水抽出物に対するオレアンドリン収率の間の比較を示す。
細胞株
ヒトの膵臓癌細胞:Panc-1、BxPC3、MiaPaca;ヒトの結腸癌細胞株:CaCO-2、DOD-1、HCT-116、HT29、RKO及びLST174;齧歯動物のメラノーマB16細胞;ヒトの乳癌細胞:SUM149、MCF-7及びMDA231;ヒトの口腔癌細胞:SCC9及びCAL-27;ヒトの卵巣癌ES3、TOV1120及びSKOV細胞及びヒトの非小細胞癌A549及びH1299細胞は全てThe American Type Culture Collection (Manassas、VA)から得られ、そして37℃で、5%CO2を含む加湿雰囲気中に維持された。ヒトのメラノーマBRO細胞は、The Stehlin Foundation (Houston、TX)からの親切な贈与であった。異なる上皮源に由来する細胞株は、10%の熱で不活性化されたウシ胎仔血清(FBS)、(Hyclone Laboratories社、Logan、UT)、50IU/mlのペニシリン及び50μg/mlのストレプトマイシン、並びにGIBCO(Invitrogen)製の2mのL−グルタミンで補われた組織培養培地(Invitrogen社、Grand Island、NY)(表1)中で規定どおりに培養された。
細胞毒性のインビトロの決定
細胞を、下表に示された通りのその関連する培地中で、1×104細胞/ウエルの密度で成長させた。24時間のインキュベーション期間の後、細胞を種々の濃度(1から500nM)のオレアンドリンを用いて処理した。追加の72時間後、細胞増殖の阻害をMTT分析(23)によって評価した。Molecular Devices社(Sunnyvale、CA)製のV-Max Micro-plate Readerを用いて、570nmの波長、及び650nmの参照波長で吸光度を読んだ。ある濃度のセイヨウキョウチクトウ抽出物、又は強心配糖体化合物を含有する他の植物抽出物が存在する故の、細胞増殖の阻害の相対的程度は、細胞増殖を可能とする設定時間(例えば、24〜72時間)後の、未処理の細胞数に対する処理された細胞数を比較することによって導くことができる。
強心配糖体の細胞摂取の決定
Panc-1(α3:α1アイソフォームの最高比)細胞及びBxPC3細胞(より低いα3:α1比)中のオレアンドリン及びウアバインの摂取を、オレアンドリンの蛍光類似体であるBODYPI−オレアンドリンを用いて処理した後、蛍光顕微鏡法によって求めた。96−ウエルプレート中の細胞を、0、5、20及び50nMのオレアンドリンで2時間又は24時間、処理した。処理はDMEM/F12培地の0.5%のウシ胎仔血清中で実行された。細胞は、MitoTracker Red CM-H2XRos(1μM)、及び選択的核染料(Molecular Probes)であるDAPI(1ng/ml)を用いて同時にインキュベーションされた。核形態、DNA及びミトコンドリア染料摂取をOlympus IX-70倒立顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡法によって評価した。画像の取得は、Quantix電荷結合素子カメラ及びIP Labsソフトウエア(Scanalytics社、Fairfax、VA)を用いて達成された。野生型及びα3siRNAをトランスフェクトされたPanc-1の細胞中のオレアンドリン摂取の変化を、ラミニンで被覆されたカバーガラス上で培養された細胞、及びBODIBY−オレアンドリンで1時間処理された細胞において求めた。
α3及びα1アイソフォーム発現としてのNa、K−ATPアーゼの決定
細胞を冷PBSで洗浄し、そしてリシス緩衝液(20mMのMOPS、2mMのEGTA、5mMのEDTA、30mMのNaF、40mMのβ−グリセロリホスフェート、20mMのピルビン酸ナトリウム、0.5%のTriton X-100及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを有する1mMのオルソバナジン酸ナトリウム)の存在下で、削り落とした。次いで、細胞溶解物を氷の上で3分間、超音波分解させ、そして14,000×g(4℃で10分間)での遠心分離の前に追加の10分間、4℃でインキュベーションさせた。蛋白質レベルをBioRad Dc蛋白質測定(BioRad社、Hercules、CA)を介して定量した。同レベルの蛋白質(50μg)をプレキャストゲル(BioRad社)に適用し、そして次に標準法に従ってポリビニリデンジフルオリド膜上に移した。0.1%のTween20を有するトリス−緩衝食塩水中で調製した5%の脱脂乾燥ミルクブロッキング緩衝剤中における1から2時間のインキュベーション期間に続いて、ブロッキング緩衝液中1:2,000倍に希釈したα3アイソフォーム(Affinity Bioreagents、Golden、CO)及びα1アイソフォーム(Upstate、Lake Placid、NY)に対する一次抗体を用いて膜を調べた。ECL+検出キット及びhyper-film (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用いて、化学発光を介して蛋白質のバンドを可視化した。β−アクチンの存在に対するサンプルの等量負荷がウエスタンブロットによって示された。蛋白質のバンドを、Alpha DigiDoc 1000ソフトウエア(Alpha Innotech社、San Leandro、CA)を用いて定量した。
限定はされないが、メラノーマ、基底細胞癌腫、及び扁平上皮癌、並びに限定はされないが光線性角化症、乾癬及び湿疹を含む非癌性炎症性の皮膚病の治療の防止を含む、癌などの皮膚に関連する疾病の治療
SCF抽出物が、上に引用されたもののような悪性又は非悪性の増殖性皮膚疾患を患っている対象物に投与される。SCF抽出物は、クリーム又は軟膏として投与され、又は単位用量当たり0.01mgから10mgのSCF抽出物を含有する皮膚パッチ内に含有される。対象物に、1から14日の期間、又は皮膚病が寛解期になるまで、毎日3回までの単位用量が投与される。そのような治療が炎症、及び疾病の進行に繋がる悪性プロセスを著しく軽減又は排除するであろうことが期待される。対象物は皮膚病変の重篤性における軽減、及び皮膚病自身の最終的な消散を経験するはずである。悪性の疾病が成長速度において軽減される、又は疾病の重篤性の増大が阻害されることが期待されるはずである。確立された悪性病変の実際の退行が期待され得る。
皮膚癌などの皮膚に関連する疾病の防止
