CN104914193B - 生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱-串联质谱检验方法 - Google Patents
生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱-串联质谱检验方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱‑串联质谱检验方法，包括如下步骤：取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；取上述制备好的样品，加入的乙酸乙酯两次，每次振荡10min，离心10min，合并两次有机相，空气浓缩仪上浓缩至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱‑串联质谱仪分析。本发明的检测方法简单高效、快速灵敏、准确度高，具有广泛的实用性，能够应用于生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。
Description
技术领域
本发明属于生物样品检验领域，具体涉及生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱-串联质谱检验方法。
背景技术
夹竹桃(Neriumindicum.Mill)为夹竹桃属常绿灌木。现代医学研究证明,夹竹桃味苦性寒,具有强心、利尿、抗癌、抗炎、镇静安神等作用，但是夹竹桃的叶皮根花均有毒，日常生活当中，常因药用或误服过量夹竹桃而出现头痛、头晕、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、谵语、甚则汗出肢厥、心律失常、直至休克死亡。
发明内容
本发明提供生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱-串联质谱检验方法，适用于生物样品(血、尿、肝、肾等)中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的定性定量检验，也适用于体外样品和可疑物证的检验。
本发明的原理是以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对体液样品样进行提取、净化及浓缩，用LC-MS/MS进行检测，以保留时间(Rt)、质谱特征离子碎片峰和相对丰度作为定性判断依据；与平行操作的添加标准品响应值比较，根据峰面积之比，用外标法进行定量分析。
具体的，本发明一方面的目的在于提供生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱-串联质谱检验方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；取上述制备好的样品，加入5.0-10.0mL的乙酸乙酯两次，每次振荡10min，离心10min，合并两次有机相，空气浓缩仪上浓缩至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析；
b)样品分析：
色谱柱：kinetex C18；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：A为乙腈，B为用甲酸调节pH为3.5的10mM甲酸铵水溶液(本发明中：10mM甲酸铵水溶液是指甲酸铵的浓度为10mmol/L，用甲酸调节其pH为3.5，以下不再赘述)；梯度洗脱：0.2min，A为10％，B为90％；3.0min，A为95％，B为5％；5.0min，A为95％，B为5％；5.1min，A为10％，B为90％；7.0min，A为10％，B为90％；流速为0.5mL/min；
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)，两对离子对定性，其中一对离子对定量；电喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；雾化气压力：55psi；气帘气压力：35psi；辅助气压力：55psi。
在本发明的另一个实施方案中，尤其是对于新鲜血液样品，其中a)样品前处理还能够替换为：移取液体样品，加入pH5.8的磷酸盐缓冲液，混匀后，将样品加入固相支撑液液萃取柱中,用正压将样品压入柱中，静置5min，将乙酸乙酯分两次加入到萃取柱中，流速为0.5mL/min～1.0mL/min；再将柱中残余的液体挤出；萃取完毕后，将萃取液用氮气流吹至干，然后用初始流动相定容至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
优选地，上述pH5.8磷酸盐缓冲液的加入量为0.5mL；优选地，上述乙酸乙酯的加入量为8mL。
在本发明的一个具体的实施方式中，其中a)样品前处理步骤中，还包括另取3份相同基质的空白样品，1份作为空白样品，另2份添加夹竹桃苷和夹竹桃苷乙混标0.1μg作为添加样品；或者还包括准确量取液体样品1.0mL～2.0mL或均浆后的固体样品1.0g～2.0g，添加有机磷标准品混标，混匀。
