KR101742852B1 - 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물로 신경학적 병태를 치료하는 방법 - Google Patents

네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물로 신경학적 병태를 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물, 또는 이의 분획물 또는 서브-분획물의 투여에 의해 피검체에서의 신경학적 병태를 치료하는 방법으로서, 추출물, 또는 이의 분획물 또는 서브-분획물은 올레안드린 및 네리폴린을 배제하는 방법이 제공된다. 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환 또는 뇌졸중은 피검체에 치료학적 유효량의 추출물, 이의 분획물 또는 서브-분획물을 투여함으로써 치료된다. 추출물은 약제 조성물에 존재할 수 있다.

Description

네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물로 신경학적 병태를 치료하는 방법{METHOD OF TREATING NEUROLOGICAL CONDITIONS WITH EXTRACT OF NERIUM SPECIES OR THEVETIA SPECIES}
본 발명은 네리움(Nerium) 종 또는 테베티아(Thevetia) 종의 추출물(extract), 또는 이들을 함유한 제조물(조성물, 제형)로 신경학적 병태(neurological condition)를 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신경 질환 또는 질병의 치료를 필요로 하는 피검체에 본 추출물을 투여함으로써 신경 질환 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 추출물의 분획물(fraction) 또는 서브-분획물(sub-fraction)을 함유한 약제 조성물, 뿐만 아니라 이들의 사용 방법 및 제조 방법을 포함한다.
신경 질환 및 질병은 뇌 기능에 영향을 미친다. 이러한 질환 및 질병에 대한 치료 또는 개선 요법을 개발하기 위해 많은 노력이 이루어지고 있다. 그러나, 다양한 상이한 질환 및 질병에 대해 효과적인 것으로 입증된 여러 약물 요법 접근법(pharmacotherapeutic approach)이 존재하지만, 포괄적이거나 보편적인 치료 요법이 개발되지 않았다.
헌팅턴 질환(Huntington's disease; HD)은 신경계에 영향을 미치는 뇌의 유전 질환이다. 이는 부모로부터 자녀로 전달되는 결함이 있는 유전자(defective gene)에 의해 야기된다. HD 유전자는 적절한 뇌 발달을 위해 중요한 것으로 나타나는 '헌팅톤(huntington)'으로서 알려진 특정 단백질의 제조를 방해한다. HD의 전형적인 징후는 감정, 인지 및 운동 장애를 포함한다. 헌팅톤은 경련성 비자발적 동작(jerky involuntary movement)(무도증(chorea))에 의해 특징되지만, 때때로 비정상적 동작, 사지 사용의 변화가 없는 경축(실행증(apraxia)), 신체 기능의 제어 상실, 및 기억, 생각의 속도, 판단의 진행성 퇴화, 및 문제의 인식능력 및 계획의 부족을 포함하는 치매를 야기시킨다. 헌팅턴 질환에 대한 치료법은 알려지지 않았다. 감정 및 운동 문제와 같은 HD와 관련된 증상들을 제어하는데 도움을 주기 위하여, 다수의 약제가 존재하지만, 이러한 질환의 과정을 정지시키거나 역전시키기 위한 어떠한 치료법도 존재하지 않는다. 헌팅턴 질환은 일반적인 막 이상(general membrane abnormality)을 갖는 질환으로서 인식되고 있다. Na,K-ATPase의 현저하게 상승된 수준 및 활성도(10배 증가)는 정상인과 비교하여 헌팅턴 환자의 적혈구 및 기저핵의 막에서 관찰되었다[Butterfield DA, Oeswein JQ, Prunty ME, Hisle KC, Markesbery WR. Increased sodium, potassium adenosine triphosphatase activity in erythrocyte membranes in Huntington's disease. Ann Neurology, 4:60-62, 1978) fibroblast membranes obtained from the skin of Huntington's disease patients (Schroeder F, Goetz IE, Roberts E, Membrane anomalies in Huntington's disease fibroblasts. J. Neurochem. 43: 526-539, 1984)].
알츠하이머 질환은 치매 형태, 즉 뇌의 지적 기능(기억, 방향성, 계산 등)을 손상시키지만 대개 이의 운동 기능을 보존시키는 퇴행성 신경 질환이다. 알츠하이머 질환에서, 정신은 점차적으로 퇴화하여, 기억 상실, 혼동(confusion), 방향성 상실, 손상된 판단 및 정상적인 일상 활동을 수행하는 사람의 능력에 영향을 미칠 수 있는 다른 문제를 야기시킨다. 정신적 변화의 타입, 중증도, 순서 및 진행은 매우 다양하다. 알츠하이머 질환에 대한 알려진 치료법이 존재하지 않으며, 이의 진행을 늦추기 위한 알려진 방법도 존재하지 않는다. 이러한 질환의 초기 또는 중기 단계에 있는 몇몇 사람들에 대하여, 타크린(tacrine)과 같은 약제는 일부 인지 증상을 완화시킬 수 있다. 아리셉트(Aricept)(도네페질(donepezil)) 및 엑셀론(Exelon)(리바스티그민(rivastigmine))은 알츠하이머 타입의 가벼운 치매 내지 중간 정도의 치매의 치료를 위한 것으로 지시되어 있는 가역적 아세틸콜린스테라제 억제제이다. 이러한 약물(소위, 콜린스테라제 억제제)은 신경 전달 물질 아세틸콜린의 뇌의 수준을 증가시키도록 작용하여, 뇌 세포들 간의 소통(communication)을 복원시키는데 도움을 준다. 일부 약제들은 불면증(sleeplessness), 초조(agitation), 방황(wandering), 불안 및 우울증과 같은 행동 증상(behavioral symptom)을 조절하는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 치료법은 환자를 더욱 편안하게 하는데 그 목적이 있다. 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 약제가 알려져 있지 않지만, 콜린스테라제 억제제는 일상 활동의 능력을 개선시키거나 운동 장애를 줄일 수 있다. 현재 시험되고 있는 알츠하이머 질환 치료용 약제는 에스트로겐, 비스테로이드성 항염증제, 비타민 E, 셀레길린(selegiline)(Carbex, Eldepryl), 및 식물 생성물인 진코 빌로바(gingko biloba)를 포함한다.
협죽도(Nerium oleander)는 아열대 아시아, 미국 남서부, 및 지중해에 널리 분포된 관상용 식물이다. 이의 의학적 및 독성학적 성질들은 오래 동안 인식되었다. 예를 들어, 치질(궤양), 궤양, 나병(leprosy), 독사교상(snake bite)에서, 및 심지어 낙태 유도에서 사용되었다. 중요한 성분이지만 협죽도 추출물의 단독 성분이 아닌 올레안드린은 강심 배당체이다.
네리움 종의 식물로부터 이러한 배당체의 추출은 협죽도로부터 약리학적/치료학적 활성 성분을 제공한다. 이러한 것들 중에는 올레안드린, 네리폴린(nerifolin), 및 기타 강심 배당체 화합물들이 있다. 상표 ANVIRZEL™로 판매되는, 협죽도의 고온수 추출에 의해 얻어진 올레안드린 추출물은 협죽도의 고온수 추출물의 농축된 형태 또는 분말화된 형태를 함유한다. 고온수 협죽도 추출물(즉, Anvirzel™)의 제1상 시험(Phase I trial)이 완료되었다[Mekhail et al., Am. Soc. Clin. Oncol., vol. 20, p. 82b, 2001]. 이러한 시험에서는 약 57 ㎍ 올레안드린/일을 제공하는 협죽도 추출물이 1.2 ㎖/㎡/d 이하의 용량으로 안전하게 투여될 수 있다고 결론을 내었다. 용량 제한 독성이 확인되지 않았다.
발명의 요약
본 발명은 신경학적 병태의 치료를 필요로 하는 피검체에, 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 함유한 조성물을 상기 신경학적 병태를 치료하기 위한 유효량으로 투여하는 것으로 포함하는, 신경학적 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추출물의 분획물(fraction), 또는 추출물의 분획물의 서브-분획물(sub-fraction)이 분획되지 않은 추출물 대신에 사용되며, 추출물의 분획물 또는 서브-분획물에는 올레안드린 및 네리폴린이 배제되어 있는 구체예를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 포함하는 조성물로 신경 질환 또는 질병의 치료를 필요로 하는 피검체에서 신경 질환 또는 질병을 치료하는 방법으로서,
피검체가 신경 질환 또는 질병을 지니고 있는 지를 결정하고;
상기 피검체에 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 포함하는 조성물의 투여를 지시하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 구체예는 1) 피검체가 치료학적 관련 용량(therapeutically relevant dose)의 조성물로 처방되고 피검체에 이러한 조성물이 투여되거나; 2) 피검체에 처방된 투약 요법에 따라 조성물이 투여되며; 3) 추출물은 네리움 종 또는 테베티아 종으로부터 추출된 하나 이상의 치료학적 효능제(effective agent)를 포함하거나; 4) 조성물이 하나 이상의 다른 치료학적 효능제를 추가로 포함하거나; 5) 추출물이 고온수, 냉수, 초임계 유체, 유기 용매, 또는 이들의 조합물로 네리움 종 또는 테베티아 종을 추출함으로써 얻어지거나; 6) 추출물에는 강심 배당체가 배제되거나; 7) 추출물에는 치료학적 유효량의 강심 배당체가 배제되거나; 8) 추출물에는 올레안드린이 배제되거나; 9) 조성물은 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물의 분획물을 포함하거나; 10) 조성물은 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물의 분획물을 포함하되, 상기 분획물이 추출물의 액체 크로마토그래프 분획(liquid chromatographic fractionation)에 의해 제조된 것이거나; 11) 네리움 종이 협죽도이며, 테베티아 종이 테베티아 네리폴리아(Thevetia neriifolia)이거나; 12) 추출물에는 네리폴린이 배제되거나; 13) 조성물이 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물의 분획물의 서브-분획물을 포함하되, 상기 서브-분획물이 추출물의 분획물의 액체 크로마토그래프 분획에 의해 제조된 것이며, 서브-분획물에는 올레안드린 및 네리폴린이 배제되거나; 14) 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물이, 강심 배당체를 함유하는 경우에, 신경 질환 또는 질병을 지닌 피검체에 투약 형태로 투여될 때, 피검체에 그밖에 유사한 투약 형태를 동일한 강심 배당체 용량으로 투여된 순수한 강심 배당체와 비교하여, 개선된 임상적 반응 또는 임상적 효과를 제공하거나; 15) 이들의 조합을 포함한다.
본 발명은 또한 신경학적 병태의 치료를 필요로 하는 피검체에서 신경학적 병태를 치료하는 방법으로서,
피검체에서의 신경학적 병태가 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 뇌졸중 또는 다른 신경학적 병태인 지의 여부를 결정하고;
네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물의 투여를 지시하고;
소정의 시간 동안 처방된 초기 투약 요법에 따라 피검체에 초기 용량의 추출물을 투여하고;
추출물로의 치료에 대한 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응의 타당성(adequacy)을 주기적으로 결정하고;
피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 타당한 경우에, 요망되는 임상적 종점(clinical endpoint)이 달성될 때까지, 필요한 경우에, 추출물로의 치료를 계속하거나, 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 초기 용량 및 초기 투약 요법에서 타당하지 않은 경우에, 피검체에서의 요망되는 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 달성될 때까지, 용량을 증가 또는 감소시킴을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 신경학적 병태의 위험을 지닌 피검체의 집단에서 신경학적 병태를 예방하거나 이의 발생 빈도를 감소시키는 방법으로서,
알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 뇌졸중 또는 다른 신경학적 병태와 같은 신경학적 병태에 걸릴 위험성이 있는 피검체의 집단에서 하나 이상의 피검체에 유효 용량의 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 연장된 시간 동안 반복적으로 투여하여, 집단에서 신경학적 병태를 예방하거나 발생 빈도를 감소시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 a) 방법이 하나 이상의 피검체에 추출물의 투여를 지시함을 추가로 포함하거나; b) 방법이 피검체에 유효 용량의 추출물을 처방된 투약 요법에 따라 소정의 시간 동안 투여하는 것을 추가로 포함하거나; c) 방법이 추출물로의 치료에 대한 하나 이상의 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응의 타당성을 주기적으로 결정하는 것을 추가로 포함하거나; d) 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 타당한 경우에, 방법이 요망되는 임상적 종점이 달성될 때까지, 필요한 경우에, 추출물로의 연속 치료를 추가로 포함하거나; e) 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 초기 용량 및 초기 투약 요법에서 타당하지 않은 경우에, 방법이 피검체에서의 요망되는 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 달성될 때까지 용량를 증가 또는 감소시키는 것을 추가로 포함하거나; f) 추출물이 집단에서 복수의 피검체테 투여되거나; g) 반복 기준이 매일, 격일, 매 2일, 매 3일, 매 4일, 매 5일, 매 6일, 매주, 격주, 매 2주, 매 3주, 매달, 매 2달, 월 2회, 반달에 한번, 2달에 1회, 분기별로, 2분기 마다, 3분기마다, 계절마다, 년 1회 및/또는 매년마다이거나; h) 연장된 기간이 1주 이상, 1달 이상, 1 분기 이상, 및/또는 1년 이상이거나; i) 유효 용량이 하루에 여러 차례 투여되거나; j) 방법이 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 뇌졸중 또는 다른 신경학적 병태와 같은 신경학적 병태에 걸릴 위험성이 있는 피검체의 집단을 식별함을 추가로 포함하거나; k) 위험성이 있는 피검체 군집이 피검체의 노령화, 신경학적 질병의 가족력, 신경학적 병태의 발병에 대한 유전적 소인, 피검체에서 ApoE4 유전자의 존재 및 발현, 여성 (여성이 알츠하이머병에 남성보다 2배 걸렸음), 심혈관 질환 (예를 들어, 고혈압 및 고콜레스테롤 수준), 당뇨병 (특히, 타입 2 또는 이러한 질환의 성인 발병 형태), 다운 증후군, 뇌 손상, 낮은 수준의 교육 수준, 흡연, 과도한 알코올 섭취 및/또는 약물 남용을 특징으로 하거나; l) 추출물에는 치료학적 유효량의 강심 배당체가 배제되거나; m) 추출물에는 강심 배당체가 배제되거나; 또는 n) 이들의 조합인 구체예를 포함한다.
본 발명은 또한, 피검체에서 뇌졸중을 치료하는 시간 지연 방법으로서,
피검체가 뇌줄중에 걸린 후에 지연 시간 내에, 초기 투약 요법에 따라 초기 용량의 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 투여하고;
추출물의 치료에 대한 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응의 타당성을 결정하고;
피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 타당한 경우에, 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 타당한 경우에, 요망되는 임상적 종점이 달성될 때까지 필요한 경우에, 추출물로 치료를 계속하거나, 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 초기 용량 및 초기 투약 용법에서 타당하지 않은 경우에, 피검체에서의 요망되는 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 달성될 때까지 용량을 증가 또는 감소시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 구체예는 1) 지연 기간이 10 시간 또는 그 미만, 8 시간 또는 그 미만, 6 시간 또는 그 미만, 4 시간 또는 그 미만, 3 시간 또는 그 미만, 2 시간 또는 그 미만, 1 시간 또는 그 미만, 45분 또는 그 미만, 30분 또는 그 미만, 20분 또는 그 미만, 또는 10분 또는 그 미만이거나, 2) 피검체의 임상적 및/또는 치료 반응의 타당성의 결정이 신체 한 쪽의 안면, 팔 또는 다리의 약함, 신체 한 쪽의 안면, 팔 및/또는 다리의 무감각, 언어의 이해 불능, 분명하게 말하지 못하는 것, 쓰지 못하는 것, 현기증 및/또는 걸음걸이 불균형, 복시 및 비정상적인 두통의 평가에 의해 이루어지거나; 3) 이들의 조합인 구체예를 포함한다.
본 발명은 또한, 피검체에서 신경학적 병태의 치료를 위한 약제의 제조에서의 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물의 용도를 제공한다. 일부 구체예에서, 이러한 약제의 제조는 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 제공하고, 소정 용량의 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물, 또는 이의 분획물을 약제학적 투약 형태로 포함시키고, 약제학적 투약 형태를 패키징시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한, 피검체에서 신경학적 병태의 치료를 위한 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 이러한 제조는 PCT 국제출원번호 PCT/US06/29061호(2006년 7월 26일에 출원됨), 미국특허 제7,402,325호(2005년 7월 28일에 출원됨) 또는 U.S.S.N. 12/019,435호(2008년 1월 24일에 출원됨)에 기술된 바와 같이 수행될 수 있으며, 이러한 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 제조는 또한 하나 이상의 추가 단계, 예를 들어 패키징된 투약 형태를 벤더(vendor)(소매상, 도매상 및/또는 유통업체)로 전달하는 단계; 패키징된 투약 형태를 신경학적 병태를 지닌 피검체에게 판매하거나 달리 제공하는 단계; 투약 형태의 사용, 투약 요법, 투여, 함유물 및 독성학적 프로파일에 대한 설명서를 제공하는 패키지 삽입물(package insert) 및 라벨을 약제에 포함시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 신경학적 병태의 치료는 피검체가 신경 질환 또는 질병을 갖는 지를 결정하고, 투약 요법에 따라 피검체에 추출물, 이의 분획물의 투여를 지시하고, 피검체에 추출물을 함유한 하나 이상의 약제학적 투약 형태를 투여하되, 하나 이상의 약제학적 투약 형태가 투약 요법에 따라 투여됨을 포함한다.