SCF抽出物が、(太陽光からの)紫外線又は薬品からの発癌物質に頻繁に曝される対象物等の皮膚癌の形成への素因に悩まされている対象物に投与される。SCF抽出物は、クリーム又は軟膏として投与され、又は単位用量当たり0.01mgから10mgのSCF抽出物を含有する皮膚パッチ内に含有される。発癌性物質の促進イベントへの暴露が予想される時(日光への暴露)はいつでも毎日3回までの単位用量が対象物に投与される。そのような投与は、例えば、太陽光UV暴露をブロックするための日焼け止め、及び、皮膚組織における腫瘍誘起を防止するためのSCF抽出物としてなされ得る。皮膚製品におけるSCFのそのような使用が、増殖が疾病過程(例えば、光線性角化症、乾癬及び/又は湿疹)の悪化につながる悪性皮膚病又は非悪性皮膚疾患の形成及び/又は促進をブロックするであろうことが期待されるであろう。
ヒト又は他の脊椎動物における固形腫瘍の治療
強心配糖体を含有する植物又は動物のSCF抽出物は、直腸、肛門、結腸直腸組織、頭頚部組織、食道組織、肺(非小細胞癌及び小細胞癌の両方)、乳房、胃、膵臓、前立腺、肝臓、腎臓、膀胱、尿管、卵巣組織、カルチノイド腫瘍、骨肉腫、中皮腫、及び中枢神経系の新生物の癌の治療のために使用され得る。
SCF抽出物が、上述のもののような固形の悪性疾病を患っている対象物に投与される。単位用量当たり1から50mgのSCF抽出物を含有する経口剤形としてSCF抽出物が投与される。対象物は、28日/サイクルの治療期間に対して、毎日2回までの単位用量が投与される。3サイクルまでの治療が要求され得る。対象物は腫瘍の成長が増殖速度において低下するか又は退行するかを経験するはずである。腫瘍の完全消散も起こり得る。SCF抽出物を用いた治療は、単独剤として又は細胞毒化学療法若しくは放射線治療と組み合わされて使用され得て、又は不当な干渉を引き起こすことなく、従来の治療の所望の抗腫瘍効果を有する適切な免疫治療と組み合わせられ得る。
二つのヒト腫瘍細胞株における、超臨界CO2を用いて作成されたSCF抽出 物に対する、Nerium oleanderの熱水抽出物の細胞毒性の比較
両方の抽出物の細胞毒性のポテンシャルをオレアンドリンのそれと直接比較した。オレアンドリンのそれらの濃度が、抽出物中に存在するオレアンドリンの濃度故に異なるものの、サンプルは同量のオレアンドリンを含有していた。
BRO(ヒトメラノーマ)及びPanc−1(ヒト膵臓癌)細胞(8×103ウエル)を96ウエルプレート中に置き、そして一晩、付着させた。次いで、薬品又は抽出物を細胞に加えた。72時間のインキュベーションの後、相対的細胞増殖(コントロールの未処理細胞に対して)をクリスタルバイオレット染色法によって評価した。
オレアンドリンを含有する溶液のHPLC分析
サンプル(オレアンドリン標準、SCF抽出物及び熱水抽出物)を以下の条件を用いてHPLC(Waters社)上で分析した:対称性C18カラム(5.0μm、150×4.6mm内径;Waters社);MeOH:水=54:46(v/v)及び流速が1.0ml/minの移動相。検出波長は217nmに設定された。サンプルは、化合物又は抽出物を固定された量のHPLC溶媒中に溶解させることによって製造され、ほぼ目標のオレアンドリン濃度を達成した。
SCF抽出物の抗ウイルス活性の評価
試験は、ヒト末梢血単核細胞(PBMCs)におけるHIV−1のROJO株の増殖を阻害するセイヨウキョウチクトウ抽出物又はポジティブコントロール(AZT)の相対的能力の決定から成る。感染細胞が薬剤又は抽出物に48時間、曝された。試験は、ヒトPBMCを殺し得る抽出物のその濃度に対して、セイヨウキョウチクトウ抽出物のIC50(ウイルス増殖の50%の阻害を生み出す抽出物のその濃度)を求めるために使用された。これは、実際に、抽出物の処理指数の決定である。これは本質的に、抽出物がPBMC細胞そのものを殺すことなく、HIV−1を殺し得るか否かの決定である。
100ug/mlという高い濃度でも、細胞を殺すために要求される濃度が到達されていない一方、約5.0ug/ml以下のウイルス増殖に対するIC50を観察するにちがいない。得られたこれらのデータは、HIV−1ウイルス増殖の阻害、又はPBMC細胞内に宿されたウイルスの感染性の点で、セイヨウキョウチクトウ抽出物が有用であるにちがいないことを示唆した。
Panc−1細胞のα3siRNAとのトランスフェクション
Panc−1細胞を6及び48ウエルプレート中に置き、そして一晩、付着させた。α3siRNA分子の過渡的トランスフェクションを、siPORT(商標)Amine Transfection Agent(Ambion Austin社、TX)及び 0.4μMのα3サイレンシングRNA(Santa Cruz Biotech.社)を用いてメーカーの指示書に従って実施した。トランスフェクションの24時間後、細胞を10から50nMのオレアンドリンを用いて48時間処理した。ウェスタンブロット解析のために蛋白質を6ウエルプレートから集め、そして細胞生存率の評価をCalcien AM染色によって実施した。
正常及び結腸生検組織におけるα3及びα1発現の決定
急速冷凍された正常な結腸粘膜及び腫瘍組織生検を得て、液体窒素で冷却した乳鉢を用いて粉砕した。サンプルを前記の通り、リシス緩衝液に曝した。次いで、溶解物を氷上で3分間、超音波分解し、4℃で10分間、インキュベーションさせ、そして14,000rpmで遠心分離し(4℃で10分間)、続いて前記の通り、α−サブユニットのα3及びα1アイソフォームのウエスタンブロック分析を行った。
統計解析
種々の実験グループの間の統計的違いを求めるために、スチューデントt検定を用いた;P<0.05の値が有意差有りと考えられた。
α3抗体の感度の決定
異なるα3抗体の感度を比較するために、ポジティブ及びネガティブのコントロールサンプルの等量の同じ溶解物を3つのプレキャストゲル(BioRad社、Hercules、CA)上に載せ、次いで標準法に従って、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した。0.1%のTween20を有するトリス−緩衝食塩水(TBS−T)中で製造した5%の脱脂乾燥ミルクブロッキング緩衝剤における1〜2時間のインキュベーションに続いて、各々ブロッキング緩衝液中1:2,000倍に希釈した、Sigma(St Luoise、MO)、Affinity Bioreagents(Golden社、CO)及びNovus(Littleton、CO)からのα3抗体で膜を探索した。蛋白質のバンドをChemiglow West検出キット及びAlpha Imager(Alpha Innotech社、San Leandro、CA)を用いて、化学発光を介して可視化した。蛋白質のバンドを、Alpha DigiDoc 1000ソフトウエア(Alpha Innotech社、San Leandro、CA)を用いて定量し、そして3つの抗体の間で比較した。β−アクチンに対するサンプルの等量負荷がウエスタンブロットによって示された。これらのデータは、選択された抗体の各々の一つの、α3に対する感度が実質的に等しいことを示す。