在本发明的一个具体的实施方式中，液体样品为血液、尿液、唾液；所述组织样品为肝脏、肾脏。
在本发明的一个具体的实施方式中，C18柱为3.0mm×50mm，2.6μm柱。
在本发明的一个优选的实施方式中，取液体样品1.0mL-2.0mL；或者组织样品1.0g-2.0g。
本发明另一方面的目的在于提供生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱-串联质谱检验方法的应用，应用于法庭科学领域，尤其是应用于生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。
优选地，所述生物样品为血、尿、肝、肾。
本发明的有益效果在于：本发明样品处理采用液液萃取或者固相萃取，操作简单，样品用量少；采用LC-MS/MS灵敏度高，能有效的排除假阳性，定性、定量准确度高。
附图说明
图1表示夹竹桃苷质谱图；
图2表示夹竹桃苷乙质谱图；
图3A和图3B表示夹竹桃苷MRM离子色谱图；
图4A和图4B表示夹竹桃苷乙MRM离子色谱图。
具体实施方式
实施例1定性分析
1、试剂
本发明除有说明外所用试剂均为分析纯，试验用水为三级水(见GB/T 6682-2008规定)；
乙腈：色谱纯；
甲醇：色谱纯；
甲酸：色谱纯；
甲酸铵：色谱纯；
磷酸盐缓冲液(pH 5.8)：取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g，分别置于1000mL容量瓶中，加一级水溶解、稀释至刻度；
纯水(电阻率≥18MΩ.CM)。
液液支撑固相萃取柱，60mg，1mL。
有机滤膜，0.22μm。
标准溶液：
1)夹竹桃苷和夹竹桃苷乙储备液：精确称取夹竹桃苷和夹竹桃苷乙标准品各10mg，分别于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，配制成1.0mg/mL钩吻素甲和钩吻素子标准储备液，冷藏保存6个月；
2)夹竹桃苷和夹竹桃苷乙标准工作液：精确量取1.0mg/mL夹竹桃苷和夹竹桃苷乙标准储备液各1mL，分别于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0.10mg/mL的夹竹桃苷和夹竹桃苷乙标准工作液，冷藏保存1个月。试验中所用其它浓度的标准溶液均从上述储备溶液用甲醇稀释而得，冷藏保存为1个月。
2、仪器和材料
a)高效液相色谱-串联质谱仪；
b)电子分析天平：感量为0.0001g和0.01g；
c)高速振荡器；
d)高速离心机；
e)匀浆机；
f)浓缩仪；
j)涡旋混合器；
h)微量移液器：量程5μL～100μL,100μL～1000μL；
i)微孔滤膜：0.22μm；
3、样品萃取
3.1、液液萃取
取血液等液体样品1.0mL～2.0mL、或肝脏等固体样品(匀浆后)1.0g～2.0g于具塞试管中，另取3份相同基质的等量空白样品于具塞试管中，1份作为空白样品，另2份添加有夹竹桃苷和夹竹桃苷乙混标0.1μg作为添加样品。
取上述制备好的样品，加入5.0-10.0mL的乙酸乙酯两次，每次振荡10min，离心10min，合并两次有机相，空气浓缩仪上浓缩至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
3.2、固相萃取(适用于新鲜血液)
移取血液0.5mL，加入0.5mL的pH5.8磷酸盐缓冲液，混匀后，将样品加入固相支撑液液萃取柱中,用正压将样品压入柱中，静置5min，将8mL乙酸乙酯分两次加入到萃取柱中，流速为0.5mL/min～1.0mL/min；再将柱中残余的液体挤出；萃取完毕后，将萃取液用氮气流吹至干，然后用初始流动相定容至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
4、仪器检测
液相色谱-串联质谱仪条件
以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：
a)色谱柱：kinetex C18(3.0mm×50mm，2.6μm)柱；
b)柱温：40℃
c)流动相：流动相：A：乙腈，B：用甲酸调节pH为3.5的10mM甲酸铵水溶液，梯度见表1。
d)流速：0.5mL/min
e)进样体积：10μL
表1流动相梯度
| 时间/min | B，V％ | A，V％ |
| 0.2 | 90 | 10 |
| 3 | 5 | 95 |
| 5 | 5 | 95 |
| 5.1 | 90 | 10 |
| 7 | 90 | 10 |
MS条件
扫描方式：ESI+；检测方式：MRM，两对离子对定性，其中一对离子对定量。
离子源温度：550℃；雾化气压力55psi；
电喷雾电压：5500V；气帘气压力：35psi；辅助气压力：55psi。
离子对质谱参数见表2。
表2质谱参数
5、记录和计算
记录各样品及标准品平行进样2～3次中目标物的保留时间及峰面积值，按公式(1)计算回收率：