본 발명은 또한, 신경학적 병태의 치료를 위한, 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물 또는 조성물, 즉 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 포함하는 약제학적 제형 또는 투약 형태를 제공한다. 일부 구체예에서, 추출물은 본원에 기술되거나 미국특허번호 7,402,325, PCT 국제출원번호 PCT/US06/29061, 미국특허출원번호 12/019435, 또는 문헌[Newman et al. (Mol. Interven. (2008), 8, 36-49)]에 기술된 바와 같이, 네리움 종 또는 테베티아 종으로부터 얻어질 수 있으며, 이러한 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물의 분획물을 제조하는 방법으로서, 네리움 종 또는 테베티아 종을 포함하는 물질(mass)을 추출하여 신경학적 병태의 치료를 위한 하나 이상의 약리학적 활성 성분을 포함하는 이의 비분획된 추출물을 형성시키고, 비분획된 추출물을 분획하여 두 개 이상의 이의 분획물을 형성시키되, 적어도 하나의 분획물이 하나 이상의 비-강심 배당체의 약리학적 활성 성분을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, a) 적어도 하나의 분획물에는 강심 배당체가 배제되거나, b) 적어도 하나의 분획물이 강심 배당체를 추가로 포함하거나, c) 추출물이 초임계 유체, 물, 유기 용매 또는 이들의 조합물로 수행되거나, d) 분획화가 액체 크로마토그래피 또는 용매 추출에 의해 수행되거나, e) 적어도 하나의 분획물에는 올레안드린 및 네리폴린이 배제되거나, f) 이들의 조합이 제공된다.
본 발명은 또한, 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물의 하나 이상의 치료학적으로 효과적인 분획물을 제공하기 위하여, 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 분획시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 a) 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 제공하고, b) 추출물을 분획하여 추출물의 두 개 이상의 상이한 분획물을 제공하되, 제 1 추출물 분획물이 강심 배당체가 아닌 하나 이상의 약리학적 활성제를 포함하고 강심 배당체(올레안드린 및 네리폴린)룰 배제하며, 제 2 추출물 분획물이 하나 이상의 강심 배당체, 및 강심 배당체가 아닌 하나 이상의 약리학적 활성제를 포함하는 것을 포함한다. 이러한 분획화는 또한 본원에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 제 1 또는 제 2 추출물 분획물은 추가로 분획되어 두 개 이상의 상이한 서브-분획물을 제공하며, 여기서 제 1 서브-분획물은 하나 이상의 스테로이드를 포함하며, 제 2 서브-분획물은 하나 이상의 트리테르펜을 포함한다. 일부 구체예에서, 분획화는 정지상 및 이동상과 함께 액체 크로마토그래피에 의해 수행된다.
본 발명은 또한, 네리움 종 또는 테베티아 종으로부터 얻어진 추출물의 분획물을 포함하는 조성물을 제공하며, 이에 의해, 분획물은 네리움 종 또는 테베티아 종으로부터 얻어진 추출물의 분획화에 의해 얻어진 것이다. 일부 구체예에서, 추출물의 분획물은 하나 이상의 스테로이드 및 하나 이상의 트리테르펜을 포함하고, 임의적으로 강심 배당체(올레안드린 또는 네리폴린)를 배제한다.
본 발명은 또한, 네리움 종 또는 테베티아 종으로부터 얻어진 추출물의 분획물의 서브-분획물을 포함하는 조성물을 제공하며, 이에 의해 이러한 서브-분획물은 네리움 종 또는 테베티아 종으로부터 얻어진 추출물의 분획물의 추가 분획화에 의해 얻어진 것이다. 일부 구체예에서, 추출물의 분획물의 서브-분획물은 하나 이상의 스테로이드, 강심 배당체, 강심 배당체의 관련된 아글리콘, 예를 들어, 올레안드리게닌, 카르데놀리드, 또는 트리테르페노이드, 및 하나 이상의 트리테르펜을 포함한다. 일부 구체예에서, 추출물의 분획물의 서브-분획물은 하나 이상의 트리테르펜을 포함하고 스테로이드를 배제한다. 각 서브-분획물에는 독립적으로 임의적으로 강심 배당체(올레안드린 및 네리폴린)가 배제되어 있다.
일부 구체예에서, a) 추출물은 네리움 종 또는 테베티아 종으로부터 얻어진(추출된) 적어도 두 개의 약리학적 활성제를 추가로 포함하고/거나, b) 적어도 두 개의 약리학적 활성제가, 추출물이 피검체에 투여될 때 추출물의 치료학적 효능에 추가적으로 또는 상승적으로 기여하도록 기능하고/거나, c) 적어도 두 개의 약리학적 활성제에는 강심 배당체가 존재하지 않고/거나, d) 적어도 두 개의 약리학적 활성제가 강심 배당체, 강심 배당체의 관련된 아글리콘, 예를 들어, 올레안드리게닌, 카르데놀리드 또는 트리테르페노이드의 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 1) 강심 배당체는 올레안드린, 오도로사이드, 네리탈로사이드, 오우아바인, 부팔린, 디기톡신, 시노부파탈린, 시노부파긴, 및 레시부포게닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 2) 추출물은 약제학적 제형 또는 조성물에 존재하며, 3) 추출물은 협죽도 식물 물질 또는 네리폴리아 식물 물질로부터 얻어진 것이며, 4) 식물 물질은 네리움 종, 예를 들어 협죽도, 또는 테베티아 종, 예를 들어 테베티아 네리폴리아 또는 테베티아 페루비아나(Thevetia peruviana) (달리 노랑 협죽도(yellow oleander)로서 알려짐)을 포함하며; 5) 추출물은 임의적으로 개질제의 존재 하에, 초임계 유체(SCF) 추출에 의해 제조되며, 6) 강심 배당체는 올레안드린이며, 7) 추출물은 고온수 추출, 냉수 추출, 유기 용매 추출 또는 수성 유기 용매 추출에 의해 제조된다.
일부 구체예에서, 추출물(또는 이의 분획물 또는 서브-분획물)은 1 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 0.1 중량% 미만, 0.05 중량%, 또는 0.01 중량% 미만의 다당류를 포함한다. 일부 구체예에서, 추출물 (또는 이의 분획물 또는 서브-분획물)은 베툴린 (우르스-12-엔-3β,28-디올); 28-노루르스-12-엔-3β-올; 우르스-12-엔-3-올; 3β,3β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익 산; 3β,20α-디하이드록시우르스-21-엔-38-오익 산; 3β,27-디하이드록시-12-우르센-38-오익 산; 3β,13β-디하이드록시우르스-11-엔-28-오익 산; 3β,12α-디하이드록시올레아난-28,13β-올리드; 및 3β,27-디하이드록시-12-올레아난-28-오익 산을 포함한다. 일부 구체예에서, 추출물 (또는 이의 분획물 또는 서브-분획물)은 강심 배당체의 당체 구성성분으로부터 선택된 하나 이상의 강심 배당체 전구체를 포함한다. 일부 구체예에서, 당체는 글리코사이드, 플룩토사이드, 및 글루쿠로나이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 추출물 (또는 이의 분획물 또는 서브-분획물)은 올레안드리게닌, 우르솔릭산, 베툴린산, 오도로사이드, 네리탈로사이드, 올레안올산, 및 하나 이상의 트리테르펜, 및 0.5 중량% 미만의 다당류를 포함한다.
일부 구체예에서, 신경학적 병태를 지닌 피검체, 즉 이를 필요로 하는 피검체는 이러한 피검체의 집단의 일부이다. 본 발명은 신경학적 병태를 갖는 피검체의 집단에서 통계학적으로 유의미한 수의 피검체의 임상적 상태를 개선시키는 방법으로서, 피검체의 집단에 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물, 또는 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 포함하는 조성물을 투여하고, 피검체의 임상적 상태를 결정함을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 통계학적으로 유의미한 수는 집단의 적어도 5%이다.
일부 구체예에서, 신경학적 병태는 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 뇌졸중, 타우병증 또는 본원에 기술된 것과 같은 다른 신경학적 병태이다. 약제는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약제학적 투약 형태에 추출물을 포함시킴으로써 제조될 수 있다.
추출물 또는 추출물을 함유한 조성물로의 피검체의 치료는 필요한 경우에 계속된다. 용량 또는 투약 요법은, 환자가 질환과 관련된 특정 신경학적 증상의 감소 또는 완화와 같은 요망되는 임상적 종점(들)에 도달할 때까지 필요한 경우에 조정될 수 있다. 임상적 반응 및/또는 치료 반응의 타당성의 결정은 치료될 신경학적 병태에 익숙한 임상의에 의해 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 신경학적 병태는 신경 질환, 신경학적 질병, 타우병증, 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 신경 질환은 퇴행성 신경 질환이다. 일부 구체예에서, 퇴행성 신경 질환은 헌팅턴 질환, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 근위축성 측색 경화증, 광우병, 다발성 경화증, 당뇨병성 신경병증, 자폐증 및 청소년 신경원성 세로이드 리포푸신증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 뇌졸중은 뇌줄중-매개 허혈성 손상이다. 일부 구체예에서, 신경학적 병태는 타우병증으로서, 이는 피검체에서 Tau3R/Tau4R 비율의 불균형과 관련된 병인을 갖는 퇴행성 신경 질환이다. 타우병증은 인간 뇌에서 tau 단백질의 병리학적 응집으로부터 초래된 퇴행성 신경 질환의 부류이다. 일부 구체예에서, 타우병증은 다운 증후군, 피크 질환, 피질기저 퇴행(corticobasal degeneration), 단백질 질환의 몇몇 변형체, 알츠하이머 질환, 진행성 핵상 마비 또는 전측두엽 치매이다. 본 방법의 개개 단계는 별도의 설비에서 또는 동일한 설비 내에서 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 뉴런은 시험관내, 생체외 또는 생체내에 존재하는 것이다. 일부 구체예에서, 뉴런은 CA-1 뉴런이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 1HNMR 스펙트럼을 갖는, 네리움 종 또는 네리폴리아 종의 추출물, 또는 이의 분획물, 또는 이의 서브-분획물을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 피검체에 투여될 때 본원에 기술된 바와 같은 치료 활성을 나타내는, 네리움 종 또는 네리폴리아 종의 추출물, 또는 이의 분획물, 또는 이의 서브-분획물을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 HPLC 크로마토그램을 갖는 네리움 종 또는 네리폴리아 종의 추출물, 또는 이의 분획물, 또는 이의 서브-분획물을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 본원에 기술된 바와 같은, 추출물, 또는 이의 분획물, 또는 이의 서브-분획물을 사용한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 바와 같은, 추출물, 또는 이의 분획물, 또는 이의 서브-분획물을 포함한다.
본 발명은 본원에 기술된 본 발명의 양태, 구체예, 및 서브-구체예들의 모든 조합을 포함한다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 용어 "추출물"은 비분획된 추출물 또는 분획된 추출물, 즉 추출물의 분획물, 또는, 서브-분획된 추출물, 즉 추출물의 분획물의 서브-분획물을 지칭할 수 있다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 청구된 발명의 대표적인 구체예들을 기술한다. 당업자는, 이러한 도면 및 본원의 명세서를 고려하여, 과도한 실험 없이 본 발명을 실행할 수 있다.
도 1a는 신경보호 뇌-절편-기반 "뇌졸중" 검정 (실시예 8)에서 올레안드린 대 대조군인 비-산소 또는 글루코즈 결핍 (OGD)의 비교 평가로부터 얻어진 농도-반응 데이타를 도시한 것이며, 여기서 건강한 피질 뉴런의 수는 올레안드린의 존재 또는 부재 하에 5-6분의 산소 및 글루코즈 결핍 (OGD= 뇌졸중) 후에 결정된다.
도 1b는 본원에 기술된 신경보호 뇌-절편-기반 "뇌졸중" 검정(실시예 8)에서 협죽도의 비분획된 SCF 추출물에 대한 농도-반응 검정의 결과를 도시한 것이며, 여기서 비-산소 또는 글루코즈 결핍이 대조군으로서 사용된다.
도 2a 내지 도 2c는 신경보호 뇌-절편-기반 "알츠하이머" 검정(실시예 9)에서 올레안드린 대 협죽도의 비분획된 SCF 추출물의 비교 평가의 결과를 도시한 것이며, 여기서 건강한 피질 뉴런의 수는 다양한 양의 이러한 제제의 부재 또는 존재 하에 APP/Aβ-유도된 퇴화 이후에 결정된다.
도 3a 내지 도 3d는 신경보호 피질선조체 공동 배양 뉴런-기반 "헌팅턴 질환" 검정 (실시예 10)에서 올레안드린(도 3a 및 3b)의 비교 평가의 이중 실험으로부터의 결과를 도시한 것이며(도 3c 및 3d), 여기서 돌연변이 형태의 헌팅톤(htt) 단백질로 트랜스펙션된 피질 뉴런 대 선조체 뉴런(striatal neuron)의 보호율(percent rescue)이 다양한 양의 올레안드린의 부재 또는 존재 하에, 대조군과 비교하여 결정된다.
도 4a 내지 도 4e는 본원에 기술된 바와 같인 신경보호 뇌-절편-기반 "뇌졸중" 검정의 결과를 도시한 것으로서, 여기서 올레안드린-함유 SCF 추출물은 액체 크로마토그래피(실시예 13)에 의해 분획된 것이며, 5개의 상이한 분획물(하기에 기술됨)이 이러한 검정으로 처리된다(실시예 15): 분획물 O-H (도 4a), 분획물 0-2 (도 4b), 분획물 0-3 (도 4c), 분획물 0-4 (도 4d), 분획물 0-5 (도 4e).
도 5는 협죽도의 SCF 추출물의 분획물 0-4 대 분획되지 않은 협죽도 SCF 모 추출물(PBI 또는 PBI-05204)에 대한 농도-반응 뇌-절편-기반 "뇌졸중" 검정(실시예 15)의 결과를 도시한 것이다.
도 6은 APP-기반 "알츠하이머" 검정 (실시예 11)에서 협죽도 SCF 추출물의 분획물(0-4 또는 0-4A) 대 미처리된 것(세포는 APP/Aβ로 트랜스펙션되지 않음)의 비교 평가 결과를 도시한 것이며, 여기서 건강한 피질 뉴런 및 손상된 피질 뉴런의 수는 다양한 양의 이러한 제제의 부재 또는 존재 하에 APP/Aβ-유도 퇴화 이후에 결정된다.
도 7은 Tau4R 기반 "알츠하이머" 검정 (실시예 12)에서 협죽도 SCF 추출물의 분획물(0-4) 대 미처리된 것(세포는 APP/Aβ로 트랜스펙션되지 않음)의 비교 평가 결과를 도시한 것이며, 여기서 건강한 피질 뉴런 및 손상된 피질 뉴런의 수는 다양한 양의 이러한 제제의 부재 또는 존재 하에 Tau4R 이후에 결정된다.
도 8a 내지 도 8d는 실시예 13에 따라 제조된 분획물의 HPLC 분석에 의해 얻어진 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 9a 내지 도 9i는 분획물 0-4 협죽도 SCF 추출물에 존재하는 다양한 성분들에 대한 HNMR 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 9a는 실시예 17에 따른 서브-분획화 이전의 0-4 분획물의 HNMR 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 9b 내지 도 9i는 0-4 분획물 상에서 수행된, 실시예 17에 따른, 실라카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 얻어진 다양한 서브-분획물에 대한 HNMR을 도시한 것이다.
본 발명은 신경학적 병태의 치료를 필요로 하는 피검체에 유효 용량의 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 투여함으로써 신경학적 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 추출물은 피검체에 대해 가장 적합한 투약 요법에 따라 투여되며, 용량 및 투약 요법의 적합성은 치료될 신경학적 병태에 대한 통상적인 임상 실시 및 임상적 치료 종점에 따라 임상적으로 결정된다.
일부 구체예에서, 치료될 퇴행성 신경 질병 또는 신경학적 병태는 피검체에서 tau 단백질의 과발현 및/또는 Tau3R/Tau4R 비의 불균형과 관련된 병인을 갖는다. 이러한 병태는 타우병증이라 칭하여 진다. 대표적인 타우병증은 다운 증후군, 피크 질환(Pick's disease), 단백질 질환의 일부 변형체, 알츠하이머 질환, 진행성 핵상 마비(progressive supernuclear palsy) 또는 전측두엽 치매, 피질기저 퇴행(corticobasal degeneration), 괌 파킨슨 질환 치매 증후군(Guam parkinsonism dementia complex), 은친화성 그래인 치매(dementia with argyrophilic grain), 타입 C 니만=피크 질환(Niemann-Pick disease Type C), 및 권투선수 치매(dementia pugilistic)를 포함한다.
일부 구체예에서, 치료될 퇴행성 신경 질병 또는 신경학적 병태는 아밀로이드 베타 전구체 단백질의 비정상적 또는 비정형 단백질 분해, 뉴런의 시냅스에서의 아밀로이드 베타 단백질의 축적, 뉴런의 시냅스에서의 아밀로이드 피브릴의 형성, 또는 뉴런의 시냅스에서의 아밀로이드 플라크의 형성과 관련된 병인을 갖는다. 이러한 질병 또는 병태의 대표예는 알츠하이머 질환이다. 본 발명에 따라 치료되는 피검체는 치료 반응을 나타낼 것이다. "치료 반응"은 질환 또는 질병에 걸린 피검체가 추출물로의 치료의 결과로서 하기 임상적 이득들 중 적어도 하나를 누리는 것을 의미한다: 질환 또는 질병의 개선, 질환 또는 질병과 관련된 증상의 발생의 감소, 질환 또는 질병의 일부 완화, 질환 또는 질병의 완전 완화, 또는 진행 시간의 증가. 다시 말해서, 치료 반응은 전체 또는 일부 치료 반응일 수 있다.
치료 반응은 또한 퇴행성 신경 질환으로 고통받는 환자의 삶의 질이 개선되는 것으로 기술될 수 있다. 삶의 질의 개선은 예를 들어, 질환된 관련된 증상(예를 들어, 떨림, 비자발적 근육 운동, 신경-근육 조직화, 기억 보존의 손실 또는 일부 손실 등)의 발생, 횟수 또는 중증도의 감소를 통해 일어날 수 있다.