予後アッセイを実施するためのキット
このキットは、本発明の方法に従って、実施例18において詳述されているように、ウエスタンブロット技法を用いて予後アッセイを実施するために、使用され得る。
1.溶解組成物
α3(Affinity Bioreagents Cat# MA3-915)
α1(Upstate Cat# 05-369)
3.二次抗体:ヤギ抗マウス IgG HRP(Santa Cruz Cat# sc-2005)
4.ゲル/膜製造:
7.5〜10%のゲル(BioRad Precast)
BioRad Laemmliサンプル緩衝液(Cat# 161-0737)
分子量マーカー(Cat# 161-0318)
泳動緩衝液(BioRad 10X トリス/グリシン/SDS)(Cat# 161-0 732)
膜(Biorad PVDF)
トランスファー緩衝液:
3.03gのトリス(最終濃度−25mM)
14.4gのグリシン(最終濃度−0.192mM)
200mlのメタノール(20%)
1LまでのH2O
5.ブロッキング溶液:TBS(20mM トリス HCl、150mM NaCl)中、5%のミルク
6.洗浄緩衝液:TBS−T(20mM トリス HCl、150mM NaCl、0.05% Tween−20)
8.ポジティブコントロール細胞:ヒト膵臓癌、Panc-1細胞の細胞溶解物
9.ネガティブコントロール細胞:マウスメラノーマB16細胞
10.α−サブユニットのアイソフォームのウエスタンブロット法のための詳細なプロトコールを含むパンフレット
細胞組織のサンプルの製造
方法A.細胞ペレットから
200万から400万の細胞を含有する細胞ペレットを得る。培地を除くために生理的平衡溶液(PBS)を用いてすすぐ。100ulのリシス緩衝液を添加する。常に冷たく保つ(氷上)。実施例18における超音波分解工程を続ける。
方法B.プレート上の細胞から
100mmの組織培養プレート上で120万から150万の細胞を24時間かけて成長させる。細胞増殖培地を注意深くデカントして廃棄する。1mlのPBSを用いてプレートを2回すすぐ。100ulのリシス緩衝液を添加し、細胞をプレートからこすり落とし、そしてチューブ中に集める。常に冷たく保つ(氷上)。実施例18における超音波分解工程を続ける。
方法C.組織から
冷凍された組織を粉砕する。粉砕された組織をチューブ中に置く。最低5mgの粉砕された組織に100μlの冷たいリシス緩衝液を添加する。常に冷たく保つ(氷上)。実施例18における超音波分解工程を続ける。
ウエスタンブロットによるサンプル中のα−サブユニットのアイソフォーム含有量の決定
下記の手順は、そこにおいてサンプル中のNa、K−ATPアーゼのαサブユニットのアイソフォーム含有量を検出して定量するために本発明の方法が採用され得る単なる一つの方法である。工程の順序は必要に応じて修正され得る。
ウェスタンブロット解析
1.氷で冷した浴を用いるなど、冷却しながら細胞溶解物を超音波分解する。
2.溶解物を4℃にて10分間、14,000rpmで回転させる。
3.上澄み液を集めて−常に氷上に保つ。
4.蛋白質分析によって蛋白質レベルを求める(BioRad(登録商標)Protein Assay Kit指示書を参照)。
5.蛋白質分析に基づいて、ゲル上に載せるためのサンプルを製造する(ウエル当たり50μgの蛋白質)。
a.ポジティブ及びネガティブのコントロール溶解物並びにサンプルを製造する。
i.ポジティブコントロール:Panc−1蛋白質溶解物
ii.ネガティブコントロール:Panc−2又はB16蛋白質溶解物
b.ラエムリ(Laemmli)サンプル緩衝液(LSB社)をサンプル及びコントロールに添加する(LSB社指示書を参照)。
c.サンプル及びコントロールを95℃で5分間、加熱する。
d.サンプルを回転して落とす。
6.ゲルを搭載する。
7.染料がゲルの底から流出するまで、ゲルを200ボルトで流す。
8.100ボルトで1〜2時間、移す。
9.ブロッキング緩衝液中で、室温にて30分から1時間、膜をブロックする。
10.4℃で一晩、膜をインキュベーションする。
11.洗浄緩衝液を用いて膜を洗浄する。
3回の迅速洗浄、1〜15分の洗浄、2〜10分の洗浄
12.IIo抗体中で、室温にて45分から1時間、膜をインキュベーションする。
13.洗浄緩衝液を用いて膜を洗浄する。
3回の迅速洗浄、1〜15分の洗浄、2〜10分の洗浄
14.ECL+(Amersham Cat# RPN2132)中で5分間、膜をインキュベーションする。
15.フィルム(Amersham Cat# RPN3114k)に膜を曝し、そしてフィルム展開機上に展開する。
16.曝された膜の写真を、Alpha Digi Docソフトウエア(又は、貴方の現在の画像撮影機)を用いて、Alpha Imagerで撮る。
17.Alpha Digi Docにおける解析ツールのSpot Densoアプリケーションを用いて、α1及びα3画像の対応するバンドを選択する。
18.各バンドに対する積分密度値Ietegrated Density Value(IDV)を得る。
19.α1アイソフォームに対するα3アイソフォームの比を計算する。
Na、K−ATPアーゼ特異的αサブユニットに対するmRNAを求めるためのRT−PCR法
RNASTAT-60試薬(Tel-Test社、Friendswood、TX)が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)分析における使用前にDNアーゼIで処理された全RNAを抽出するために使用された。1μgのRNAが、マウス乳癌ウイルスRT(Life Technologies社、Rockville、MD)を用いて逆転写された。α3−371bp配列が、プライマーのセット、α3−NKA3VSAS−2−F 5’−NNNNNNNNNN−3’(正順)及び−R5’−NNNNNNNN−3’(逆順)によって増幅された。これらのセット及び追加プライマーのセットが、Oligo 6.7 Molecular Biology Insights(Cascade、CO)を用いて設計されそして検証された。GAPDHmRNAを検出するためにRT−PCR分析において、プライマー対(5’−CAGCTCTGGAGAACTGCTG−3’;5’−GTGTACTCAGTCTCCACAGA−3’)が使用された。
転移性膵臓ガストリノーマの治療に対する、強心配糖体含有抽出物と他の抗癌剤の組み合わせの臨床評価
以下は、転移性膵臓ガストリノーマを患っている患者が強心配糖体含有抽出物を用いて治療された事例履歴である。