式中：
R－回收率；
A添－添加样品中标准物质的峰面积平均值；
W纯－标准物质浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V添－添加样品的定容体积，单位为毫升(mL)；
A纯－标准物质的峰面积平均值；
M添－添加样品中标准物质的添加量，单位为微克(μg)。
6、定性结果评价
6.1、阴性结果评价
在LC-MS/MS分析中，如果检材样品未出现与标准物质Rt值相同的色谱峰，添加样品的回收率在60％以上，则阴性结果可靠。
如果添加样品中未出现与标准物质Rt值相同的色谱峰或回收率低于60％，则阴性结果不可靠。
本发明的方法在血液、尿液等检材样品中夹竹桃苷、夹竹桃苷乙的检出限为0.5ng/mL。
6.2阳性结果评价
如果案件样品与标准品Rt值比较，保留时间偏差在±2.5％之内，且质谱特征离子碎片(或定性离子对)与添加样品中的相对丰度比之相对误差不超过表3规定的范围，空白样品无干扰，则阳性结果可靠。
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
| 相对离子丰度 | ＞50％ | ＞20％～50％ | ＞10％～20％ | ≤10％ |
| 允许的相对偏差 | ±20％ | ±25％ | ±30％ | ±50％ |
如果空白样品出现与标准品Rt值相同的色谱峰，且质谱特征离子碎片(或定性离子对)及相对丰度一致，则阳性结果不可靠。相关质谱图参见图1-图4。实施例2定量分析
1、试剂同实施例1
2、仪器与材料同实施例1
3、样品萃取
准确量取血液等液体样品1.0mL～2.0mL或称取匀浆后的肝脏等固体样品1.0g～2.0g各3份，1份作为空白样品，另2份添加有机磷标准品混标，混匀。其他同实施例1。
4、仪器检测同实施例1
5、记录和计算
5.1、外标法计算药物含量
记录各样品平行进样2～3次中目标物峰面积值，按公式(2)计算含量：
式中：
W－单位质量样品中目标物质的含量，单位为微克每克(μg/g)或微克每毫升(μg/mL)；
A样－样品中目标物的峰面积平均值；
M添－添加样品中标准物质的添加量，单位为微克(μg)；
V样－样品的定容体积，单位为毫升(mL)；
A添－添加样品中目标物的峰面积平均值；
M样－样品的取样量，单位为克(g)或毫升(mL)；
V添－添加样品的定容体积，单位为毫升(mL)。
5.2内标法计算药物含量
记录各样品平行进样2～3次目标物及内标物保留时间和峰面积值，按公式(3)计算校正因子,按公式(4)计算含量:
式中：
f—校正因子；
M标—添加样品中目标物添加量，单位为微克(μg)；
A内—内标物峰面积平均值；
M内—添加样品中内标物添加量，单位为微克(μg)；
A标—目标物峰面积平均值。
式中：
W－单位质量样品中目标物含量，单位为微克每克(μg/g)或微克每毫升(μg/mL)；
f—校正因子；
A样－样品中目标物平均峰面积；
M内－内标物添加量，单位为微克(μg)；
A内－内标物峰面积平均值；
M样－样品的取样量，单位为克(g)或毫升(mL)；
5.3、计算相对相差
记录2份平行操作的样品含量，按公式(5)计算相对相差：
式中：
RD－相对相差；
X1、X2－两个样品平行定量测定的含量数值；
－两个样品平行定量测定含量的平均值。
6、定量结果评价
如果案件样品中目标物含量的RD＞20％，定量数据不可靠。如果目标物含量的RD≤20％，定量数据可靠。其含量按两份案件样品的平均值计算。
实施例3利用非新鲜血液对本发明的方法进行评价
1、试剂，同实施例1。
2、仪器和材料，同实施例1。
3、样品萃取
分别取空白的非新鲜血液1.5mL于具塞试管中，分别添加夹竹桃苷和夹竹桃苷乙标准品制备成添加样品，混匀。
分别取上述制备好的样品，加入10.0mL的乙酸乙酯两次，每次振荡10min，离心10min，合并两次有机相(对二次提取后的无机相进行高效液相色谱分析，样品的提取率为96.5％)，空气浓缩仪上浓缩至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
4、仪器检测
液相色谱-串联质谱仪条件
以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：
f)色谱柱：kinetex C18(3.0mm×50mm，2.6μm)柱；
g)柱温：40℃
h)流动相：流动相：A：乙腈，B：用甲酸调节pH为3.5的10mM甲酸铵水溶液，梯度见表1。
i)流速：0.5mL/min
j)进样体积：10μL
表1流动相梯度
| 时间/min | B，V％ | A，V％ |
| 0.2 | 90 | 10 |
| 3 | 5 | 95 |
| 5 | 5 | 95 |
| 5.1 | 90 | 10 |
| 7 | 90 | 10 |
MS条件
扫描方式：ESI+；检测方式：MRM，两对离子对定性，其中一对离子对定量。
离子源温度：550℃；雾化气压力55psi；
电喷雾电压：5500V；气帘气压力：35psi；辅助气压力：55psi。
离子对质谱参数见表2。