"위험성을 갖는 피검체의 집단에서 신경학적 병태의 발생을 예방하는"은 신경학적 병태가 신경학적 병태에 걸린 위험을 갖는 피검체의 인구학적으로 사전결정된 집단에서 사전결정된 기간 동안에 일어나지 않음을 의미한다. 사전결정된 기간 동안의 예방은 본 발명에 따라 추출물이 투여된 집단에서의 피검체의 결과로서 일어난다. 일 예로서, 추출물 또는 추출물-함유 조성물은 뇌졸중에 걸린 위험성이 있는 피검체의 집단에서 피검체에 사전결정된 기간 동안 투여될 때, 뇌졸중은 사전결정된 기간 동안 이러한 피검체에서 일어나지 않을 것이다. 특히, 추출물-함유 조성물은 알츠하이머 질환 또는 타우병리학(tauopathology) 관련 질환 중 임의의 것에 걸릴 위험성이 있는 피검체의 집단에 1년의 시간에 걸쳐 장시간 투여되며, 이러한 집단에서의 피검체는 1년 동안 알츠하이머 질환과 관련된 증상을 나타내지 않는다.
"위험성이 있는 피검체의 집단에서 신경학적 병태의 발생 빈도의 감소"는 인구학적으로 사전결정된 피검체 집단에서 "발생 빈도의 감소"가 신경학적 병태의 발생을 허용하지만 본 발명에 따른 추출물-함유 조성물이 투여되지 않은 위험성이 있는 다른 인구학적으로 유사한 사전결정된 피검체 집단과 비교하여 감소된 발생율 또는 중증도의 수준에서 허용되는 것을 제외하고는, "발생 빈도"를 막는다는 의미와 관련이 있다.
본원에서 사용되는 "진행되기 까지의 시간(time to progression)"은 질환이 진단(또는 치료)된 후 질환이 악화되기 시작할 때까지의 시간, 시간의 길이 또는 기간이다. 이는 질환의 추가 진행 없이 질환의 수준이 유지되는 동안의 시간이며, 이러한 시간은 질환이 다시 진행될 때 종료된다. 질환의 진행은 치료법의 개시 전에 또는 개시시에 신경학적 병태에 걸린 피검체를 "단계화(staging)"함으로써 결정된다. 예를 들어, 피검체의 신경학적 건강은 치료법의 개시 전 또는 개시 시에 결정된다. 이후에, 피검체는 추출물로 치료되며, 신경학적 건강이 주기적으로 모니터링된다. 일정 시점 후에, 신경학적 병태의 증상은 악화될 수 있으며, 이에 따라, 질환의 진행 및 "진행되기 까지의 시간"의 종료를 마킹한다. 질환이 진행하지 않거나 질환의 수준 또는 중증도가 악화되지 않는 시간은 "진행되기 까지의 시간"이라 한다.
투약 요법은 투약 스케쥴에 따라 투여되는 치료학적 관련 용량(또는 유효 용량)의 추출물을 포함한다. 이에 따라, 치료학적 관련 용량은 추출물로의 치료에 대한 질환 또는 질병의 치료 반응이 관찰되고 피검체에 과도한 양의 원치 않거나 유해한 부작용 없이 추출물이 투여될 수 있는 치료학적 용량이다. 치료학적 관련 용량은 피검체에 치명적이지 않지만, 환자에게 약간의 부작용을 야기시킬 수 있다. 이는 추출물이 투여된 피검체에 대한 임상적 이득의 수준이 추출물의 투여로 인해 피검체에 의해 경험되는 유해한 부작용의 수준을 초과하는 용량이다. 치료학적 관련 용량은 다양한 확립된 약리학적, 약력학적, 및 약동학적 원리에 따라 피검체에 따라 변경할 것이다. 그러나, 치료학적 관련 용량은 통상적으로 하루에 0.1 내지 100 마이크로그램의 추출물의 범위일 것이며, 이러한 추출물은 고체, 액체, 또는 바고체 형태 중 어느 하나이다. 당해 분야에는, 피검체에서 표적 치료 결과를 제공하기 위해 요구되는 약리학적 활성제의 실제 양이 약학의 기본 원리에 따라 피검체에 따라 변경될 수 있다는 것이 공지되어 있다.
치료학적 관련 용량은 신경학적 또는 퇴행성 신경 질환 또는 질병의 치료에서 통상적으로 사용되는 임의의 투약 요법에 따라 투여될 수 있다. 치료학적 관련 용량은 1회, 2회, 3회 또는 그 초과의 일일 투약 스케쥴로 투여될 수 있다. 이는 매 2일, 매 3일, 매 4일, 매 5일, 매 6일, 매주, 매 2주, 매 3주, 매 4주, 매달, 매 2달, 월 2회, 반달에 한번, 매 3 달, 매 4달, 반년마다, 매년마다, 또는 적합한 투약 스케쥴에 도달하도록 상기 것 중 임의의 조합에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료학적 관련 용량은 1주 이상 동안 하루에 한번씩 투여될 수 있다.
하기 실시예는 신경학적 병태, 예를 들어 신경 질환, 신경학적 질병, 및 뇌졸중에서 추출물의 효능의 증거를 포함한다. 실시예 3은 알츠하이머 질환을 하나 이상의 다른 치료제와 함께 네리움 종 추출물, 또는 이의 조성물, 테베티아 종 추출물 또는 이의 조성물, 또는 이의 조합물로 치료하는 방법을 상세히 기술한 것이다. 실시예 4는 헌팅턴 질환을 하나 이상의 다른 치료제와 함께 추출물 또는 추출물의 조합물로 치료하는 방법을 상세히 기술한 것이다. 실시예 5는 뇌졸중-매개 및 비-뇌졸중 매개 허혈성 뇌 손상을 하나 이상의 다른 치료제와 함께 추출물 또는 추출물의 조합물로 치료하는 방법을 상세한 기술한 것이다.
일반적으로, 신경학적 병태를 지닌 피검체는 하기와 같이 치료된다. 신경학적 병태가 존재하는 피검체는 신경학적 병태가 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 뇌졸중 또는 다른 신경학적 병태인지의 여부를 결정하기 위해 평가된다. 피검체가 양성 진단을 받은 경우에, 추출물 또는 추출물-함유 조성물의 투여가 지시된다. 초기 용량의 추출물 또는 조성물은 소정의 시간 동안 처방된 투약 요법에 따라 피검체에 투여된다. 피검체의 임상적 반응 및 치료 반응의 수준은 주기적으로 결정된다. 치료 반응의 수준이 1회 용량에서 너무 낮은 경우에, 용량은 피검체에서 요망되는 치료 반응 수준이 달성될 때까지 사전결정된 용량 상승 스케쥴에 따라 상승된다. 피검체가 요망되지 않는 부작용 또는 허용되지 않은 부작용 수준을 나타내는 경우에, 용량은 피검체에서 치료 반응의 수준 대 부작용 프로파일의 요망되는 균형이 달성될 때까지 감소된다. 추출물 또는 조성물로의 피검체의 치료는 필요한 경우에 지속된다. 용량 또는 투약 요법은, 환자가 질환 자체의 정지(cessation), 질환 관련 증상의 감소, 및/또는 질환 공정의 진행의 감소와 같은 요망되는 임상적 종점(들)에 도달할 때까지 필요한 경우에 조정될 수 있다.
추출물, 특히 비분획된 추출물은 하나 이상의 약리학적 활성 화합물을 포함한다. 이러한 화합물들 중 일부는 아직 확인되지 않았으며, 일부는 올레안드린 또는 다른 강심 배당체, 올레아시드, 올레안드리게닌, 네리탈로사이드, 오도로사이드[Wang X, Plomley JB, Newman RA and Cisneros A. LC/MS/MS analyses of an oleander extract for cancer treatment, Analytical Chem. 72: 3547-3552, 2000], 및 다른 식물 물질일 수 있다. 초임계 유체 공정으로부터의 비분획된 SCF 추출물은 통상적으로 0.9 중량% 내지 2.5 중량%의 올레안드린의 이론적 범위를 함유한다. 다양한 양의 올레안드린을 포함하는 SCF 추출물이 얻어진다. 일 구체예에서, SCF 추출물은 약 2 중량%의 올레안드린을 포함한다.
네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물의 추출 가능한 비분획된 성분은 SCF 추출물 또는 이의 분획물의 효능에 기여하는 적어도 하나의 (비-강심 배당체) 약리학적 활성 성분을 포함할 수 있다. 추출 가능한 두 개 이상의 약리학적 활성 성분은 관찰된 효능을 제공하기 위해 추가적으로 또는 상승적으로 기능할 수 있다. 다시 말해서, 본 발명의 네리움 종 또는 테베티아 종 추출물은 강심 배당체가 아닌 하나 이상의 약리학적 활성 성분을 포함하며, 하나 이상의 강심 배당체는 추출물에 추가적으로 포함될 수 있다. 추출물은 다양한 다른 분획물들로 분획될 수 있으며, 이들 중 일부는 강심 배당체, 하나 이상의 비-강심 배당체 약리학적 활성 성분, 또는 이들의 조합물을 함유한다. 또한, 추출물의 각 분획물은 두 개 이상의 상이한 서브-분획물들로 추가로 분획될 수 있다.
SCF 추출물 중에 올레안드린 이외의, 하나 이상의 약리학적 활성 성분의 존재 증거는, 순수한 올레안드린을 함유한 용액 대 SCF 추출물을 함유한 용액에 대한 농도-반응 곡선을 비교함으로써 얻어진다. 도 1a는 실시예 8에 기술된 바와 같은 신경 보호 뇌-절편-기반 "뇌졸중" 검정에서 순수한 올레안드린을 함유한 용액에 대한 농도-반응 검정의 결과를 도시한 것이다. 용액 중의 올레안드린의 농도는 0.0069 내지 230 ㎍/㎖로 다양하다. 도 1b는 본원(실시예 8)에 기술된 바와 같이 신경보호 뇌-절편-기반 "뇌졸중" 검정에서 올레안드린-함유 SCF 네리움 종 추출물에 대한 농도-반응 검정의 결과를 도시한 것이다. 이러한 데이타는 추출물이 순수한 올레안드린에 비해 더욱 효과적임을 입증하는 것으로서, 이는 추출물이 신경보호를 제공하는 하나 이상의 약리학적 활성제를 함유함을 의미한다.
실시예 8은 뇌졸중-매개 허혈성 뉴런 손상의 치료를 위한, 추출물, 또는 이의 조성물의 효능을 평가하기 위해 사용되는 시험관내 검정의 상세한 설명을 제공한다. 이러한 검정은 24시간에 건강한 피질 뉴런의 >50% 손실을 유도하기 위해 사용되는 산소 및 글루코즈 결핍 (OGD)에 대한 뇌-절편-기반 검정이다. 네리움 종, 예를 들어 협죽도의 비분획된 SCF 모 추출물은 양성 대조군으로서 사용된다. 모 추출물은 이후에 실시예 13에 따라 분획되어 네리움 종의 추출물의 분획물을 제공한다. 이러한 분획물들은 실시예 6, 14 및 17에 따라 분석된다.
트리테르펜의 HNMR은 업필드에서 7개의 메틸 신호, ca. 5.3 ppm에서 올레핀 양성자, 및 업필드(ca. 1.0 내지 2.5 ppm)에서 여러 메틸렌 및 메틴 양성자와 함께 ca 3.4 ppm에서 산소화된 메틴 신호에 의해 특징된다. HNMR 스펙트럼(도 9b 내지 9i)은 스테로이드 및 트리테르펜으로서 주요 성분을 지시한다. 상당한 양의 클리코사이드에 대한 신호는 관찰되지 않았다. 강심 배당체에 대한 특징인 α,β-불포화된 γ- 또는 δ-락톤에 대한 신호는 관찰되지 않았는데, 이는 Fr-O-4 분획물에 강심 배당체 또는 이의 아글리콘이 존재하지 않음을 시사하는 것이다. 도 9c의 HNMR 스펙트럼은 적어도 하나의 스테로이드 및 적어도 하나 또는 적어도 두 개의 상이한 트리테르펜을 포함하는 서브-분획물에 해당하는 것이다. 도 9b의 HNMR 스펙트럼은 적어도 두 개의 상이한 트리펜, 예를 들어 두 개의 우르산의 혼합물을 포함하고 스테로이드를 배제한 서브-분획물에 해당하는 것이다.
이에 따라, 분획물 0-4는 적어도 하나의 트리테르펜 및 적어도 하나의 스테로이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분획물 0-4는 적어도 두 개의 상이한 트리테르펜 및 적어도 두 개의 상이한 스테로이드를 포함하거나, 이러한 분획물은 복수의 상이한 트리테르펜 및 복수의 상이한 스테로이드를 포함한다. 이러한 실시예에서 평가된 0-4 분획물에는 치료학적 유효량의 강심 배당체가 배제된다. 일부 구체예에서, 분획물 0-4에는 강심 배당체가 배제된다. 일부 구체예에서, 분획물 0-4의 제 1 서브-분획물은 적어도 하나의 스테로이드 및 적어도 하나의 트리테르펜 또는 적어도 두 개의 상이한 트리테르펜을 포함하며, 제 2 서브-분획물은 적어도 두 개의 상이한 트리펜을 포함하고, 스테로이드를 배제한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 서브-분획물 각각은 강심 배당체를 배제한다.
분획물 0-4는 OGD 처리된 뇌 절편(뇌졸중 모델), 및 OGD 처리되지 않은(즉, 대조군) 뇌 절편(비-뇌졸중 모델)에서 시험된다. 데이타는 추출물 0-4 분획물이 추출물 0-4 분획물의 용액을 100 ng/㎖ 내지 1 g/㎖ 농도 범위로 사용될 때 실질적인 신경 보호를 제공하고 추출물 0-4 분획물이 추출물 0-4 분획물의 용액을 1 ㎍/㎖ 내지 1 mg/㎖농도 범위로 사용될 때 보다 큰 신경 보호를 제공함을 명시한다. 이에 따라, 액체 투약 형태 1 ml당 100 ng/㎖ 내지 1 mg/㎖의 추출물의 분획물을 함유한 액체 투약 형태는 투여되는 피검체에서 신경 보호를 제공할 것이다.
전신 용량의 추출물에 대해 인간 뇌에서의 직접적인 측정은 이루어지지 않았지만, 추출물의 분획물에서 하나 이상의 약리학적 활성 성분이 피검체에 투여될 때 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier)을 가로지르는 것으로 추정된다. PBI-05204로서 공지된 SCF 추출물 내에 함유되거나 순수한 화합물로서의 올레안드린은 설치류(마우스) 모델에서 혈액 뇌 장벽을 효과적으로 가로지르고 뇌로 진입하는 것으로 나타났다. 올레안드린이 인간 혈액 뇌 장벽과 관련하여 동일하게 작용할 것이라고 예상하는 것은 타당한 것이다.
이에 따라, 본 발명은 활성 손실을 최소화하고/거나, 활성 손실율을 감소시키고/거나, 활성 손실을 중단시키고/거나, 활성 손실의 개시를 늦추고/거나, 산소-결핍 및/또는 글루코즈-결핍 조건에 노출시킴으로써 야기되는 뉴런의 기능을 보호하기 위하여, 산소 결핍 및/또는 글루코즈-결핍 뉴런을 유효량의 네리움 종 또는 테베티아 종 추출물에 노출시킴으로써 산소 결핍 또는 산소-글루코즈 결핍에 의해 야기된 활성 손실에 대해 뉴런을 보호하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 유효량의 네리움 종 추출물 또는 테베티아 종 추출물의 분획물 또는 서브-분획물을 사용한다. 일부 구체예에서, 이러한 분획물 또는 서브-분획물은 추출물의 액체 크로마토그래피 분획화에 의해 제조된다. 일부 구체예에서, 분획물에는 강심 배당체가 배제되며, 다른 구체예에서, 분획물 또는 서브-분획물은 하나 이상의 강심 배당체, 특히 본원에 기술된 강심 배당체를 포함한다.
실시예 9는 알츠하이머 질환의 치료를 위한 추출물의 효능을 평가하기 위해 사용되는 시험관내 검정의 상세한 설명을 제공한다. 이러한 검정은 피질 각추 뉴런(cortical pyramidal neuron)의 APP/Aβ-유도 (APP: 아밀로이드 전구체 단백질) 퇴화에 대한 뇌 절편-기반 검정이다. 세크레타제 효소에 의한 분열 시에, APP는 Aβ 펩티드로 환원되는데, 이는 베타-아밀로이드 플라크 형성에서 원인 인자(causative factor)인 것으로 사료된다. Aβ 단백질은 베타-아밀로이드 형성과 관련이 있고 알츠하이머 질환에서 병인 인자가 아닌 경우에 특징(hallmark)인 것으로 사료된다. 바이오리틱스 트랜스펙션(Biolistic transfection)은 살아있는 마커, 예를 들어 YFP(마커 황색 형광 단백질)를 도입하고 뇌 절편에서 동일한 뉴런 집단에 질환 유전자 작제물(construct)을 도입하기 위해 사용된다. YFP는 APP 이형체와 공동-트랜스펙션되어 뇌 절편 제조 및 트랜스펙션 이후 3 내지 4일의 과정에 걸쳐 피질 각추 뉴런의 진행성 퇴화를 초래한다. 데이타(도 2a 내지 2c)는 네리움 종 SCF 추출물이 APP-트랜스펙션된 뇌 절편에 대해 농도-의존적 신경 보호를 제공하며, 이에 의해 BACE 억제제 약물, 즉 베타 세크레타제 억제제 약물에 의해 제공되는 것과 거의 동일한 수준 내지 동일한 수준으로 구조하는 것을 명시한다. 베타 세크레타제 효소는 APP 전구체 단백질을 독성 Aβ-단백질로 분열시킨다. 올레안드리-함유 SCF 추출물은 올레안드린 단독 보다 큰 신경 보호를 제공하는 것으로 나타난다. 도 2a 내지 2c의 데이타는 문헌에서의 수 개의 화합물 또는 치료 전략이 알츠하이머 질환의 대표적인 이러한 시험관내 검정에서 뉴런의 임의의 유의미한 보호를 나타낸다는 점에서 의미가 있다.