63歳の男性が、膵臓病の疑いでM. D. Anderson癌センターに2002年8月30日を訪れた。CTスキャンの結果、膵臓の尾上に腫瘤が見つかった。2002年9月17日に、患者は、強心配糖体、主としてオレアンドリン、を含有する実験薬の自己投与を始めた。2002年10月9日に、患者は膵臓の高分化型膵島細胞腫瘍を有すると診断された。患者は、アドリアマイシン、ストレプトゾシン及び5−FUの8サイクルの化学療法、続いてストレプトゾシン及び5−FUの3サイクルの化学療法を推奨された。2002年11月13日に、患者は推奨された治療を始め、一方でオレアンドリンを含む薬の自己投与を継続した。2003年7月23日に、患者は化学療法の推奨されたレジメンを完結した。彼の元の診断において、何の変化も認められなかった。患者は2003年7月23日以降、何の化学療法も受けなかった。患者は、化学療法レジメンの完結に続いて、強心配糖体を含有する抽出物の自己投与を続けた。遅くとも2007年2月16日に、患者は放射線的に安定な疾病を有するとして記載された。患者は、オレアンドリンなどの強心配糖体含有抽出物の自己投入を続け、そして無症候性であり、かつカルノフスキー尺度で100
%であると報告された。
腺癌の治療に対する、強心配糖体含有抽出物の臨床評価
35歳の男性が、通常の食事を取った後に、腹部において痛み及び膨満を経験した。彼は民間の診療所を訪れ、そして螺旋腹部コンピュータ支援断層撮影(CAT)スキャンが実施された。結論の中に膵臓頭部の容積増大、柔組織密度の異質性、及び膵臓頭部の前部位での多数のリンパ節腫があった。磁気共鳴映像法(MRI)検査でこれらの発見が確認された。同じ日に、超音波支援細針吸引生検が実施された。超音波検査の結果、膵臓頭部に39×33mmの腫瘍塊が分かった。生検用標本の組織病理学的検査で腺癌としての診断が分かった。化学療法コースが推奨されたが、患者が拒否した。
一月後、患者は自己投与による、非常に少量のオレアンドリンを含有する植物抽出物治療を始めた。一月以内に得られた上部腹部のMR画像は膵臓頭部上に35×25mmのコントラストを保持した病巣を示した。その中で最大のものが5mmであった多くのリンパ節症も、膵臓頭部の前部位及び胃洞の後部位に見つかった。
三月後に得られたMRI画像は、膵臓頭部における30×25mmのサイズの腫瘍を示した。少量のオレアンドリンを含有する抽出物の用量がこの時点で増やされた。三週間後に、骨シンチグラフィーが実施された。それは転移性疾病に対しては目立たなかった。七週間後に得られた上部及び下部腹部のMR画像は膵臓頭部上の腫瘍塊を示し、そして全てのリンパ節腫が寛解の兆しを示した。二か月後に得られた上部及び下部腹部のMRIでは、膵臓腺癌及び/又はリンパ節腫に対しては目立たなかった。引き続いて、四か月後に上部及び下部腹部のMRIが実施された。膵臓腺癌及び転移性の疾病に対して目立たない状態が続いた。
2007年3月現在、患者は寛解状態を継続中である。
癌及び腫瘍細胞の培養
以下の手順は、特定の癌又は腫瘍細胞の培養を最適化するために、必要に応じて修正され得る。Panc−1ヒト膵臓癌細胞はAmerican Type Culture Collection(Manassas、VA)から購入された。細胞は、10〜15%のウシ胎仔血清(Invitrogen、Carlsbad、CA)、100U/mlのペニシリン(Invitrogen)及び2.5ug/mlの抗真菌薬(Fungizone;Invitrogen)で補充されたDMEM培地中、5%のCO2において、37℃で培養された。オレアンドリン及びアドリアマイシンによる細胞増殖の相対的阻害を、一連の濃度の各薬品の72時間の連続薬品暴露の後で求めた。未処理のPanc−1細胞増殖に対する細胞増殖を評価するために、以前に述べられた通り(Mosmann、1983)、MTT分析が使用された。細胞増殖の評価の前72の間、細胞を無処理(コントロール)、オレアンドリン又はアドリアマイシンに暴露した。
細胞染色
アクリジンオレンジを用いて細胞を染色するために、以下の手順が使用された。
1ug/mlのアクリジンオレンジを用いて、37℃で15分間、細胞を染色した。細胞を、PBSを用いて洗浄し、プレートからトリプシン処理し、FBSを用いてPBS中に集め、そしてフローサイトメトリーを介して分析した。
細胞サイクル分析
細胞サイクルを求めるために、以下の手順が使用された。
Panc−1細胞を、オレアンドリン(0、20及び40uM)を用いて72時間処理し、トリプシン処理し、4℃の70%エタノールを用いて固定し、細胞DNAフローサイトメトリー分析試薬セット(Roche社)を用いて沃化プロピジウムで染色し、次いでFACScan(Becton Dickinson社、San Jose、CA)によってDNA含有量を分析した。Cell Questソフトウエア(Becton Dickinson社)によってデータを分析した。各サンプルに対して、少なくとも100,000個の細胞が分析された。
非小細胞癌の治療に対する、強心配糖体含有抽出物の臨床評価
81歳の男性が左上方葉の非小細胞肺癌を有すると診断された。患者は放射線治療、続いて化学療法のコースを推奨された。七週間後、患者は放射線治療を始め、そして24日で治療を完了した。次いで患者は6日以内に5つの化学療法のレイメンを始め、そして8カ月後にそれらを完了した。完了前の二十七日前に、彼は左上部葉の非小細胞肺癌の以前の診断の再現のために病院を訪れた。全身PETスキャンが実施され、そして患者の既知の悪性腫瘍と一致する左上部葉を含む大きな面積の異常な代謝亢進作用と結論付けられた。追加的に、右門及び前縦隔を含む代謝亢進作用の微妙な領域が結節関与を同様に反映した。胸のCTスキャンによって5cmの軟質組織密度が左上部葉に確認された。引き続いて化学療法のレジメンが開始された。一か月以内に、患者が耐えられないため、化学療法が中断された。一週間後、比較のために胸のCTスキャンが実施された。約4cmの軟質組織の腫瘤が左上部葉の後部セグメントにあった。左上部葉の腫瘤の全体的バルクにおいて間隔の減少があった。五週間以内に、患者はオレアンドリンを含有する植物抽出物の自己投与を始めた。三ヶ月後、フォローアップの胸部レントゲン撮影が以前のスキャンと比較されたところ、左上部葉の腫瘍瘤密度は変化していなかった。一年後、胸部レントゲン撮影が、三か月前のスキャンで発見されたものと比較され、そしてその上の左上部葉における約4cmのサイズの腫瘍瘤密度に変化がないことが判明した。
患者はオレアンドリンを含有する植物抽出物の自己投与を続けた。四か月以内に、IVコントラストを用いる胸のCTスキャンが実施された。左上部葉の中央腫瘤のサイズにおいて約20%の減少が観察された。現時点で、患者はオレアンドリンを含有する植物抽出物の自己投与を続けており、そして高いカルノフスキー尺度が報告された。臨床データは、患者の最後の化学療法の後の多くの月に中央腫瘤ノサイズ変化が起きたため、植物抽出物が治療上の便益を有することを示唆している。
免疫組織化学的染色によるサンプル中のα−サブユニットのアイソフォーム含有量の決定
下記の手順は、そこにおいてサンプル中のNa、K−ATPアーゼのαサブユニットのアイソフォーム含有量を検出して定量するために本発明の方法が採用され得る単なる一つの方法である。工程の順序は必要に応じて修正され得る。この分析において使用された材料は、Vector Laboratories(Burlingame、CA又はPeterborough、England)から得ることができる。
ヒト組織の新鮮凍結された切片が使用された。切片はキシレンを3回換えて(各々5分)用いて脱パラフィン処理され、濃度を順に下げたエタノール中(99%で2回、90%で2回、各5分間)で再水和され、そして蒸留水中でよくすすがれた。熱媒介された抗原検索方法がVector抗原アンマスキング溶液(Vector-AMS社)の沸騰溶液中、高pH(Vector Laboratories社、Catalog # H-3301)で3×5分間、切片のインキュベーションによって完了された。
Claims (84)
- 強心配糖体又は強心配糖体を含む組成物を用いる治療に対する、過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患のインビボの治療応答性を予測するために有用なインビトロの予後アッセイであって、
該アッセイが:
過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患を持つ対象物の疾病にかかったインビボの細胞組織から直接的に又は間接的に得られるサンプル中のNa、K−ATPアーゼのα−サブユニットのα1アイソフォームに対するα3アイソフォームの比を求めること、ここでサンプルはNa、K−ATPアーゼのαサブユニットの一つ又はそれ以上のアイソフォームを含む;及び
対象物が強心配糖体の治療上適切な用量を用いて治療されるとして、対象物における治療応答の確率を求めること;
を含むインビトロの予後アッセイ。 - もし、その比が少なくとも1以上であれば、細胞組織が強心配糖体を用いた治療に対して治療的に応答性であろうと予測することを更に含む請求項1に記載のアッセイ。
- もし、その比が0.5から1.0の範囲内であれば、細胞組織が強心配糖体を用いた治療に対して少なくとも部分的に治療的に応答性であろうと予測することを更に含む請求項1に記載のアッセイ。
- もし、その比が0.3未満であれば、細胞組織が強心配糖体を用いた治療に対して実質的に治療的に非応答性であろうと予測することを更に含む請求項1に記載のアッセイ。
- 1から100の範囲内のα−サブユニットアイソフォーム比を有する疾病にかかった組織が、1未満のα−サブユニットアイソフォーム比を有するものよりも治療的により応答性であろうと予測することを更に含む請求項1に記載のアッセイ。
- 検出できるα3アイソフォームのみを有し、そして検出できるα1アイソフォームを有しないそれらの組織が、強心配糖体に最も治療的に応答性であろうと予測することを更に含む請求項1に記載のアッセイ。
- もし、その比が2以上であれば、細胞組織が、強心配糖体を用いた治療に対して少なくとも部分的に治療的に応答性であろうと予測することを更に含む請求項1に記載のアッセイ。
- もし、その比が10以上であれば、細胞組織が、強心配糖体を用いた治療に対して治療的に少なくとも部分的に応答性であろうと予測することを更に含む請求項1に記載のアッセイ。
- もし、その比が25以上であれば、細胞組織が、強心配糖体を用いた治療に対して治療的に少なくとも部分的に応答性であろうと予測することを更に含む請求項1に記載のアッセイ。
- もし、その比が75以上であれば、細胞組織が、強心配糖体を用いた治療に対して治療的に少なくとも部分的に応答性であろうと予測することを更に含む請求項1に記載のアッセイ。
- 比を求める工程が、インビトロのサンプル又は生検標本中のNa、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォーム及びNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォーム各々の発現レベルを定量すること、並びにその比を計算することを含む、請求項1に記載のアッセイ。
- 比を求める工程が、インビトロのサンプル中のNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームの量に対する、Na、K−ATPアーゼの各α3サブユニットアイソフォームの量を求めること、並びにその比を計算することを含む、請求項1に記載のアッセイ。
- それから比が求められるデータについて統計解析を実行することを更に含む請求項1に記載のアッセイ。
- 治療応答が完全な治療応答である、請求項1〜14の何れか1項に記載のアッセイ。
- サンプルが細胞組織、細胞の塊、細胞溶解物、これらから調製された膜標本、又はそれらの固定された組織病理学スライドである、請求項1〜14の何れか1項に記載のアッセイ。
- サンプルがインビトロのサンプルである、請求項1〜14の何れか1項に記載のアッセイ。
- サンプルが、少なくともNa、K−ATPアーゼのαサブユニットの二つのアイソフォームを含む、請求項1〜14の何れか1項に記載のアッセイ。
- サンプルが、少なくともNa、K−ATPアーゼのαサブユニットのα1及びα3アイソフォームを含む、請求項1〜14の何れか1項に記載のアッセイ。
- 細胞、組織又は生検標本を溶解又は破壊すること;又はサンプルを形成するために、疾病にかかったインビボの細胞組織から組織病理学的検査のために組織切片を固定すること;を更に含む、請求項1〜14の何れか1項に記載のアッセイ。
- サンプル中のNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームに対する、Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームの量及び相対的発現を求めるために、サンプルについてウエスタンブロット法及び/又は免疫組織化学染色法を実施すること;及びその比を計算すること;を含む、請求項1〜14の何れか1項に記載のアッセイ。
- サンプル中のNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームの含量に対する、Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームの含量を求めるために、ゲルの放射分析又は濃度分析を行うことを含む、請求項1〜14及び21の何れか1項に記載のアッセイ。