APP-WT 뇌 절편-기반 알츠하이머 검정은 협죽도의 SCF 추출물의 분획물을 사용하여 반복된다(실시예 11). 건강한 피질 뉴런의 수는 다양한 양의 SCF 추출물의 분획물 0-4A(0.01 내지 100 ㎍/㎖)의 존재 하에 APP/Aβ-유도 퇴화 후에 결정된다. 산소 및 글루코즈 결핍에 대한 노출은 내부 양성 대조군으로서 제공되며, 이는 뉴런에 뇌졸중-유사 매개손상을 형성시킨다. 음성 대조군은 단순히 OGD 치료 없이 또는 치료에 대한 노출 없이 상대적으로 건강한 뇌 절편 뉴런이다. 이러한 데이타는 도 6에 도시된 것으로서, 여기서 밝은 칼라의 막대는 0.05 신뢰성 수준으로 Dunnett 포스트 hoc 비교 이후 ANOVA에 의한 APP-WT 조건과 관련하여 유의미한 차이를 명시한다. 이러한 데이타는 0-4A 분획물이 임의의 강심 배당체를 함유하지 않더라도, 이러한 검정에서 신경 보호를 제공함을 명시한다.
테베티아 올레안더(Thevetia oleander)의 SCF 추출물의 분획물 0-4 (0-4A)는 tau4R 뇌 절편-기반 알츠하이머 검정(실시예 12)로 평가된다. 건강한 피질 뉴런의 수가 결정된다. 이러한 검정에서의 효능은 건강한 수 대 건강하지 않은 수의 상대적 총수, 및 다양한 양의 SCF 추출물의 분획물 0-4A의 존재((0.3 내지 100 g/㎖, 농도는 추출물의 중량에 의해 결정됨) 하에 퇴화된 뉴런의 백분율로서 또는 이를 기반으로 하여 규정된다. 이러한 실험에서 음성 대조군은 OGD에 노출되지 않는 뇌 절편으로 이루어져 있으며, 내부 양성 대조군으로서 뇌 절편이 OGD에 노출되지만 제공된 비분획된 협죽도 추출물로부터 유래된 분획물로 처리되지 않는다. 데이타는 도 7에 도시되어 있으며, 여기서 밝은 칼라의 막대는 0.05 신뢰성 수준으로 Dunnett 포스트 hoc 비교 이후 ANOVA에 의한 APP-WT 조건과 관련하여 유의미한 차이를 명시한다. 이러한 데이타는 0-4A 분획물이 임의의 강심 배당체를 함유하지 않더라도, 이러한 검정에서 신경 보호를 제공함을 명시한다.
이에 따라, 본 발명은 알츠하이머 질환에 의해 야기된 활성의 손실에 대해 뉴런을 보호하는 방법으로서, 알츠하이머 질환의 특징을 나타내는 뉴런을 유효량의 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물에 노출시켜 활성의 손실을 최소화하고/거나 활성 손실율을 감소시키고/거나 활성 손실을 정지시키고/거나 활성 손실의 개시를 늦추고/거나 알츠하이머 질환에 의해 야기된 뉴런의 중요한 기능화시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 유효량의 네리움 종 추출물 또는 테베티아 종 추출물의 분획물을 사용한다. 일부 구체예에서, 이러한 분획물은 추출물의 액체 크로마토그래피 분획화에 의해 제조된 것이다. 일부 구체예에서, 분획물에는 강심 배당체가 배제되어 있으며, 다른 구체예에서, 이러한 분획물은 하나 이상의 강심 배당체, 특히 본원에 기술된 강심 배당체를 포함한다.
실시예 10은 헌팅턴 질환의 치료를 위한 추출물의 효능을 평가하기 위해 사용되는 검정의 상세한 설명을 제공한다. 돌연변이 전기천공에 의해 htt 단백질은 피질 뉴런, 선조 뉴런 및 교질의 고밀도의 혼합된 공동-배양물로 도입된다. 선조 및 피질 뉴런은 상이한 칼라 형광 단백질로 트랜스펙션되어 공동-배양물에서 상이한 타입의 뉴런의 별도의 식별화를 촉진시킨다. 칼라 형광 단백질은 형광성이고, 적절한 파장의 광원으로 활성화 시에 칼라를 '방출'한다. 데이타(도 3a 내지 3d)는 올레안드린 및 협죽도의 SCF 추출물이 상당한 수의 생존 뉴런을 제공 측면에서 KW6002(아데노신 2a 수용체 길항제)에 비해 더욱 효과적임을 명시한다. 데이타는 또한, SCF 추출물이 올레안드린 단독에 비해 더욱 효과적임을 명시하는 것으로서, 이는 추출물이 헌팅턴 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는, 올레안드린과 이외에, 하나 이상의 치료학적으로 효과적인 제제를 추가로 포함함을 시사한다. 이러한 다른 제제는 올레안드린 또는 다른 강심 배당체와 함께 또는 이의 부재 하에 사용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 헌팅턴 질환에 의해 야기된 활성 손실에 대해 뉴런을 보호하는 방법으로서, 헌팅턴 질환의 특징을 나타내는 뉴런을 유효량의 올레안드린 또는 올레안드린-함유 추출물에 노출시켜, 활성 손실을 최소화시키고/거나, 활성의 손실을 최소화하고/거나 활성 손실율을 감소시키고/거나 활성 손실을 정지시키고/거나 활성 손실의 개시를 늦추고/거나 알츠하이머 질환에 의해 야기된 뉴런을 정상 기능화시키는 방법을 제공한다.
실시예 16은 뇌졸중 후 지연 기간의 완료 후에, 피검체에서 뇌졸중의 치료에서 추출물의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있는 대표적인 뇌-절편 검정을 상세히 기술한 것이다. 산소 글루코즈 결핍으로의 뇌-절편 검정은 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 그러나, 뇌 절편을 추출물로 예방적으로 치료하기 보다는, 이러한 것들은 0, 1, 2, 4, 및 6 시간의 지연 기간 후에 추출물로 처리된다. 데이타는 함유한 추출물이 뇌졸중 후 최대 1, 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6 시간의 지연 기간 동안 현저한 신경 보호를 제공하는데 효과적임을 입증한 것이다.
이에 따라, 본 발명은 피검체가 뇌줄중에 걸린 후에 피검체에 소정 용량의 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 투여함으로써 피검체의 뇌졸중을 치료하는 시간 지연 방법을 제공한다. 피검체가 뇌졸중에 걸린 후 허용 가능한 지연 기간 내에, 초기 용량의 추출물은 초기 투약 요법에 따라 투여된다. 이후에, 추출물로의 치료에 대한 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응의 타당성이 결정된다. 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 타당한 경우에, 추출물로의 처리는, 요망되는 임상적 종점이 달성될 때까지 필요한 경우에 지속된다. 대안적으로, 피검체의 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 초기 용량 및 초기 투약 용법에서 타당하지 않은 경우에, 용량은, 피검체에서 요망되는 임상적 반응 및/또는 치료 반응이 달성될 때까지 증가 또는 감소된다. 용량 증가 또는 감소는 투약 횟수 또는 용량 투약의 전체 기간의 변경과 같은, 투약 요법에서의 변경과 함께 수행될 수 있다.
본원의 뇌 절편 검정 중 일부는 뇌 조직이 OGD 이전에 추출물로 처리되는 조건 하에서 수행된다. 이러한 조건 하에서, 데이타는 뇌졸중에 의해 야기된 손상에 대해 신경 보호를 예방적으로 제공시에 추출물의 유용성을 수립한다.
임상의가 추출물, 또는 이의 조성물, 및 하나 이상의 다른 치료제로 신경학적 병태를 지닌 피검체를 치료하려 하며, 피검체가 갖는 특정의 신경학적 병태가 상기 하나 이상의 다른 치료제로의 치료에 대한 적어도 일부 치료학적으로 반응성인 것이 알려져 있는 경우에, 본 발명의 방법은 이를 필요로 하는 피검체에 치료학적 관련 용량의 추출물(또는 이의 분획물 또는 서브-분획물), 및 치료학적 관련 용량의 상기 하나 이상의 다른 치료제를 투여함을 포함하며, 여기서 추출물(또는 이의 분획물 또는 서브-분획물)은 제 1 투약 요법에 따라 투여되며, 하나 이상의 다른 치료제는 제 2 투약 요법에 따라 투여된다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 투약 요법은 동일하다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 투약 요법은 상이하다.
치료되는 신경학적 병태가 알츠하이머 질환인 경우에, 하나 이상의 다른 치료제는 BACE 억제제 또는 아세틸콜린에스테라제 억제제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 다른 치료제는 Namenda™ (메만틴 HCl), Aricept™ (도네페질), Razadyne™ (갈란타민), Exelon™ (리바스티그민), 및 Cognex™ (타크린)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
치료되는 신경학적 병태가 헌팅턴 질환인 경우에, 하나 이상의 다른 치료제는 천연 생성물, 항경련제, NMDA (n-메틸 d-아스파르테이트) 수용체 길항제, 및 소듐 채널 블로커로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 대표적인 제제는 비타민 E, 바클로펜 (CoQ10의 유도체), 라모트리긴 (항경련제), 레마세미드 (낮은 친화력 NMDA 길항제인 마취제), 및 리루졸 (Na 채널 블로커)을 포함한다. 이러한 제제 각각의 효능 그 자체는 낮은 것으로 사료된다[Mestre T. et al, Chochrane Database Systematic Reviews July 8, 2009; 8(3): CD006455] . 그러나, 추출물을 함유한 투약 형태를 이러한 다른 제제 중 하나 이상을 수용하는 피검체에 투여하는 것이 추출물이 존재하지 않는 이러한 제제의 투여와 비교하여 신경학적 질병을 지닌 피검체에 개선된 임상적 효과를 제공할 것으로 예상된다.
치료되는 신경학적 병태가 뇌졸중-매개 허혈성 뇌 손상(허혈성 뇌졸중)인 경우에, 문헌[Gutierrez M. et al. "Cerebral protection, brain repair, plasticity and cell therapy in ischemic stroke" Cerebrovasc. Dis. 2009; 27 Suppl 1: 177-186]에 기술된 치료학적 치료, 예를 들어 정맥내 혈전용해(intravenous thrombolysis)는 추출물 이외에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 다른 치료제는 알테플라제(Alteplase)(혈전용해제)와 같은 약물들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
하나 이상의 다른 치료제는 치료학적으로 효과적인 것으로 임상의-인식되는 용량으로 또는 임상의-인식되는 투약 요법에 따라, 또는 서브-치료학적으로 효과적인 것으로서 임상의-인식되는 용량으로 투여될 수 있다. 추출물 및 하나 이상의 다른 치료제의 조합물의 투여에 의해 제공된 임상적 이득 및/또는 치료학적 효과는 추가적이거나 상승적일 수 있으며, 이러한 이득 또는 효과 수준은 개개 추출물 및 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 조합물의 투여의 비교에 의해 결정된다. 하나 이상의 다른 치료제는 미국식품의약청(U.S.F.D.A.), 세계보건기구(W.H.,O), 유럽 의약청(E.M.E.A.), 치료약품 관리국 (TGA, 호주), 범미국보건기구 (PAHO), 의약품 의료 장치 안전청 (Medsafe, 뉴질랜드) 또는 다양한 전세계 건강 부서(Ministries of Health worldwide)에 의해 제시되거나 기술된 바와 같은 용량으로 및 투약 요법에 따라 투여될 수 있다.
강심 배당체가 본 발명에 따라 사용되는 경우에, Na,K-ATPase 결합 활성을 지니는 것으로 알려진 임의 강심 배당체일 수 있다. 강심 배당체는 혈액-뇌 장벽을 가로질 수 있고 투여 후 연장된 시간 동안 뇌 조직에 유지될 수 있다. 이와 관련하여, 강심 배당체는 조직 결합 및 결과적인 낮은 제거율로 인하여 강심 배당체의 투여 후에 적어도 8시간 동안 뇌에 유지될 것이다.
존재하는 경우에, 강심 배당체는 순수한 형태로, 또는 하나 이상의 다른 화합물과의 혼합물로서 존재할 수 있다. 강심 배당체는 추출물로서 존재할 수 있다.
추출물은 초임계 유체(SCF) 이산화탄소(CO2) 추출, 또는 화학적으로 개질된 형태의 이러한 추출물(에탄올을 포함하거나 SCF CO2 및 에탄올을 사용하여 제조된 추출물; 실시예 1)에 의해 제조될 수 있다. 추출물은 식물 물질을 유기 용매, 예를 들어 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 다른 이러한 용매로 추출함으로써 얻어질 수 있다. 추출물은 식물 물질로부터 얻어질 수 있다. 식물 물질은 네리움 종, 예를 들어 협죽도, 또는 테베티아 종, 예를 들어 테베티아 네리폴리아 또는 테베티아 페루비아나(Thevetia peruviana) (그밖에 노랑 협죽도로서 공지됨)로부터 얻어진 식물 물질일 수 있다. 추출 공정은 현재 계류 중인 미국가출원번호 60/653,210호(2005년 2월 15일 출원, 출원인 Addington), 또는 미국출원번호 11/340,016호(2006년 1월 26일 출원, 출원인 Addington), 미국출원번호 11/191,650호(2006년 7월 28일 출원, (새로운 미국특허번호 7,402,325호, 2008년 7월 22일 공표), 출원인 Addington), 또는 PCT 국제특허출원번호 PCT/US06/29061호(2006년 7월 26일 출원), 또는 문헌[Newman et al. (Mol. Interven. (2008), 8, 36-49]에 기술된 공정에 따라 또는 본원에 기술된 공정에 의해 제조된 협죽도 잎의 건조 분말 상에서 수행될 수 있으며, 이러한 문헌의 전체 설명은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 방법은 또한 네리움 종 또는 테베티아 종의 비분획된 추출물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "추출물"은 "비분획된 추출물" 또는 추출물의 부획물 또는 추출물의 분획물의 서브-분획물을 의미할 수 있다. 용어 "비분획된 추출물"은 일반적으로 식물 물질의 추출에 의해 얻어진 추출물을 의미하는데, 여기서 추출물은 추출물의 초기 제조 이후에, 분획화, 예를 들어 크로마토그래피 또는 용매 추출에 의한 개개 성분 또는 성분들의 그룹으로의 분획화 또는 분리로 처리되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "올레안드린"은 달리 명시되지 않는 한 모든 공지된 형태의 올레안드린을 의미한다. 올레안드린은 라세믹, 광학적으로 순수하거나 광학적으로 풍부한 형태로 존재할 수 있다. 협죽도 식물 물질은 예를 들어, 상업적 식물 공급업체, 예를 들어 Aldridge Nursery(Atascosa, Texas)로부터 얻어질 수 있다.
비분획된 추출물은 강심 배당체-함유 식물 물질, 예를 들어 네리움 종 또는 테베티아 종 함유 식물 물질의 개질된(예를 들어, 에탄올) 또는 비개질된 초임계 유체 추출에 의해 얻어질 수 있다. 초임계 유체 추출물은 피검체에 투여될 때, 추출물의 치료학적 효능에 기여하는 식물 물질로부터 추출된 하나 이상의 약리학적 활성제를 포함할 수 있다. 두 개 이상의 이러한 제제가 존재할 때, 이러한 것들은 추출물의 치료학적 효능에 추가적이거나 상승적으로 기여할 수 있다.
비분획된 추출물은 다양한 상이한 공정들에 의해 제조될 수 있다. 추출물은 상기와 같이 또는 문헌[Dr. Huseyin Ziya Ozel (미국특허번호 5,135,745)]에 의해 개발된 공정에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 문헌은 물에서의 식물의 추출물의 제조를 위한 고온수 추출 절차를 기술한 것이다. 이에 따르면, 수성 추출물은 2KD 내지 30KD로 다양한 분자량을 갖는 여러 다당류, 올레안드린 및 올레안드리게닌, 오도로사이드 및 네리탈로사이드를 함유한다. 이에 따르면, 다당류는 산성 호모폴리갈락투로난 또는 아라비노갈락투로난을 포함한다. 미국특허번호 5,869,060호(Selvaraj et al.)의 실시예 2에는 네리움 종의 고온수 추출물, 및 이의 생산 방법이 기재되어 있다. 얻어진 추출물은 이후에 동결건조되어 분말을 형성할 수 있다. 미국특허번호 6,565,897호(미국사전등록공개번호 20020114852호 및 PCT 국제공개번호 WO 2000/016793호(Selvaraj et al.))에는 실질적으로 멸균 추출물의 제조를 위한 고온수 추출 공정이 기재되어 있다. 문헌[Erdemoglu et al. (J. Ethnopharmacol. (2003) Nov. 89(1), 123-129)]에는 항침해 및 항염증 활성을 기초로 한, 협죽도를 포함하는 식물의 수성 및 에탄올성 추출물의 비교 결과가 기재되어 있다. 협죽도의 유기 용매 추출물은 문헌[Adome et al. (Afr. Health Sci. (2003) Aug. 3(2), 77-86; ethanolic extract), el-Shazly et al. (J. Egypt Soc. Parasitol. (1996), Aug. 26(2), 461-473; ethanolic extract), Begum et al. (Phytochemistry (1999) Feb. 50(3), 435-438; methanolic extract), Zia et al. (J. Ethnolpharmacol. (1995) Nov. 49(1), 33-39; methanolic extract), and Vlasenko et al. (Farmatsiia. (1972) Sept.-Oct. 21(5), 46-47; alcoholic extract)]에 기재되어 있다. 미국사전등록특허출원공개번호 20040247660호(Singh et al.)에는 암의 치료에서 사용하기 위한 올레안드린의 단백질 안정화된 리포좀 제형의 제조가 기재되어 있다. 미국사전등록 특허출원공개번호 20050026849호(Singh et al.)에는 사이클로덱스트린을 함유한 올레안드린의 수용성 제형이 기재되어 있다. 미국사전등록 특허출원공개번호 20040082521호(Singh et al.)에는 고온수 추출물로부터의 올레안드린의 단백질 안정화된 나노입자의 제조가 기재되어 있다.
SCF 추출은 식물 물질로부터 요망되는 화합물(들)의 추출을 향상시키기 위해 알코올, 예를 들어 에탄올과 같은 초임계 유체에서 개질제의 존재 하에 수행될 수 있다. (PCT/US06/29061(2005년 7월 26일 출원); US 7,402,325; 및 USSN 12/019435(2008년 1월 24일 출원) 또는 문헌[Newman et al. (Mol. Interven. (2008), 8, 36-49), 이러한 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨]. 개질제는 일반적으로 초임계 유체와 추출되는 화합물 간의 휘발성을 가지며, 이러한 것들은 초임계 유체와 혼화 가능하여야 한다. 일부 구체예에서, 개질제는 주변 조건에서 액체이다. 일 예로서 그리고 제한되지 않게, 개질제는 에탄올, 메탄올, 프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 메틸렌 클로라이드 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
추출물이 본원에 포함된 검정에서 효능에 의해 결정되는 바와 같이 이들의 상대적 성능에 대해 차이가 나는 것이 가능하다. 그렇기는 하지만, 하나 이상의 약리학적 활성제가 치료학적 관련 용량을 제조할 수 있게 하기 위해 추출물 중에 충분히 높은 양 또는 농도로 존재하는 경우에, 추출물은 본 발명의 일부로 여겨진다.
실시예 13은 SCF 추출물을 5개의 상이한 분획물(O-H, 0-2, 0-3, 0-4 및 0-5)로 분획시키는 크로마토그래프 방법을 기술한 것이다. 분획물은 비분획된 추출물을 물로 평형화된 ODS-실리카겔 컬럼 상에 로딩한 후에 컬럼을 통해 메탄올 함량이 다양한(30%, 55%, 80% 및 100%) 수성 이동상의 여러 부분을 순차적으로 통과시킴으로써 추출물의 상이한 분획물을 용리시키고, 개개의 용리액(분획물)을 합하고, 감압 하에 용매 증발에 의해 용리액을 농축시켜 용매를 제거하고, 이에 의해 분획물 0-1 (또는 O-H), 0-2, 0-3, 0-4 및 0-5를 제공함으로써 제조된다. 분획물은 실시예 14에 따라 분석되었으며, 강심 배당체 및 다른 성분들의 측면에서 이들의 조성은 강심 배당체에 접촉하는(그리고 이에 따라 이를 검출하기 위해 유용한) 민감성 염료 지시제를 이용한 박막 크로마토그래피에 의해 결정된다. 또한, 이러한 분획물 중에 강심 배당체의 존재 또는 부재는 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분광법 또는 DAD-UV 검출을 이용하여 분석된다.
추출물의 분획물 또는 서브-분획물은 ODS-실리카 겔이 아닌 다른 정지상을 이용하는 액체 크로마토그래피에 의해 및/또는 물이 아닌 이동상을 이용함으로써 분석될 수 있다. 대표적인 적합한 정지상은 본원에서 추가로 기술된다.
도 8a 내지 8d는 실시예 13의 분획물 Fr-O-1, Fr-O-2, Fr-03 및 Fr-O-4의 HPLC의 분석 후에 얻어진 크로마토그램을 도시한 것이다. 상응하는 외부 기준 샘플을 사용하여 얻어진 잔류 시간의 비교를 기초로 하여, (Fr-O-2 및 Fr-O-3) 분획물이 올레안드린 유도체 (강심 배당체), 올레안드린 (Rt = 8.3 분), 및 다른 식별되지 않은 성분들을 함유한다는 것이 결정되었다. 본래 미분획된 SCF 추출물에서 발견된 다수의 올레안드린은 주로 Fr-O-3 분획물에서 있는 것이다. Fr-O-4는 정량화 가능한 양의 임의 강심 배당체를 함유하지 않는다. 이에 따라, 분획물의 조성은 올레안드린, 강심 배당체 및 다른 식별되지 않은 성분들의 함량에 따라 상이하다.
Figure 112013055030618-pct00001
이러한 분획물들은 이후에 각각에 의해 제공된 신경 보호 수준을 결정하기 위하여 실시예 15에서 상세히 기술된 신경 보호 뇌 절편-기반 검정으로 처리된다. 데이타는 도 4a 내지 4e에 도시되어 있는데, 여기서 SCF 추출물(23 ㎍/㎖)을 함유한 수용액의 신경보호 활성은 0.03, 0.3 또는 3 ㎍/㎖의 다른 성분(들)을 함유한 다른 용액의 활성과 비교된다. 모든 분획물들은 계량되고, 동일한 물질 중량 기준으로 비교된다. 올레안드린 또는 강심 배당체를 함유한 분획물(본원에 기술된 것임), 또는 올레안드린 또는 강심 배당체를 함유하지 않은 일부 분획물이 신경보호를 제공할 수 있는 것으로 결정되었다.
뇌 절편-기반 뇌졸중 검정(실시예 15)에서 SCF 추출물의 분획물 0-4의 성능은 비분획된 SCF 추출물 (PBI-05204)의 성능과 비교되었다. 다양한 양(0.03 내지 300 ㎍/㎖)의 0-4 분획물의 성능은 고정된 양(23 ㎍의 올레안드린 ㎖)의 추출물과 비교되었다. 데이타(도 5)는 협죽도의 SCF 추출물의 분획물 0-4가 올레안드린 또는 검출 가능한 양의 임의의 다른 강심 배당체를 함유하지 않아도, 이의 효능을 유지한다는 것을 명확하게 명시한다. 도 5에서 밝은 칼라의 막대는 0.05 신뢰도 수준에서 Dunnett의 post hoc 비교 이후에 ANOVA에 의해 뇌졸중 조건(0으로 셋팅됨)에 대해 유의미한 차이를 명시한다.
이에 따라, 본 발명은 네리움 종 또는 테베티아 종 추출물의 복수의 치료학적 분획물로서, 상기 분획물들은 a) 하나 이상의 약리학적 활성제를 포함하고 올레안드린 및 다른 강심 배당체를 배제하되, 신경 보호를 제공하는 분획물; b) 하나 이상의 약리학적 활성제, 올레안드린 및 하나 이상의 강심 배당체를 포함하되, 신경 보호를 제공하는 분획물; 및 c) 하나 이상의 다른 약리학적 활성제(상기 a)와는 상이함)를 포함하고 올레안드린 및 다른 강심 배당체를 배제하되, 신경 보호를 제공하는 상이한 분획물로 이루어진 군으로부터 선택된 분획물을 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 치료학적으로 유효한 이의 분획물을 제공하기 위하여 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 분획하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 a) 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 제공하고, b) 상기 추출물을 분획하여 추출물의 두 개 이상의 상이한 분획물을 제공하되, 제 1 추출물이 강심 배당체가 아닌 하나 이상의 약리학적 활성제를 포함하고 강심 배당체를 배제하며, 제 2 추출물이 강심 배당체가 아닌 하나 이상의 약리학적 활성제, 및 하나 이상의 강심 배당체를 포함하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 분획화는 정지상 및 이동상과 함께 액체 크로마토그래피에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, 정지상은 "역상" 수지, 크로마토그래피에서 사용하기 위한 충분한 패킹(packing)을 달성하는 불활성 비-극성 물질, 예를 들어 실리카, 시아노-결합된 실리카에 결합된 짧은 (C8 내지 C18) 탄소 사슬 또는 페닐 결합된 실리카로 이루어진 수지, "정상 상" 수지, 예를 들어 시아노 및 아미노 작용기를 지닌 유기 부분 및 실리카로 이루어진 군으로부터 선택된 매질을 포함한다. 일부 구체예에서, 이동상은 물, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 수계 완충 용액 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 포함한다. 일부 구체예에서, 이동상은 수성 메탄올을 포함하며, 여기서 메탄올의 함량은 약 30% 내지 최대 100%로 순차적으로 증가되며, 정지상은 ODS-실리카 겔이다. 크로마토그래피는 구배 용리 이동상, 단계별 용리 이동상 또는 고정 조성 이동상을 이용하여 수행될 수 있다.
추출물의 분획물은 서브-분획되어 추출물의 분획물의 두 개 이상의 상이한 서브-분획물을 제공할 수 있다. 서브-분획화는 분획물의 액체 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 액체 크로마토그래피를 위한 적합한 정지상은 실리카 겔 또는 다른 수지, 예를 들어 이온교환 매질, 알루미나, 또는 비결합된 C18 물질을 포함할 수 있으며, 액체 크로마토그래피를 위한 적합한 이동상은 극성이 상이한, 즉 낮은 극성의 유기 용매 및 보다 높은 극성의 유기 용매의, 두 개 이상의 유기 용매의 조합물을 포함한다. 적합한 극성 유기 용매는 테트라하이드로푸란, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 아세톤, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, n-부탄올, 이소프로판올, n-프로판올, 에탄올, 메탄올, 아세트산 및 물일 수 있다. 적합한 비-극성 유기 용매는 에틸 아세테이트 펜탄, 사이클로펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 1,4-디옥산, 클로로포름 또는 디에틸 에테르일 수 있다.
완충 용액에서 사용하기 위한 완충제는 액체 크로마토그래피의 분야에서 이미 공지된 임의 완충제를 포함한다. 대표적인 완충제는 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 포르메이트, 포스페이트, 트리플루오로아세트산, 클로로아세테이트, 설포네이트, 알킬 아민, TAE, TBE, 암모니아, BuffAR, 카보네이트, HEPES, MES, 티오시아네이트, CAPS, CHES, 구아니딘, MOPS, PIPES, TRIS, 설페이트, 하이드록사이드, 알칼리 금속 할라이드, 트리신, 또는 아미노산 이온 또는 이들의 조합물을 함유하는 완충제를 포함한다. 하나 이상의 이온-페어링 시약(ion-pairing agent) 및/또는 하나 이상의 유기 개질제가 또한 이동상에 포함될 수 있다.
추출물을 분획하기 위해 사용될 수 있는 다른 타입의 크로마토그래피는 크기 배제 크로마토그래피, 정상 상 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 또한, 상이한 타입의 크로마토그래피의 결합된 형태를 사용하는 것이 가능하다. 정지상은 역상, 크기 배제, 이온 교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 위해 사용되는 두 개 이상의 상이한 매질의 조합물, 예를 들어 역상 정지상 및 크기 배제 정지상의 조합, 역상 정지상 및 이온 교환 정지상의 조합, 또는 다른 이러한 조합인 매질, 또는 두 개, 세 개, 또는 네 개의 상이한 정지상 매질을 포함할 수 있다. 정지상 매질은 다공성, 비-다공성, 표면 다공성, 확산 다공성 또는 완전 다공성일 수 있다.
본 발명은 추출물을 분획하는 방법으로서, a) 네리움 종 또는 테베티아 종로부터 얻어진 추출물을 제공하고, b) 추출물을 정지상으로서 ODS-실리카 겔 및 이동상으로 수성 메탄올과 함께, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분획하여 적어도 두 개의 상이한 분획물을 제공하되, 제 1 분획물이 적어도 하나의 강심 배당체 및 적어도 하나의 비-강심 배당체 약리학적 활성제를 포함하며, 다른 분획물이 강심 배당체를 배제하고 적어도 하나의 비-강심 배당체 약리학적 활성제를 포함하며, c1) b)의 다른 분획물을 정지상으로서 실리카 겔, 및 이동상으로서 극성이 상이한 적어도 두 개의 유기 용매의 혼합물과 함께 컬럼 크로마토그래피에 의해 서브-분획하여, 적어도 두 개의 상이한 서브-분획물을 제공하되, 서브-분획물은 하나 이상의 스테로이드 및 하나 이상의 트리테르펜을 포함하며, 다른 서브-분획물은 두 개 이상의 상이한 트리테르펜을 포함하고 스테로이드를 배제하며, 여기서 서브-분획물은 강심 배당체를 배제하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 이러한 방법은 c2) b)의 제 1 분획물을 정지상으로 실리카 겔 및 이동상으로서 극성이 상이한 적어도 두 개의 유기 용매의 혼합물과 함께 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 적어도 두 개의 상이한 서브-분획물을 제공하되, 한 서브-분획물은 하나 이상의 스테로이드 및 하나 이상의 트리테르펜을 포함하며, 다른 서브-분획물은 두 개 이상의 상이한 트리테르펜을 포함하고 스테로이드를 배제하며, 여기서 상기 서브-분획물 중 하나 또는 둘 모두는 강심 배당체를 추가로 포함하는 것을 추가로 포함한다.
추출물, 또는 분획물, 또는 이의 서브-분획물은 임의 적합한 약제학적으로 허용되는 투약 형태로 제형화될 수 있다. 비경구, 귀(otic), 눈, 코, 흡입성, 볼, 설하, 장, 국소, 구강, 경구, 및 주사 가능한 투약 형태가 특히 유용하다. 특정 투약 형태는 고체 또는 액체 투약 형태를 포함한다. 대표적인 적합한 투약 형태는 정제, 캡슐, 환제, 당의정, 트로키(troche), 사세(sache), 용액, 현탁액, 분산물, 바이알, 백(bag), 병(bottle), 주사 가능한 액체, i.v.(정맥내), i.m.(근육내) 또는 i.p.(복막내) 투여 가능한 액체 투약 형태 및 약제학의 당업자에게 알려진 다른 이러한 투약 형태를 포함한다.
본 발명의 용량에 도입되는 추출물, 또는 이의 분획물 또는 이의 서브-분획물의 양은 적어도 하나 이상의 투약 형태일 것이고, 약학의 공지된 원리에 따라 선택될 수 있다. 치료제 화합물의 유효량 또는 치료학적 관련 양이 상세하게 고려된다. 용어 "유효량"은 예를 들어 제약과 관련하여, 약제학적 유효량이 고려되는 것으로 이해된다. 약제학적 유효량은 요망되거나 바람직한 치료 반응을 위해 충분한 활성 성분의 양 또는 수량, 또는 다시 말해서, 환자에게 투여될 때, 주목할 만한 생물학적 반응을 나타내는데 충분한 양이다. 주목할 만한 생물학적 반응은 단일 또는 다수 용량의 활성 성분의 투여 결과로서 발생할 수 있다. 용량은 하나 이상의 투약 형태를 포함할 수 있다. 임의 환자에 대한 특정 용량 수준은 치료될 증상(indication), 이러한 증상의 중증도, 환자 건강, 나이, 성별, 체중, 식이요법, 약리학적 반응, 이용되는 특정 투약 형태, 및 다른 이러한 인자를 포함하는 다양한 인자에 따를 것으로 이해될 것이다.
경구 투여를 위한 요망되는 용량은 최대 5 투약 형태이지만, 적게는 1회 그리고 많게는 10회의 투약 형태가 단일 용량으로서 투여될 수 있다. 대표적인 투약 형태는 용량 당 총 0.1 내지 500 mg (1 내지 10 용량 수준)에 대하여, 투약 형태 당 0.1 내지 5 mg의 SCF 추출물을 함유한다. 용량은 피검체에서 특정 치료 반응 또는 임상적 이득을 달성하기 위하여 사전결정되고/거나 조정될 수 있는 투약 요법에 따라 투여될 것이다.
포유동물의 치료에서 사용하기 위하여, 추출물, 또는 이의 분획물 또는 이의 서브-분획물이 투역 형태에 포함될 수 있다. 투약 형태의 일부 구체예는 장용 코팅되지 않고 추출물의 충전물을 0.5 내지 1 시간 또는 그 미만 내에 방출시킨다. 투약 형태의 일부 구체예는 장용 코팅되고 위의 다운스트림, 예를 들어 공장, 회장, 작은 창자 및/또는 큰 창자(결장)으로부터 추출물의 충전물을 방출시킨다. 장용 코팅된 투약 형태는 경구 투여 후에 1 내지 10 시간 내에 전신 순환으로 추출물을 방출시킬 것이다.
본원의 화합물은 본 발명의 제형에서 하나 이상의 기능을 지닌다는 것이 주지되어야 한다. 예를 들어, 화합물은 계면활성제 및 수혼화성 용매 둘 모두로서, 또는 계면활성제 수불혼화성 용매 둘 모두로서 제공될 것이다.