- サンプル中のNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームの及び、Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームの存在を検出しそして含量を定量するために、ゲルの放射分析又は濃度分析を行うことを含む、請求項1〜14及び21の何れか1項に記載のアッセイ。
- ポジティブコントロールサンプル及び/又はネガティブコントロールサンプル中の、Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームの及び/又はNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームの含有量に対する、サンプル中のNa、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームの及びNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームの含有量を比較することを更に含む、請求項1〜14及び21の何れか1項に記載のアッセイ。
- コントロールとして、α3サブユニット及びα1サブユニットのただ一つの発現が生じることが知られている組織サンプル中の、Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームの及びNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームの含有量を比較することを更に含む、請求項1〜14及び21の何れか1項に記載のアッセイ。
- 疾病にかかった細胞組織が、哺乳動物のような対象物から得られる、請求項1〜14の何れか1項に記載のアッセイ。
- 疾病にかかった細胞組織が、商業的価値の有無に拘わらず、ヒト、牛、犬、猫、馬、豚又は他の家畜から得られる、請求項26記載のアッセイ。
- 過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患が、癌若しくは腫瘍、又はヒト若しくは動物の生活の質に悪影響を及ぼす他の増殖性疾患である、請求項1〜14、21又は26の何れか1項に記載のアッセイ。
- 癌又は腫瘍が、結腸直腸癌、頭頚部癌、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、骨肉腫、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、非ホジキンリンパ腫、直腸癌、食道癌、目の癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌及び下咽頭癌、肝癌、肺癌(非小細胞癌及び小細胞癌の両方)、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、転移性癌、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔癌及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、中枢神経系の新生物、口腔癌及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺腫瘍、尿管癌;子宮肉腫、膣癌、外陰癌又はウィルムス腫瘍から成るグループから選ばれる、請求項28に記載のアッセイ。
- 癌が、前立腺癌、肺癌、 乳癌、膀胱癌、イヌ骨肉腫(及び推測によってヒト骨肉腫)、ヒト脳腫瘍 (多形神経膠芽腫)及びヒト結腸癌から成るグループから選ばれる、請求項28項に記載のアッセイ。
- 過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患を持つ対象物を同定すること:を更に含む、請求項1〜14、21、26又は28の何れか1項に記載のアッセイ。
- 対象物から疾病にかかった細胞のサンプルを得ること:を更に含む、請求項31記載のアッセイ。
- Na、K−ATPアーゼのα−サブユニットのα1アイソフォーム及びα3アイソフォームに対する分析を如何に実行するかを特定する情報を更に含む、請求項1〜14、21、26、28、31又は32の何れか1項に記載のアッセイ。
- 予後データを如何に解釈するかを詳細に示す情報を更に含む、請求項1〜14、21、26、28、31、32又は33の何れか1項に記載のアッセイ。
- 過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患が、1)抗原誘発性の関節炎及びアレルギー性脳脊髄炎などの自己免疫疾患; 2)関節リュウマチ、全身発症型若年性慢性関節炎、骨粗鬆症及び乾癬などの慢性炎症性増殖性疾患; 3)線維嚢胞性疾患を含む乳房の増殖性疾患; 4)良性前立腺肥大症(BPH)を含む前立腺の増殖性疾患;5)増殖性糖尿病性網膜症を含む目の増殖性疾患;及び6)アテローム性動脈硬化症及び冠動脈狭窄を含む血管増殖性疾患から成るグループから選ばれる、請求項1〜14、21又は26の何れか1項に記載のアッセイ。
- 植物若しくは動物源の抽出を通して得られるもの、合成されるもの又は入手可能な強心配糖体の化学的改質を通して製造されるものかに拘わらず、強心配糖体が純粋な形態で存在する、請求項1〜14、21、26、28又は35の何れか1項に記載のアッセイ。
- 強心配糖体が抽出物中に存在する、請求項36に記載のアッセイ。
- 強心配糖体抽出物が、場合によりモディファイヤーの存在下で、超臨界流体(SCF)抽出によって製造された、請求項37に記載のアッセイ。
- SCF抽出物が、強心配糖体とは別に、少なくとも一つの他の薬理学的活性剤を更に含む、請求項38に記載のアッセイ。
- 抽出物が対象物に投与されるときに、他の活性剤が強心配糖体の治療効果に寄与し得る、請求項39に記載のアッセイ。
- 他の活性剤が、強心配糖体の治療効果に寄与するために追加的に又は相乗的に機能する、請求項40に記載のアッセイ。
- 強心配糖体が製剤処方又は製剤組成物中に存在する、請求項36〜40又は41の何れか1項に記載のアッセイ。
- 強心配糖体が、オレアンドリン、ウアバイン、ブファリン、ジギトキシン、ジゴキシン、シノブファタリン、シノブファギン及びレジブフォゲニンから成るグループから選ばれる、請求項36〜40又は41の何れか1項に記載のアッセイ。
- 強心配糖体がセイヨウキョウチクトウ植物群から得られる、請求項36〜40又は41の何れか1項に記載のアッセイ。
- セイヨウキョウチクトウ植物群が、ネリウム オレアンダーなどのネリウム種、又はテベティア ネリフオリアなどのテベティア種を含む、請求項44に記載のアッセイ。
- 抽出物がヒキガエルの皮膚又はそれから由来する分泌物から得られる、請求項36〜40又は41の何れか1項に記載のアッセイ。