액체 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 액체 담체를 포함할 수 있다. 액체 담체는 수성, 비수성, 극성, 비극성 및/또는 유기 담체일 수 있다. 액체 담체는 일 예로서 그리고 제한되지 않게, 수혼화성 용매, 수불혼화성 용매, 물, 완충제, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "수용성 용매" 또는 "수혼화성 용매"는 교호적으로 사용되는 것으로서, 물과 2상 혼합물을 형성하지 않거나 액체 상의 분리 없이 적어도 5%의 용매를 함유한 수성 용매 혼합물을 제공하기 위해 수중에서 충분히 가용성인 유기 액체를 지칭한다. 용매는 인간 또는 동물에 투여하기에 적합하다. 대표적인 수용성 용매는 일 예로서 그리고 비제한적으로, PEG (폴리(에틸렌 글리콜)), PEG 400 (약 400의 대략적인 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)), 에탄올, 아세톤, 알칸올, 알코올, 에테르, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 트리아세틴, 폴리(프로필렌 글리콜), PVP (폴리(비닐 피롤리돈)), 디메틸설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 피리딘, 프로판올, N-메틸아세트아미드, 부탄올, soluphor (2-피롤리돈), pharmasolve (N-메틸-2-피롤리돈)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "수불용성 용매" 또는 "수불혼화성 용매"는 교호적으로 사용되는 것으로서, 물과의 2상 혼합물을 형성하거나 수중 용매의 농도가 5%를 초과할 때 상 분리를 제공하는 유기 액체를 지칭한다. 용매는 인간 또는 동물에 투여하기에 적합하다. 대표적인 수불용성 용매는 일 예로서 그리고 비제한적으로, 매질/장쇄 트리글리세라이드, 오일, 캐스터 오일, 옥수수 오일, 비타민 E, 비타민 E 유도체, 올레산, 지방산, 올리브유, softisan 645 (디글리세릴 카프릴레이트/카프레이트/스테아레이트/하이드록시 스테아레이트 아디페이트), 미글리올, captex (Captex 350: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/라우레이트 트리글리세리드; Captex 355: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 트리글리세리드; Captex 355 EP / NF: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 중쇄 트리글리세리드)를 포함한다.
적합한 용매는 문헌["International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guidance for industry Q3C Impurities: Residual Solvents " (1997)]에 기술되어 있는데, 이는 잔류 용매의 양이 약제에서 안전한 지를 고려하는 것에 대해 권고된 것이다. 대표적인 용매는 클래스 2 또는 클래스 3 용매로서 기술된다. 클래스 3 용매는, 예를 들어 아세트산, 아세톤, 아니솔, 1-부탄올, 2-부탄올, 부틸 아세테이트, 3차-부틸메틸 에테르, 쿠멘, 에탄올, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 에틸 포르메이트, 포름산, 헵탄, 이소부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 메틸 아세테이트, 메틸-1-부탄올, 메틸에틸 케톤, 메틸이소부틸 케톤, 2-메틸-1-프로판올, 펜탄, 1-펜탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 또는 프로필 아세테이트를 포함한다.
본 발명에서 수불혼화성 용매로서 사용될 수 있는 다른 물질은 Captex 100: 프로필렌 글리콜 디카프레이트; Captex 200: 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/ 디카프레이트; Captex 200 P: 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/ 디카프레이트; 프로필렌 글리콜 디카프릴로카프레이트; Captex 300: 글리세릴 트리카프릴레이트/ 카프레이트; Captex 300 EP / NF: 글리세릴 트리카프릴레이트/ 카프레이트 중쇄 트리글리세리드; Captex 350: 글리세릴 트리카프릴레이트/ 카프레이트/ Laurate; Captex 355: 글리세릴 트리카프릴레이트/ 카프레이트; Captex 355 EP / NF: 글리세릴 트리카프릴레이트/ 카프레이트 중쇄 트리글리세리드; Captex 500: 트리아세틴; Captex 500 P: 트리아세틴 (약제 등급); Captex 800: 프로필렌 글리콜 디(2-에틸헥사노에이트); Captex 810 D: 글리세릴 트리카프릴레이트/ 카프레이트/ 리놀레이트; Captex 1000: 글리세릴 트리카프레이트; Captex CA: 중쇄 트리글리세리드; Captex MCT-170: 중쇄 트리글리세리드; Capmul GMO: 글리세릴 모노올레이트; Capmul GMO-50 EP/NF: 글리세릴 모노올레이트; Capmul MCM: 중쇄 모노- 및 디글리세리드; Capmul MCM C8: 글리세릴 모노카프릴레이트; Capmul MCM CIO: 글리세릴 모노카프레이트; Capmul PG-8: 프로필렌 글리콜 모노카프릴레이트; Capmul PG-12: 프로필렌 글리콜 모노라우레이트; Caprol 10G10O: 데카글리세롤 데카올레이트; Caprol 3GO: 트리글리세롤 모노올레이트; Caprol ET: 혼합된 지방산의 폴리글리세롤 에스테르; Caprol MPGO: 헥사글리세롤 디올레이트; Caprol PGE 860: 데카글리세롤 모노-, 디올레이트를 포함한다.
본원에서 사용되는 "계면활성제"는 극성 또는 하전된 친수성 부분 뿐만 아니라 비극성 소수성(친유성) 부분을 포함하는 화합물을 지칭하는 것으로서, 계면활성제는 양쪽성이다. 용어 계면활성제는 화합물들 중 하나 또는 혼합물을 지칭할 수 있다. 계면활성제는 가용화제, 에멀젼화제, 또는 분산제일 수 있다. 계면활성제는 친수성 또는 소수성일 수 있다.
친수성 계면활성제는 약제 조성물에서 사용하기에 적합한 임의 친수성 계면활성제일 수 있다. 이러한 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성, 또는 비이온성일 수 있지만, 비이온성 친수성 계면활성제가 현재 바람직하다. 상기에서 논의된 바와 같이, 이러한 비이온성 친수성 계면활성제는 일반적으로 약 10 보다 큰 HLB 값을 가질 것이다. 친수성 계면활성제의 혼합물이 또한 본 발명의 범위 내에 속한다.
유사하게, 소수성 계면활성제는 약제 조성물에서 사용하기에 적합한 임의 소수성 계면활성제일 수 있다. 일반적으로, 적합한 소수성 계면활성제는 약 10 미만의 HLB 값을 가질 것이다. 소수성 계면활성제의 혼합물이 또한 본 발명의 범위 내에 속한다.
추가의 적합한 가용화제의 예는 알코올 및 폴리올, 예를 들어 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 벤질 알코올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄디올 및 이의 이성질체, 글리세롤, 펜타에리스리톨, 소르비톨, 만니톨, 트란스쿠톨, 디메틸 이소소르비드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐알코올, 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈 및 다른 셀룰로즈 유도체, 사이클로덱스트린 및 사이클로덱스트린 유도체; 약 200 내지 약 6000의 평균분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜의 에테르, 예를 들어 테트라하이드로푸르푸릴 알코올 PEG 에테르 (BASF로부터 상표명 Tetraglycol로 상업적으로 입수 가능한, 글리코푸롤), 또는 메톡시 PEG (Union Carbide); 아미드, 예를 들어 2-피롤리돈, 2-피페리돈, 카프로락탐, N-알킬피롤리돈, N-하이드록시알킬피롤리돈, N-알킬피페리돈, N-알킬카프로락탐, 디메틸아세트아미드, 및 폴리비닐피롤리돈; 에테르, 예를 들어 에틸 프로피오네이트, 트리부틸시트레이트, 아세틸 트리에틸시트레이트, 아세틸 트리부틸 시트레이트, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레이트, 에틸 카프릴레이트, 에틸 부티레이트, 트리아세틴, 프로필렌 글리콜 모노아세테이트, 프로필렌 글리콜 디아세테이트, 카프로락톤 및 이의 이성질체, 발레로락톤 및 이의 이성지레ㅊ, 부티로락톤 및 이의 이성질체; 및 당해 분야에 공지된 다른 가용화제, 예를 들어 디메틸 아세트아미드, 디메틸 이소소르비드 (Arlasolve DMI (ICI)), N-메틸 피롤리돈 (Pharmasolve (ISP)), 모노옥타노인, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (Gattefosse로부터 상표명 Transcutol로 입수 가능), 및 물을 포함한다. 가용화제의 혼합물이 또한 본 발명의 범위 내에 속한다.
기술된 것을 제외하고, 본원에서 언급된 화합물들은 표준 상업 공급처로부터 용이하게 입수 가능하다.
투명한 액체 조성물은 육안에 대해 시각적으로 투명한데, 이는 조성물의 전체 중량을 기준으로 하여, 5 중량% 미만, 3 중량% 미만, 또는 1 중량% 미만의 현탁된 고형물을 함유할 것이다.
필수적이지는 않지만, 본 발명의 조성물 또는 키트는 킬레이트화 제, 보존제, 항산화제, 흡착제, 산성화제, 알칼리화제, 소포제, 완충제, 착색제, 전해질, 염, 안정화제, 장성 조절제(tonicity modifier), 희석제, 다른 약제학적 부형제, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항산화제"는 산화를 억제하는 시약을 의미하는 것으로서 산화 공정에 의한 제조물의 열화를 방지하는데 사용된다. 이러한 화합물의 비제한적인 예에는 아스코르브산, 아스코르브산 팔미테이트, 비타민 E, 비타민 E 유도체, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 하이포아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 소듐 아스코르베이트, 소듐 비설파이트, 소듐 포름알데히드 설폭실레이트, 소듐 메탈비설파이트(sodium metalbisulfite) 및 당업계에 공지된 다른 물질이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 킬레이트화제는 용액 내에서 금속 이온을 킬레이트화시키는 화합물을 의미한다. 대표적인 킬레이트화제는 EDTA(테트라소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트), DPTA(펜타소듐 디에틸렌트리아민펜타아세테이트), HEDTA(N-(하이드록시에틸)-에틸렌디아민트리아세트산의 트리소듐 염), NTA(트리소듐 니트릴로트리아세테이트), 디소듐 에탄올디글리신(Na2EDG), 소듐 디에탄올글리신(DEGNa), 시트르산 및 당업계에 공지된 다른 화합물이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "흡착제"는 물리적 또는 화학적(화학흡착) 수단에 의해 다른 분자를 표면에 붙들어 둘 수 있는 화학제를 의미한다. 이러한 화합물의 비제한적인 예에는 분말화된 또는 활성화된 목탄 및 당업계에 공지된 다른 물질이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "알칼리화제"는 알칼리성 매질을 제공하는 화합물을 의미한다. 이러한 화합물의 비제한적인 예에는 암모니아 용액, 암모늄 카보네이트, 디에탄올아민, 모노에탄올아민, 칼륨 하이드록사이드, 소듐 보레이트, 소듐 카보네이트, 소듐 비카보네이트, 소듐 하이드록사이드, 트리에탄올아민, 및 트롤아민, 및 당업게에 공지된 다른 화합물이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "산성화제"는 산성 매질을 제공하는데 사용되는 화합물을 의미한다. 이러한 화합물의 비제한적인 예에는 아세트산, 아미노산, 시트르산, 푸마르산 및 다른 알파 하이드록시산, 염산, 아스코르브산 및, 질산 및 당업계에 공지된 다른 화합물이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "소포제"는 충전 조성물의 표면에 형성되는 발포의 양을 줄이거나 방지하는 화합물을 의미한다. 적합한 소포제의 비제한적인 예에는 디메티콘, SIMETHICONE, 옥토시놀 및 당업계에 공지된 다른 물질이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "완충제"는 산 또는 알칼리로 희석시 또는 이들을 첨가시 pH 변화를 견디게 하는 화합물을 의미한다. 이러한 화합물의 비제한적인 예에는 메타인산 소듐, 인산 칼륨, 일염기 아세트산 소듐 및 시트산 소듐 무수물 및 탈수물(dehydrate) 및 당업계에 공지된 다른 물질이 포함된다.
본원에서 사용되는 "희석제" 또는 "충전제"란 정제 및 캡슐 제조시 목적하는 부피, 흐름 특성 및 압축 특성을 나타내게 하는 충전제로서 사용되는 불활성 물질을 의미한다. 이러한 화합물의 비제한적인 예에는 이염기성 인산 칼슘, 카올린, 락토오즈, 슈크로즈, 만니톨, 미세결정성 셀룰로즈, 분말 셀룰로즈, 침강 탄산 소듐, 소르비톨 및 전분 및 당업계에 공지된 다른 물질이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "보존제"는 미생물의 성장을 방지하는데 사용되는 화합물을 의미한다. 이러한 화합물의 비제한적인 예에는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 페닐머큐릭 니트레이트, 페닐머큐릭 아세테이트, 티메로살, 메타크레솔, 미리스틸감마 피콜리늄 클로라이드, 벤조산 칼륨, 소르브산 칼륨, 벤조산 소듐, 프로피온산 소듐, 소르브산, 티몰, 및 메틸, 에틸, 프로필, 또는 부틸 파라벤 및 당업계에 공지된 다른 물질이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "착색제"는 약제학적 제제에 색을 부여하는데 사용되는 화합물을 의미한다. 이러한 화합물의 비제한적인 예에는 FD&C Red No.3, FD&C Red No.20, FD&C Yellow No.6, FD&C Blue No.2, FD&C Green No.5, FD&C Orange No.5, FD&C Red No.8, 카라멜 및 산화철(흑, 적, 황), 및 다른 FD&C 염료 및 천연 착색제, 예를 들면, 포도 스킨 추출물, 비트 레드 파우더, 베타 카로틴, 아나토, 카르민, 투르메릭, 파프리카, 이들의 조합 및 당업계에 공지된 다른 물질이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "안정화제"는 화학제의 치료 활성을 감소시킬 수 있는 물리적, 화학적 또는 생화학적 공정에 대해 활성제를 안정시키는데 사용되는 화합물을 의미한다. 적합한 안정화제의 비제한적인 예에는 알부민, 시알산, 크레아티닌, 글리신 및 다른 아미노산, 니아신아미드, 소듐 아세틸트립토포네이트, 산화 아연, 수크로즈, 글루코스, 락토오즈, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 카프릴산 소듐 및 소듐 사카린 및 당업계에 공지된 다른 물질이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "장성 조절제"는 액체 제형의 장성을 조정하는데 사용되는 화합물을 의미한다. 적합한 장성 조절제의 예에는 글리세린, 락토오즈, 만니톨, 덱스트로즈, 염화 소듐, 황산 소듐, 소르비톨, 트레할로즈 및 당업계에 공지된 다른 물질이 포함된다.
본 발명의 조성물은 또한 오일, 예를 들어 불휘발성유, 땅콩유, 참기름, 면실유, 옥수수 오일 및 올리브유; 올레산, 스테아르산 및 이소스테아르산과 같은 지방산; 및 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 지방산 글리세라이드 및 아세틸화된 지방산 글리세라이드와 같은 지방산 에스테르를 포함할 수 있다. 조성물은 또한 에탄올, 이소프로판올, 헥사데실 알코올, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜과 같은 알코올, 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올과 같은 글리세롤 케탈, 폴리(에틸렌 글리콜)450과 같은 에테르, 광유 및 바셀린과 같은 석유 탄화수소, 물, 약제학적으로 적합한 계면활성제, 현탁제 또는 유화제, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
약제 제형 분야에서 사용되는 화합물은 일반적으로 다양한 기능 또는 목적에 맞는다는 것을 이해해야 한다. 이와 같이, 본 명세서에서 거명한 화합물이 본 명세서에서 하나 이상의 용어를 정의하는데 사용되거나 단 한번 언급되는 경우, 이의 목적 또는 기능이 그 이름 또는 기능에만 한정되는 것이 아니다.
제형의 성분 하나 이상이 유리 형태 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태로 존재할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 이온적으로 결합된쌍을 형성시키기 위해서 필요에 따라 산과 반응시켜 변형시킨 화합물을 말한다. 약제학적으로 허용되는 염의 예에는 예를 들면 비독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 종래의 비독성 염이 포함된다. 적합한 비독성 염에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 설폰산, 설팜산, 인산, 질산 및 당업계에 공지된 다른 산으로부터 유도된 것이 포함된다. 염은 아미노산, 아세트산, 프로피온산, 수신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 토루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 이세티온산 및 당업게에 공지된 다른 산과 같은 유기산으로부터 제조한다. 다른 적합한 염의 목록은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th. ed., Mack Publishing Company, Easton,PA, 1985,p.1418)에 있다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 표현은 건전한 의약적 판단의 범위 내에서 사람 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 과도한 독성, 앨러지 반응 또는 다른 문제 또는 복합 증상 없이 합리적인 이익/위험 비를 갖는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 말한다.
제형은 약제 산업에서 공지된 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 액체 투여형은 컨테이너내에 하나 이상의 액체 담체 및 올레안드린 또는 올레안드린-함유 추출물을 제공함으로써 제조될 수 있다. 하나 이상의 다른 부형제가 액체 제형에 포함될 수 있다. 고체 투여형은 하나 이상의 고체 담체 및 올레안드린 또는 올레안드린-함유 추출물을 제공함으로써 제조될 수 있다. 하나 이상의 다른 부형제가 고체 투여형에 포함될 수 있다.
투여형은 통상적인 패키징 장치 및 재료를 사용하여 패키징될 수 있다. 이는 팩, 병, 유리병, 백, 주사기, 엔벨로프, 파켓, 블리스터 팩, 박스, 앰플 또는 기타 이러한 컨테이너내에 포함될 수 있다.
본 발명은 신경학적 질병을 갖는 피검체 집단에서 통계학적으로 유의미있는 수의 피검체의 임상 상태를 개선시키는 방법으로서, 네리움 종 또는 테베티아 종의 추출물을 피검체 집단에 투여하고, 피검체의 임상 상태를 측정하는 것을 포함한다. 일부 구체 예에서, 통계적으로 유의미한 수는 집단의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이다. 일부 구체예에서, 조성물은 올레안드린 또는 올레안드린을 포함하는 추출물을 포함한다. 다른 구체예에서, 추출물은 피검체의 임상 상태를 개선시키기 위해 올레안드린 또는 다른 강심 배당체와 협조하는 하나 이상의 다른 약리학적 활성 화합물을 포함한다.
상기 설명 및 아래 실시예로 볼 때, 당업계의 기술자는 과도한 실험없이 청구된 본 발명을 실시할 수 있을 것이다. 전술한 내용은 본 발명의 양태 제조를 위한 특정 공정을 상세히 설명한 다음 실시예를 참조하면 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다. 이들 실시예에서 모든 참조는 예시 목적이다. 하기 실시예는 배타적인 것이 아니며 본 발명에서 고려되는 많은 양태 중 몇몇 만을 예시한 것이다.
올레안드린은 시그마 케미칼 코. (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)로부터 구입할 수 있다.
실시예 1
분말화된 협죽도 잎의 초임계유체 추출
방법 A. 이산화탄소 사용
협죽도 잎 분말을, 수확하고, 세척한 후 건조시켜 준비한 다음, 협죽 잎 재료를 분쇄 및 탈수 장치, 예를 들면, 미국 특허 제5,236,132호, 제5,598,979호, 제6,517,015호 및 제6,715,705호에 기술된 장치를 통과시켰다. 출발 물질의 중량은 3.94kg이다.
출발 물질은 추출기 장치 내에서 300bar(30 MPa, 4351psi)의 압력 및 50℃(122℉)의 온도에서 순수한 이산화탄소와 합하였다. 총 197kg의 이산화탄소를 사용하여 50:1의 용매 대 원료비를 제공하였다. 이어서 CO2와 원료의 혼합물을 분리 장치를 통과시키고, 혼합물의 압력과 온도를 변화시키고 이산화탄소로부터 추출물을 분리하였다.
추출물(65g)을 향이 좋은 갈색의 끈끈한 점성 물질로서 수득하였다. 색은 클로로필에 기인한 것으로 보인다. 추출물 수율을 측정하기 위해서, 튜브 및 분리기를 아세톤으로 세정하고 아세톤을 증발시켜 추출물 9g을 수득하였다. 총 추출물 양은 74g이다. 출발 물질의 중량을 기준으로 하여, 추출물의 수율은 1.88%이다. 추출물 중의 올레안드린의 함량은 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분석(mass spectrometry)을 사용하여 계산한 결과 560.1 mg 또는 0.76% 수율이다.
방법 B. 이산화탄소와 에탄올의 혼합물 사용
협죽도 잎 분말을 수확하고, 세척한 후 건조시켜 준비한 다음, 협죽 잎 재료를 분쇄 및 탈수 장치, 예를 들면, 미국 특허 제5,236,132호, 제5,598,979호, 제6,517,015호 및 제6,715,705호에 기술된 장치를 통과시켰다. 출발 물질의 중량은 3.85kg이다.
출발 물질을 280bar(28 MPa, 4061 psi)의 압력 및 50℃(122℉)의 온도에서 순수한 이산화탄소와 개질제로서의 5% 에탄올과 추출 장치 내에서 합하였다. 총 160kg의 CO2 및 8kg의 에탄올을 사용하여 43.6:1의 용매 대 원료의 비를 제공하였다. 이어서, CO2, 에탄올 및 원료의 혼합물을 분리 장치를 통과시키고, 혼합물의 압력과 온도를 변화시켜 이산화탄소로부터 추출물을 분리하였다.
에탄올을 제거하여 약간의 클로로필을 함유하는 것이 분명한 암녹색의 끈끈한 점성 물질로서 추출물(207g)을 수득한다. 출발 물질의 중량을 기준으로 하여, 추출물의 수율은 5.38%이다. 추출물 내의 올레안드린의 함량은 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분석을 사용하여 계산한 결과, 1.89g 또는 2.1%이다.
실시예 2
협죽도 잎 분말의 고온수 추출물
협죽도 잎으로부터 올레안드린 및 다른 활성 성분을 추출하기 위해서는 보통 고온수를 사용해 왔다. 고온수 추출 공정의 예는 미국 특허 제5,135,745호 및 제 5,869,060호에서 발견될 수 있다.
고온수 추출을 협죽도 잎 분말 5g을 사용하여 수행하였다. 10 부피(협죽도 출발 물질의 중량 기준)의 끓는 물을 협죽도 잎 분말에 첨가하고 혼합물을 6 시간 동안 계속 교반하였다. 이어서 혼합물을 여과하고 잎 잔류물을 수집하고 동일한 조건에서 다시 추출하였다. 여과물을 합하고 동결건조시켰다. 추출물의 외관은 갈색이다. 건조된 추출 물질의 중량은 약 1.44g이다. 34.21mg의 추출 물질을 물에 용해시키고 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분석을 사용하여 올레안드린 함량을 분석하였다. 올레안드린의 양은 3.68mg으로 측정되었다. 올레안드린 수율은, 추출물의 양을 기준으로 하여, 0.26%로 계산되었다. 하기 표는 실시예 1의 두 초임계 이산화탄소 추출과 고온수 추출에 대한 올레안드린 수율 간의 비교를 보여준다.
수율 비교
Figure 112013055030618-pct00002
실시예 3
알츠하이머병을 포함하나 이로 제한되지 않는 신경학적 질병의 치료
방법 A. 추출물 치료법
알츠하이머 질환에 걸린 피검체에 추출물을 처방하고, 치료학적 관련 용량을 처방된 투약 요법에 따라 소정 기간 동안 피검체에 투여하였다. 피검체의 치료적 반응의 수준을 주기적으로 측정하였다. 치료적 반응의 수준이 1회 투여에서 매우 낮은 경우, 투여량은 피검체에서 목적하는 수준의 치료적 반응이 달성될 때까지 소정의 증량 스케줄에 따라 증량하였다. 추출물로의 피검체 처리는 필요에 따라 계속하며, 투여량 또는 투여 요법은 환자가 목적하는 임상 종점에 도달할 때까지 필요에 따라 조절될 수 있다.
방법 B. 조합 치료법: 추출물과 다른 치료제
상기 방법 A에 따르고, 단 알츠하이머 질환 또는 이의 증상 치료를 위한 하나 이상의 다른 치료제를 피검체에 처방하고 투여하였다. 하나 이상의 다른 치료제는 추출물 투여 전, 후 또는 함께 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료제의 증량 (또는 감량)이 또한, 수행될 수 있다. 적합한 하나 이상의 치료제는 나멘다TM(NamendaTM; 메만틴 HCl), 아리셉트TM(AriceptTM; 도네페질), 라자딘TM(RazadyneTM; 갈란타민), 엑셀론TM(ExelonTM; 리바스티그민), 코그넥스TM(CognexTM; 타크린) 및 아만타딘을 포함한다.
실시예 4
헌팅턴 질환을 포함하나 이로 제한되지 않는 신경학적 질병의 치료
방법 A. 추출물 치료법
헌팅턴 질환에 걸린 피검체에 추출물을 처방하고, 치료학적 관련 용량을 처방된 투약 요법에 따라 소정 기간 동안 피검체에 투여하였다. 피검체의 치료적 반응의 수준을 주기적으로 측정하였다. 치료적 반응의 수준이 1회 투여에서 매우 낮은 경우, 투여량은 피검체에서 목적하는 수준의 치료적 반응이 달성될 때까지 소정의 증량 스케줄에 따라 증량한다. 추출물로의 피검체 처리는 필요에 따라 계속하며, 투여량 또는 투여 요법은 환자가 목적하는 임상 종점에 도달할 때까지 필요에 따라 조절될 수 있다. 투여된 용량은 실시예 3의 용량과 유사하거나 본원에 달리 기술된 것과 유사하다.
방법 B. 조합 치료법: 추출물 및 다른 치료제
상기 방법 A에 따르고, 단 헌팅턴 질환 또는 이의 증상 치료를 위한 하나 이상의 다른 치료제를 피검체에 처방하고 투여하였다. 하나 이상의 다른 치료제는 추출물 투여 전, 후 또는 함께 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료제의 증량 (또는 감량)이 또한, 수행될 수 있다. 적합한 하나 이상의 치료제는 비타민 E, 바클로펜(Baclofen) (CoQ10의 유도체), 라모트리진 (Lamotgrigine) (항경련제), 라마세미드 (저친화도 NMDA 안타고니스트인 마취제), 및 릴루졸 (riluzole) (Na 채널 차단제)을 포함한다.
실시예 5
허혈성 뇌졸중을 포함하나 이로 제한되지 않는 신경학적 질병의 치료
방법 A. 추출물 치료법
허혈성 뇌졸중에 걸린 피검체에 추출물을 처방하고, 치료학적 관련 용량을 처방된 투약 요법에 따라 소정 기간 동안 피검체에 투여하였다. 피검체의 치료적 반응의 수준을 주기적으로 측정하였다. 치료적 반응의 수준이 1회 투여에서 매우 낮은 경우, 투여량은 피검체에서 목적하는 수준의 치료적 반응이 달성될 때까지 소정의 증량 스케줄에 따라 증량한다. 추출물로의 피검체 처리는 필요에 따라 계속하며, 투여량 또는 투여 요법은 환자가 목적하는 임상 종점에 도달할 때까지 필요에 따라 조절될 수 있다. 투여된 용량은 실시예 3의 용량과 유사하거나 본원에 달리 기술된 것과 유사하다.
방법 B. 조합 치료법: 추출물과 다른 치료제
상기 방법 A에 따르고, 단 허혈성 뇌졸중 또는 이의 증상 치료를 위한 하나 이상의 다른 치료제를 피검체에 처방하고 투여하였다. 하나 이상의 다른 치료제는 추출물 투여 전, 후 또는 함께 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료제의 증량 (또는 감량)이 또한, 수행될 수 있다.
실시예 6
올레안드린을 함유하는 용액의 HPLC 분석
샘플(올레안드린 표준, 초임계유체 추출물 및 고온수 추출물)을 하기 조건을 사용하여 HPLC(Waters) 상에서 분석하였다: Symmetry C18 Column(5.0 ㎛, 150×4.6 mm I.D.;Waters); MeOH:물=54:46(v/v)의 이동상 및 1.0ml/분 의 유량. 검출 파장은 217nm에서 설정되었다. 샘플은 화합물 또는 추출물을 고정량의 HPLC 용매 내에 용해시켜 올레안드린의 근접한 표적 농도에 달하게 함으로써 제조하였다.
실시예 7
정상 신경 조직에서 α3 및 α1 발현의 측정
본원에 참조로 통합된 PCT 국제 출원 PCT/US08/82641호(2008년 11월 6일에 출원, 출원인: Phoenix Biotechnology, Inc.)에 기재된 공정에 따를 수 있다.
실시예 8
뇌졸중 및 비-뇌졸중에 대한 시험관내 분석에서 강심성 배당체 및 본 발명의 추출물의 평가
방법 A. 뇌졸중: 피질 뇌 절편의 제조 및 OGD
신피질 뇌 절편을 PND 7 스프라그-돌레이 래트 펍 (Sprague-Dawley rat pup)으로부터 제조하였다. 대뇌피질을 절개하고, 400-마이크론-두께 절편으로 절단하고, 1uM MK-801과 냉 인공 뇌척수액을 함유하는 용기에 옮긴 후 플레이팅시키고; MK-801은 후속 공정에는 포함시키지 않았다. 일시적 산소-글루코오스 결핍 (OGD)을 이용하여 허혈성 손상을 모방하고, 각 뇌의 한 반구로부터의 절편을 글루코오스 비함유 N2-버블링된 인공 뇌척수액에 낮은 O2 (0.5%) 환경에서 7.5분 동안 노출시켰다. 그 후, OGD 슬라이스를 니트로셀룰로오스 또는 밀리셀 (Millicell) (Millipore) 투과성 멤브레인 상의 반대쪽 반구로부터의 대조군 절편과 나란히 플레이팅시키고, 상기 대조군 절편은 비 OGD를 제외하고는 동일하게 제조된 것이다. 플레이트 후 30분에, 뇌 절편 쌍을 트렌스펙션시키고, 24웰 플레이트에 이동시키고, 가습 챔버내의 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션하였다. 각 실험에서, 5-6분의 산소-글루코오스 결핍 (OGD) 처리를 이용하여 24시간 까지 건강한 피질 뉴런의 50% 초과의 손실을 유도하였다. 지정된 농도 (3 μM)의 네리폴린(강심 배당체)을 내부 양성 대조군으로서 이용하였다. 올레안드린(강심 배당체)에 있어서, 0.3 내지 3 μM의 모든 세 농도가 처음 두 실험에서 신경 보호를 제공하는 것으로 보이며, 이에 따라 시험된 올레안드린 농도를 세번째 수행시 저하시켰으며, 이는 신경보호에 대한 문턱값 농도가 0.1 내지 0.1 내지 0.3 μM에 있음을 시사한다. 예를 들어, 네리움 종의 비분획된 추출물, 또는 이의 분획물은 또한 올레안드린에 대해 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
방법 B. 비-뇌졸중: 뇌 절편 검정
올레안드린 및 PBI-05204, 협죽도의 비분획된 SCF 추출물을 "비-뇌졸중" 뇌 절편에서 시험하였다; 즉, 슬라이싱하고 YFP로 트랜스펙션시켰으나, OGD를 통한 추가적인 외상은 발생시키지 않았다. 상기 개략된 실험 공정 참조. 본 발명자들은 네리폴린을 포함하는 많은 신경보호 화합물이 이러한 뇌 절편에서 완만한 수준의 신경보호를 제공할 수 있으며, 아마도 슬라이스 및 배양 자체의 공정에 의해 초래된 외상에 대한 보호에 의해 발생한 것을 관찰하였다. 데이타에서는, 올레안드린 및 추출물이 네리폴린과 유사한 수준으로 이러한 "비-OGD" 뇌 절편에 신경보호를 제공할 수 있는 것으로 보이며, 이는 강심성 배당체가 산소 또는 글루코오스 결핍의 부재하에서도 신경보호를 매개함을 나타낸다.
실시예 9
알츠하이머 질환에 대한 시험관내 검정에서 강심성 배당체 및 추출물의 평가
피질 추상체 뉴런의 APP/Abeta-유도된 퇴행에 대한 래트 뇌 절편 모델에서, 바이탈 마커 예컨대, YFP 뿐만 아니라 질환 유전자 작제물을 뇌 절편의 동일한 뉴런 집단에 도입하기 위해 바이오리스틱 트랜스펙션을 이용하였다. 이에 따라, APP/Aβ 뇌 절편 모델을 YFP와 APP 이소폼으로 공동-트랜스펙션시켜, 뇌 절편 제조 및 트랜스펙션 후 3-4일에 걸쳐 피질 추상체 뉴런의 진행적인 퇴행을 유도하였다. 이러한 데이타는, 올레안드린 및 PBI-05204, 협죽도의 비분획된 SCF 추출물 둘 모두는 APP-트랜스펙션된 뇌 절편에 대한 용량-의존적인 신경 보호를 제공할 수 있는 것으로 보이며, BACE 억제제 약물에 의해 제공될 수 있는 수준에 근접한 수준으로 복구시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 10
헌팅턴 질환에 대한 시험관내 피질선조 공생-배양 검정에서 강심성 배당체 및 추출물의 평가
이러한 검정에서, 본래의 뇌 절편을 이용하는 대신에, 변이체 htt를 96-웰 플레이트에 정렬된 피질 뉴런, 선조체 뉴런 및 신경교의 고밀도의 혼합된 공생-배양물로 전기천공에 의해 도입시켰다. 이러한 검정의 목적은 생체내에서의 질환 관련 신경 집단과 대규모의 완전 자동화된 스크리닝 컴패인과의 상호연결성의 주요 양상을 반복하는 복잡한 일차 배양 시스템의 생물학적/임상적 관련성을 조합시키기 위한 것이다. 이런한 검정에 있어서, 시험관내에서의 1-2주 과정에 걸쳐, 트랜스펙션된 변이체 htt 작제물은 선조 및 피질 뉴런의 진행성 퇴화를 유도하며, 이는 후속적으로 셀로믹스 어레이스캔 VTI 플랫폼 (Cellomics Arrayscan VTI platform)상의 자동화된 이미지 습득 및 물체 검출 알고리즘을 이용하여 정량화된다. 각각의 데이타 포인트는 각 웰에서 16개 이미지로 6개 웰로부터 유도되며, 자동으로 캡처링되고 처리되고, 대규모 스크리닝 캠페인이 큐어 헌팅턴 디지즈 이니시에이티브 (Cure Huntington's Disease Initiative)와 관련되어 수행되는 동안 발생되는 프로토콜을 이용하여 셀로믹스 어레이스캔상에서 분석되었다. 총 수행시, 일부 25,000 이미지가 수집되었으며, 각각의 사이클은 주 당 4 사이클씩 분석되었다.
피질-선조 공동-배양 검정 플랫폼
순수한 신경아교세포 배양물을 제조한 후 신경세포 플레이팅하여 유착성 신경아교세포 베드를 갖는 96-웰 플레이트를 설치하였다. 피질 및 선조 조직을 별도로 분리하고, 적합한 DNA 작제물로 "뉴클레오펙션"시키고, 이는 상이한 형광 단백질 예컨대, YFP, CFP 및 mCherry의 발현에 의해 후에 구별가능해 진다. 이러한 별도로 트랜스펙션된 피질 및 선조 뉴런을 완전히 혼합한 후, 이전에 플레이팅된 신경아교세포 모노레이어를 함유하는 96-웰 플레이트에 플레이팅시켰다.
올레안드린과 PBI-05204 (협죽도의 초임계 CO2 추출물) 둘 모두를 이러한 선조-피질 공동-배양 플랫폼에서 시험하고, 사전에 이들 화합물은 본 검정 시스템에서 평가되었던 >400 레이트-스테이지 (late-stage) 약물 분자 중 지금까지 관찰된 가장 강한 히트(hit)를 나타낸다. 비교를 위해, KW6002 (아데노신 2a 수용체 안타고니스트) 즉, 본 발명자들이 이러한 공동-배양 검정에서 양성 대조군으로서 포함시킨 화합물에 대한 용량-반응 곡선이 포함된다. 올레안드린에 대한 효능 (efficacy)은 KW6002과 동일한 반면, 이의 효능 (potency)은 100배는 더 큰 것으로 나타났다(도 3a-3d).