- キットが:
a)Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームに対する結合親和性を有する第一の一次抗体;及び
b)Na、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームに対する結合親和性を有する第二の一次抗体;
を含む、予後アッセイを実行する際に使用するのに適しているキット。 - キットが、ウエスタンブロットゲル電気泳動分析を実施する際の使用に適応され、又はキットが、免疫組織化学染色法を実施するために適応される、請求項47に記載のキット。
- 請求項47又は48に記載のキットであって:
a)溶解組成物;
b)Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームを含むポジティブコントロールサンプル;
c)Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォーム及びNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームを含むポジティブコントロールサンプル;
d)Na、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームを含み、そしてNa、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームを含まないネガティブコントロールサンプル;
e)第二抗体、ヤギの抗マウスIgG−HRP(これは、例えば、関心ある蛋白質の可視化のために使用され得る);
f)ゲル電気泳動分析に適しているゲル形成材料;
g)放射線標識マーカー;
h)キットの使用及び予後アッセイの性能に対する指示;
i)濃度計及び線量計;
j)水系液体培地;
k)ゲル/膜製造キット;
l)ブロッキング溶液;
m)洗浄緩衝液;
n)ウェスタンブロット解析キットを含む材料;又は
o)それらの組み合わせ;
を更に含むキット。 - 第一の一次抗体がNa、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームに対して特異的結合親和性を有する、請求項47〜49の何れか1項に記載のキット。
- 第二の一次抗体がNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームに対して特異的結合親和性を有する、請求項47〜50の何れか1項に記載のキット。
- 第二抗体がヤギαマウスIgG西洋ワサビペルオキシダーゼであり、又は西洋ワサビペルオキシダーゼのような適切なマーカーを付けられたマウスIgGに抗して産生されたマウス以外の種からの他の第二抗体を含む、請求項47〜51の何れか1項に記載のキット。
- 一次抗体がモノクロナール抗体である、請求項47〜52の何れか1項に記載のキット。
- ポジティブコントロールサンプルが、生検又は他の外科的切除手段を通して得ることができる組織、細胞の塊、細胞溶解物、及びこれらから調製された膜標本から成るグループから選ばれる、請求項49〜53の何れか1項に記載のアッセイ。
- ネガティブコントロールサンプルが、組織、細胞の塊、細胞溶解物、及びNa、K−ATPアーゼのα−サブユニットのα3アイソフォームを含まない、これらから調製された膜標本から成るグループから選ばれる、請求項49〜54の何れか1項に記載のアッセイ。
- ネガティブコントロールが、インビトロで成長させた齧歯動物(マウス若しくはラット)の腫瘍組織又はマウス又はラットの細胞の塊を含む、請求項55に記載のアッセイ。
- 相対的なNa、K−ATPアーゼのα−サブユニット組成及びアイソフォーム比を決定する代替手段を含み、ここで代替手段が:ELISA(酵素結合免疫吸着法)における抗体又は蛋白質組織又は細胞溶解物配列の使用;異なるNa、K−ATPアーゼサブユニットアイソフォームに対するmRNAの測定のためのノーザンブロット分析及び関連技法(例えば、rtPCR)の使用;又は免疫組織化学染色法の使用;を含む、請求項1〜56の何れか1項に記載の発明。
- 過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患を、強心配糖体を含む組成物を用いて、対象物において治療する方法であって、該方法が:
a)過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患を持つ対象物の疾病にかかったインビボの細胞組織から直接的に又は間接的に得られるサンプル中のNa、K−ATPアーゼのα−サブユニットのα1アイソフォームに対するα3アイソフォームの比を求めること、ここでサンプルはNa、K−ATPアーゼのαサブユニットの一つ又はそれ以上のアイソフォームを含む;及び
b)もし、比が0.3以上であれば、強心配糖体を含む組成物の投与を対象物に指示すること;
を含む方法。 - 過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患を、強心配糖体を含む組成物を用いて、対象物において治療する方法であって、該方法が:
a)対象物から疾病にかかった組織のサンプルを得ること、ここで疾病は過剰な細胞増殖に関連した病因を有し、そしてサンプルはNa、K−ATPアーゼのα−サブユニットの一つ又はそれ以上のアイソフォームを含む;
b)サンプル中のNa、K−ATPアーゼのα−サブユニットのα1アイソフォームに対するα3アイソフォームの比が求められるよう要求すること;及び
c)もし、比が0.3以上であれば、強心配糖体を含む組成物の投与を対象物に指示すること;
を含む方法。 - 対象物が強心配糖体を含む組成物の治療上適切な用量を処方されそして投与される、請求項58又は59に記載の方法。
- 所定の投与処方に従って、対象物が強心配糖体を含む組成物を投与される、請求項60に記載の方法。
- 対象物が強心配糖体を含む抽出物を含む組成物を投与される、請求項61に記載の方法。
- 抽出物が一つ又はそれ以上の他の治療的に有効な成分を更に含む、請求項62に記載の方法。
- 組成物が一つ又はそれ以上の他の治療的に有効な成分を更に含む、請求項58〜63の何れか1項に記載の方法。
- 対象物が強心配糖体を含む植物又は動物源の熱水抽出物を投与される、請求項58〜64の何れか1項に記載の方法。
- 対象物が一日当たり2mgから22.5mgの強心配糖体を投与される、請求項65に記載の方法。
- 対象物が一日当たり0.6mgから4.8mgの強心配糖体を含む植物又は動物源の超臨界流体抽出物を投与される、請求項58〜64の何れか1項に記載の方法。