실시예 11
알츠하이머 질환에 대한 시험관내 APP 검정에서 협죽도의 SCF 추출물의 분획물의 평가
실시예 13에 따라 분획물을 제조하였다. 이러한 검정을 실시예 9의 검정과 유사하게 수행하였다. 도 6의 데이타는, APP 작제물의 도입과 관련된 신경퇴화를 예방하는데 있어 분획물 0-4A의 농도 의존적 효과가 존재함을 나타낸다. 특히, 데이타는 3 내지 30 ㎍/ml의 농도 범위에서 신경보호를 나타낸다.
실시예 12
알츠하이머 질환에 대한 시험관내 tau4R 검정에서 협죽도의 SCF 추출물의 분획물의 평가
실시예 13에 따라 분획물을 제조하였다. 도 7의 데이타는 Tau 작제물의 도입과 관련된 신경퇴화를 예방하는데 있어 분획물 O-4A의 농도 의존적 효과가 존재함을 나타낸다. 특히, 데이타는 3 내지 30 ㎍/ml의 농도 범위에서 신경보호를 나타낸다. Tau 작제물 처리된세포와 분획물 O-4A의 용액에 노출된 세포 간에 상당한 차이가 있다.
실시예 13
SCF 추출물의 크로마토그래피 분획화
협죽도 잎의 초임계 추출물(5 g)(본원에 기술된 바와 같이 식물 물질을 보조 용매/개질제로서 첨가된 EtOH를 지닌 초임계 CO2의 혼합물로 추출함으로써 얻어짐, 배치 #270111)을 물(150 ml)에 현탁시키고 헥산(각각 150 ml)으로 세 차례 분별하였다. 수층을 물로 평행화된 ODS 수지의 층에 직접 채움으로써 수층을 ODSC-18 (옥타데실-작용화된 실리카 겔, 20-22% 라벨링됨, 200-400 메시) 오픈 컬럼(open column) (400 mm (L) x 38 mm (ID))으로 분획하였다. 컬럼을 물 및 메탄올의 혼합물(1000 ml의, 수중 30% 메탄올, 1000 ml의, 수중 55% 메탄올, 1000 ml의 수중 80% 메탄올, 1000ml의 100% 메탄올), 및 아세톤:메탄올(2 부피:1 부피; 1000 ml)의 혼합물로 연속적으로 처리하였다. 각 혼합물로부터의 용리액(1000 ml)을 합하였다. 용매를 증발에 의해 각 분획물로부터 제거하여 5개의 분획물, 즉 Fr-O-1, Fr-O-2, Fr-O-3, Fr-O-4, 및 Fr-O-5를 수득하였다. 이후에, 분획물들을 실시예 14에 따라 HPLC 크로마토그래피로 분석하였다.
실시예 14
SCF 추출물의 분획물의 HPLC 분석
이러한 분석의 목적은 강심성 배당체를 함유하는 추출물을 확인하는 것이다. 각 추출물로부터의 샘플을 하기와 같이 분석하였다. 추출물 (1-3mg)을 1-5ml의 수성 메탄올 (물중의 80% 메탄올)에 용해시켰다. 희석된 샘플(10-25㎕)를 이동상으로서 수중 80% 메탄올, 0.7mL/분의 유속 및 하기 파장에서의 DAD-UV 유출을 이용하여 어질런트 조르박스 (Agilent Zorbax) SB-C18 칼럼으로 분석하였다: 203, 210, 217, 230, 254, 280, 310 및 300nm.
실시예 15
추출물의 분획물에 의해 제공된 신경보호의 측정을 위한 뇌-절편 검정
이러한 검정을 실시예 8에 따라 수행하였다. 이러한 데이타는, 뇌 절편 뉴런에 대한 미처리된 뇌졸중(OGD) 매개 손상과 비교하여, PBI-05204는 상당한 수준의 보호를 제공함을 나탄낸다. 유사한 수준의 신경보호는 분획물 O-4A(도 4a 및 도 5), 뿐만 아니라 분획물 0-3 (도 4c) 및 분획물 0-1 (도 4d)에 의해 제공된다. 반대로, 분획물 0-2 (도 4b) 및 0-5 (도 4e)는 뇌종줄 매개 허혈성 뇌 손상의 이러한 OGD 모델에서 신경보호 효과를 나타내지 않는다.
실시예 16
신경보호 판단을 위한 시간-지연 뇌- 절편 분석
본 분석은 실시예 8에 따라 수행하였으며, 단 하기와 같이 변형시켰다. OGD와 제시된 신경보호제의 유입 사이에 특정화된 시간 간격을 부여하였다. OGD의 타이밍에 대하여 처치가 지연되는 경우 뇌 절편에 대한 신경보호를 제공할 수 있는 PBI-05204의 능력을 측정하였다. 데이타는, 협죽도 추출물은 2시간 지연에 대해 견디었으며, 이는 OGD 처리 직후 PBI-05204의 적용으로 수득된 것과 유사한 신경 보호 수준을 나타낸다. 신경보호 이점은 PBI-05204의 투여의 4 내지 6시간 지연으로 변형시켰으며, 신경 보호의 수준은 여전히 유의미하게 그리고, 생리학적으로 관련이 있었다.
실시예 17
실시예 13에 따라 얻어진 협죽도 SCF 추출물의 분획물에서 화합물의 식별
Fr-O-4 분획물 중에 존재하는 물 및 메탄올을 감압 하에서 증발시켜 제거하였다. 실시예 13의 Fr-O-4 분획물로부터의 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(하기)로 처리하여 서브-분획물을 제공하고, 이후에 이를 박막 크로마토그래피(TLC)로 분석하였다. 유사한 TLC 프로파일을 갖는 분획물을 합하고, 이의 용매를 감압 하에 증발시켜 제거하였다. 나머지 잔류물을 HNMR로 분석하였다.
박막 크로마토그래피
TLC를 헥산:에틸 아세테이트(7:3 v:v)의 혼합물을 사용하여 통상적인 분석 등급의 TLC 플레이트 상에서 수행하였다. 화합물들을 H2S04로 시각화하였으며, 이에 의해 스테로이드는 청색을 나타내고, 트리테르펜은 자주색을 나타낸다.
플래시 크로마토그래피에 의한 추가 분획화 이전에, Fr-O-4 분획물의 TLC 분석은 하나의 주요 스폿(spot) 및 5개가 넘은 작은 스폿의 존재를 나타낸다. 칼라 반응은 주요 스폿이 스테로이드 및 트리테르펜의 혼합물을 함유하며, 작은 스폿 대부분은 스테로이드를 함유함을 나타낸다.
실라카겔 플래시 크로마토그래피
실리카 겔(Biotage; (10-15 g)을 컬럼에 로딩하고 에틸 아세테이트(3%) 및 헥산(97%)의 혼합물로 평형화시켰다. Fr-O-4 분획물로부터의 잔류물을 0.2-0.5 ml의 에틸 아세테이트(3%) 및 헥산(97%)의 혼합물에 처리하고, 컬럼 상에 채웠다. 플래시 크로마토그래피를 헥산(97-70% 각각) 중 에틸 아세테이트(3%-30%)의 용매 구배 이후 100% 메탄올을 사용하여 수행하였다. 컬럼으로부터 수집된 서브-분획물을 TLC(상기)로 분석하였으며, 유사한 TLC 시각화 프로파일을 갖는 분획물들을 합하고 농축시켜 용매를 제거하였다.
HNMR 분광법
플래시 크로마토그래피로부터 얻어진 농축된 서브-분획물 각각의 샘플을 주요 성분에 대한 구조적 부류를 결정하기 위하여, 통상적인 방법을 이용하여 HNMR로 분석하였다.
실시예 18
비분획된 형태의 실시예 1(방법 B)에 따라 얻어진 협죽도 SCF 추출물에서 화합물의 식별
SCF 추출물을 하기와 같이 MS-DART TOF 분석으로 분석하였다. JEOL AccuTOF-DART 질량 분광기(Jeol U.S.A., Peobody, MA, U.S.A.)를 사용하였다.
JEOL AccuTOF-DART 질량 분광기 (Jeol USA, Peabody,MA, USA)를 사용하였다. 분석물을 양이온 모드(DART+)에서 수행하여, DART-MS에 의해 발생된 M+H+ 이온에 상응하는 물질을 제공하였다. 기기 상에 소정 범위의 셋팅을 이용하여 협죽도 분석물에 대한 최적의 조건을 결정하였다. DART+에 대한 일반적인 셋팅은 니들 전압 3500 V; 오리피스 1- 2-20 V; 링 렌즈 2-5 V; 오리피스 2- 2-5 V; 및 피크 전압 1000 V를 포함한다. 요구되는 질량 범위의 100-1000 질량 단위 내에서 물질 마커를 제공하는 10% PEG 600 용액을 이용하여 각 샘플로 내부적으로 보정을 수행하였다. 다른 분석물을 DART-모드에서 수행하였으며, 이들은 니들 전압 3500 V; 가열 부재 250℃; 전극 1-150 V; 전극 2-250 V; He 가스 유량 3.79LPM으로 구성된다. 질량 분광기 셋팅: MCP 2600 V; 오리피스 1- 15 V; 링 렌즈- 5 V, 오리피스 2- 5 V; 및 피크 전압 1000 V. 요구되는 질량 범위의 100-1000 질량 단위 내에서 물질 마커를 제공하는 퍼플루오르화된 카복실산 용액을 이용하여 각 샘플로 내부적으로 보정을 수행하였다. 협죽도 샘플 그 자체를 보로실리케이트 유리 융점 튜브의 닫혀진 단부를 이용하여 DART 헬륨 플라즈마에 도입하였다. 모세관 튜브를 He 플라즈마에서 분석에 따라 대략 3 내지 5초 동안 유지시켰다. 분자식을 원소 조성, 및 JEOL AccuTOF DART-MS 기기에 제공된 동위 원소 매칭 프로그램을 이용하여 확인하였다. HerbalScience(Naples, FL, USA)에 의해 개발된, 협죽도 구성성분의 조사 가능한 데이타베이스를 이용하였다.
SCF 추출물은 명시된 상대 존재비(relative abundance)(%)으로 존재하는 하기 성분들을 적어도 함유하는 것으로 확인되었다.
Figure 112013055030618-pct00003
본원에서 사용되고 달리 명시되는 않는 한, 용어 "약" 또는 "대략"은 특정화된 값의 ±10%, ±5%, ±2.5% 또는 ±1%를 의미하는 것이다. 본원에서 사용되고 달리 명시되지 않는 한, 용어 "실질적으로"는 "큰 범위로" 또는 "적어도 대부분의" 또는 70% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과를 의미하는 것이다.
상기는 본 발명의 특정 양태의 상세한 설명이다. 본 발명의 특정 양태를 예시 목적으로 기재하였지만 다양한 변경이 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 범위에서 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발 명은 첨부되는 청구의 범위를 제외하고는 달리 제한되지 않는다. 본 명세서에 기술하고 청구한 양태는 모두 본 명세서에 비추어 보아 과도한 실험없이 이루어지고 실시될 수 있다.

Claims (61)

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  4. 피검체에서 알츠하이머 병, 헌팅턴 질환, 허혈성 뇌졸중 또는 뇌졸중 중 하나의 신경학적 병태의 치료를 위한 약제 조성물로서, 약제 조성물이 올레안올산, 우르솔릭산 및 베툴린산으로부터 선택된 둘 이상의 트리테르펜을 포함하는 협죽도의 추출물의 분획물 또는 서브-분획물을 포함하고, 조성물이 협죽도로부터 얻은 강심 배당체 및 다당류를 배제하는 약제 조성물.
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  16. 제 4항에 있어서, 협죽도의 추출물의 분획물 또는 서브-분획물이 올레안올산, 우르솔릭산 및 베툴린산을 포함하는 약제 조성물.
  17. 제 4항 또는 제 16항에 있어서, 협죽도의 추출물의 분획물 또는 서브-분획물이 스테로이드를 추가로 포함하는 약제 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 스테로이드가 올레안드리게닌인 약제 조성물.
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  24. 제 4항 또는 제 16항에 있어서, 협죽도의 추출물의 분획물 또는 서브-분획물이 강심 배당체, 카르데놀리드, 트리테르페노이드, 베툴린, 28-노루르스-12-엔-3β-올, 우르스-12-엔-3β-올, 3β,3β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익 산, 3β,20α-디하이드록시우르스-21-엔-38-오익 산, 3β,27-디하이드록시-12-우르센-38-오익 산, 3β,13β-디하이드록시우르스-11-엔-28-오익 산, 3β,12α-디하이드록시올레아난-28,13β-올리드, 또는 3β,27-디하이드록시-12-올레아난-28-오익 산의 아글리콘의 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료학적 효능제를 추가로 포함하는 약제 조성물.
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  27. 제 4항에 있어서, 추출물이 협죽도를, 고온수 추출, 냉수 추출, 초임계 유체 추출, 유기 용매 추출 또는 이들의 조합에 의해 추출함으로써 얻어진 약제 조성물.
  28. 제 27항에 있어서, 추출물이 개질제의 존재 하에 초임계 유체 추출에 의해 제조되는 약제 조성물.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140066488A1 (en) * 2012-08-30 2014-03-06 Purdue Research Foundation Inhibitors of Memapsin 2 Cleavage for the Treatment of Alzheimer's Disease
WO2014145874A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 University Of Iowa Research Foundation Therapeutic methods
CN104914193B (zh) * 2015-06-29 2016-08-10 公安部物证鉴定中心 生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱-串联质谱检验方法
CN105878316A (zh) * 2016-04-11 2016-08-24 天津中医药大学 黄花夹竹桃叶中总强心苷的提取方法及含量测定方法
JP7370966B2 (ja) * 2017-09-14 2023-10-30 フェニックス・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド 神経学的状態を治療するための方法および改善された神経保護組成物
EP3881898A4 (en) 2018-11-13 2022-08-10 Green Tech Co., Ltd. PROPHYLACTIC AGENT AND/OR THERAPEUTIC AGENT FOR A NEURODEGENERATIVE DISEASE
CN110487934A (zh) * 2019-08-30 2019-11-22 浙江工业大学 齐墩果酸和熊果酸的分析方法
CN111494390B (zh) * 2020-05-18 2022-08-19 南通大学 白桦醇衍生物在制备修复神经损伤药物中的新用途

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5236132A (en) 1992-01-03 1993-08-17 Vortec, Inc. Gradient-force comminuter/dehydrator apparatus and method
US5598979A (en) 1995-04-20 1997-02-04 Vortec, Inc. Closed loop gradient force comminuting and dehydrating system
JP2000247993A (ja) * 1999-03-01 2000-09-12 Toray Ind Inc トリテルペノイド系化合物を含んでなるσレセプター作用薬
CN1129613C (zh) * 1999-12-24 2003-12-03 中国科学院上海药物研究所 夹竹桃花多糖及其制备方法和应用
US6517015B2 (en) 2000-03-21 2003-02-11 Frank F. Rowley, Jr. Two-stage comminuting and dehydrating system and method
JP2002078468A (ja) * 2000-09-06 2002-03-19 Takenori Kato 耐熱性金属イオンゲル入り飲料
US6715705B2 (en) 2001-03-16 2004-04-06 Frank F. Rowley, Jr. Two-stage comminuting and dehydrating system and method
US20040082521A1 (en) 2002-03-29 2004-04-29 Azaya Therapeutics Inc. Novel formulations of digitalis glycosides for treating cell-proliferative and other diseases
AU2003240818B2 (en) * 2002-05-28 2006-05-04 Bette Pollard Cardiac glycosides to treat cystic fibrosis and other IL-8 dependent disorders
JP2006508126A (ja) 2002-11-06 2006-03-09 アザヤ セラピューティクス インコーポレイティッド 薬学的製剤のタンパク質安定化されたリポソーム製剤
US20050026849A1 (en) 2003-03-28 2005-02-03 Singh Chandra U. Water soluble formulations of digitalis glycosides for treating cell-proliferative and other diseases
ES2311177T3 (es) * 2003-12-19 2009-02-01 Lipid Nutrition B.V. Uso de composiciones que comprenden acido oleanico y acido ursolico en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de la hipersensibilidad y la hiperreactividad.
US7529217B2 (en) * 2004-03-27 2009-05-05 Dust Networks, Inc. Low-power autonomous node for mesh communication network
WO2006044916A2 (en) * 2004-10-18 2006-04-27 Bionaut Pharmaceuticals, Inc. Use of na+/ k+-atpase inhibitors and antagonists thereof
US7402325B2 (en) * 2005-07-28 2008-07-22 Phoenix Biotechnology, Inc. Supercritical carbon dioxide extract of pharmacologically active components from Nerium oleander
MX2010005081A (es) * 2007-11-13 2010-06-23 Phoenix Biotechnology Inc Metodo para determinar la probabilidad de una respuesta terapeutica en la quimioterapia para el cancer con un glicosido cardiaco.
ES2588193T3 (es) * 2008-03-28 2016-10-31 Nerviano Medical Sciences S.R.L. Derivados de 3,4-dihidro-2H-pirazino[1,2-a]indol-1-ona activos como inhibidores de cinasa, proceso para su preparación y composiciones farmacéuticas que los comprenden
ES2326065B1 (es) * 2008-03-28 2010-07-08 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) Utilizacion de un triterpeno pentaciclico para la preparacion de una composicion farmaceutica destinada al tratamiento de la esclerosis multiple.
WO2011085307A1 (en) * 2010-01-11 2011-07-14 Phoenix Biotechnology, Inc. Method of treating neurological conditions with cardiac glycosides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Man-Shan Yu 외 5명. New polysaccharide from Nerium indicum protects neurons via stress kinase signaling pathway. Brain Research. Vol. 1153, 2007년, pp. 221-230*

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