- 対象物が一日当たり10mgから500μgの強心配糖体を含む組成物を投与される、請求項58〜64の何れか1項に記載の方法。
- 過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患が、そのような疾病又は疾患を有する対象物において、強心配糖体又物を用いる治療に対して、少なくとも部分的に治療応答性であろう確率を求める方法であって、その方法が:
a)対象物の疾病にかかった細胞組織から直接的に又は間接的に得られるサンプル中のNa、K−ATPアーゼのα−サブユニットのα1アイソフォームに対するα3アイソフォームの比を求めること、ここでサンプルはNa、K−ATPアーゼのαサブユニットの一つ又はそれ以上のアイソフォームを含む;及び
b)対象物が強心配糖体の治療上適切な用量を用いて治療されるとして、対象物における治療応答の確率を求めること;ここで少なくとも部分的な治療応答がある確率が下表に記載のNa、K−ATPアーゼのα1アイソフォームに対するα3アイソフォームの比に関係している、
を含む。
- 比を求める工程が、インビトロのサンプル又は生検標本中のNa、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォーム及びNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォーム各々の発現レベルを定量すること、並びにその比を計算することを含む、請求項69に記載の方法。
- それから比が求められるデータについて統計解析を実行することを更に含む、請求項70に記載の方法。
- 細胞、組織又は生検標本を溶解又は破壊すること;又はサンプルを形成するために、疾病にかかったインビボの細胞組織から組織病理学的検査のために組織切片を固定すること;を更に含む、請求項71に記載の方法。
- サンプル中のNa、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームの、及びNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームの量及び相対的発現を求めるために、サンプルについてウエスタンブロット法又は免疫組織化学染色法を実施すること;及びその比を計算すること;を含む、請求項72に記載の方法。
- ポジティブコントロールサンプル及び/又はネガティブコントロールサンプル中の、Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームの及び/又はNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームの含有量に対する、サンプル中のNa、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームの及びNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームの含有量を比較することを更に含む、請求項73に記載の方法。
- 過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患を持つ対象物を同定すること:を更に含む、請求項74に記載の方法。
- 対象物から疾病にかかった細胞のサンプルを得ること:を更に含む、請求項75に記載の方法。
- Na、K−ATPアーゼのα−サブユニットのα1アイソフォーム及びα3アイソフォームに対する分析を如何に実行するかを特定する情報を供することを更に含む、請求項76に記載の方法。
- 予後データを如何に解釈するかを詳細に示す情報を供することを更に含む、請求項77に記載の方法。
- ウエスタンブロット法が:
a)Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームに対する結合親和性を有する第一の一次抗体;及び
b)Na、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームに対する結合親和性を有する第二の一次抗体;
を含む、請求項73に記載の方法。 - 請求項74に記載の方法であって:
サンプル中のNa、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォームの含量、及びNa、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォームの含量を求めるために、ゲルの放射分析又は濃度分析を行うこと含む;及び
サンプル中に存在するα1アイソフォームに対するα3アイソフォームの比を求めること;
を含む方法。 - 請求項73に記載の方法であって、ここで免疫組織化学染色法が:
a)抗原アンマスキング溶液;
b)緩衝液;
c)内因性ペルオキシド活性のクエンチング物質;
d)抗Na、K−ATPアーゼのα3サブユニットアイソフォーム抗体、及び抗Na、K−ATPアーゼのα1サブユニットアイソフォーム抗体;
e)非免疫性マウスIgGI抗体;
f)抗ウサギIgG及び抗マウスIgGの試薬の混合物を含むユニバーサル抗体試薬;
g)主要な化学的染色剤;
h)一般的な化学的でない染色剤;
i)特定細胞小器官染色剤;又は
j)それらの二つ又はそれ以上の組み合わせ;
を含む方法。 - 請求項81に記載の方法であって:
a)哺乳動物の組織のサンプルを供すること;
b)サンプル中に存在するNa、K−ATPアーゼのα−サブユニットのα3アイソフォーム及びα1アイソフォームを免疫化学的に染色すること;
c)サンプル中のNa、K−ATPアーゼのα3アイソフォームの含有量及びNa、K−ATPアーゼのα1アイソフォームの含有量を求めること;及び
d)サンプル中に存在するα1アイソフォームに対するα3アイソフォームの比を求めること;
を含む方法。 - 請求項69、73、79又は81の何れか1項に記載の方法であって、ここで過剰な細胞増殖に関連した病因を有する疾病又は疾患が、1)抗原誘発性の関節炎及びアレルギー性脳脊髄炎などの自己免疫疾患;2)関節リュウマチ、全身発症型若年性慢性関節炎、骨粗鬆症及び乾癬などの慢性炎症性増殖性疾患;3)線維嚢胞性疾患を含む乳房の増殖性疾患;4)良性前立腺肥大症(BPH)を含む前立腺の増殖性疾患;5)増殖性糖尿病性網膜症を含む目の増殖性疾患;6)アテローム性動脈硬化症及び冠動脈狭窄を含む血管増殖性疾患;7)癌;及び/又は8)腫瘍;から成るグループから選ばれる方法。
- 強心配糖体が、オレアンドリン、ウアバイン、ブファリン、ジギトキシン、ジゴキシン、シノブファタリン、シノブファギン及びレジブフォゲニンから成るグループから選ばれる、請求項83に記載の方法。
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