表2质谱参数
夹竹桃苷添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为83.2％、87.5％、93.8％；RSD％分别为3.8、3.3、2.2。
夹竹桃苷乙添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为82.3％、86.8％、92.1％；RSD％分别为3.4、3.0、1.0。
夹竹桃苷和夹竹桃苷乙在10～1000ng/mL浓度范围内均有着良好的线性关系。
夹竹桃苷添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.45、2.81、2.56，RSD％(日间)分别为3.26、2.53、4.01。
夹竹桃苷乙添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.39、2.75、2.10，RSD％(日间)分别为3.42、2.67、4.00。
以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为0.5ng/mL，以信噪比3/1计，该方法的最小检出限为0.1ng/mL。
实施例4利用新鲜血液对本发明的方法进行评价
1、试剂，同实施例1。
2、仪器和材料，同实施例1。
3、样品萃取
移取血液0.5mL，加入0.5mL的pH5.8磷酸盐缓冲液，混匀后，将样品加入固相支撑液液萃取柱中,用正压将样品压入柱中，静置5min，将8mL乙酸乙酯分两次加入到萃取柱中，流速为0.5mL/min～1.0mL/min；再将柱中残余的液体挤出；萃取完毕后，将萃取液用氮气流吹至干，然后用初始流动相定容至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
4、仪器检测
液相色谱-串联质谱仪条件
以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：
k)色谱柱：kinetex C18(3.0mm×50mm，2.6μm)柱；
l)柱温：40℃
m)流动相：流动相：A：乙腈，B：用甲酸调节pH为3.5的10mM甲酸铵水溶液，梯度见表1。
n)流速：0.5mL/min
o)进样体积：10μL
表1流动相梯度
| 时间/min | B，V％ | A，V％ |
| 0.2 | 90 | 10 |
| 3 | 5 | 95 |
| 5 | 5 | 95 |
| 5.1 | 90 | 10 |
| 7 | 90 | 10 |
MS条件
扫描方式：ESI+；检测方式：MRM，两对离子对定性，其中一对离子对定量。
离子源温度：550℃；雾化气压力55psi；
电喷雾电压：5500V；气帘气压力：35psi；辅助气压力：55psi。
离子对质谱参数见表2。
表2质谱参数
夹竹桃苷添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为87.0％、92.1％、97.5％；RSD％分别为3.1、3.0、1.0。
夹竹桃苷乙添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为86.9％、91.9％、95.8％；RSD％分别为3.3、3.0、1.0。
夹竹桃苷和夹竹桃苷乙在10～1000ng/mL浓度范围内均有着良好的线性关系。
夹竹桃苷添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.30、2.56、2.30，RSD％(日间)分别为3.29、2.50、4.00。
夹竹桃苷乙添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.42、2.60、2.00，RSD％(日间)分别为3.30、2.20、4.00。
以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为0.5ng/mL，以信噪比3/1计，该方法的最小检出限为0.1ng/mL。
实施例3和实施例4中，回收率的计算、线性关系的得出、以及日内和日间精密度，均采用现有技术中的常规方法：以测得的添加各生物样品中夹竹桃苷或夹竹桃苷乙的峰面积与相同浓度夹竹桃苷或夹竹桃苷乙标准工作溶液峰面积的比值来计算回收率。用测得的夹竹桃苷或夹竹桃苷乙的峰面积(Y)对生物样品待萃取标准液中夹竹桃苷或夹竹桃苷乙浓度(X)求得线性回归，得到回归方程，进而得到线性关系。计算夹竹桃苷或夹竹桃苷乙峰面积的相对标准偏差，得到日内精密度；连续测三天，计算夹竹桃苷或夹竹桃苷乙峰面积三天的相对标准偏差，得到日间精密度。
Claims (9)
1.生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱-串联质谱检验方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；取上述制备好的样品，加入5.0～10.0mL的乙酸乙酯两次，每次振荡10min，离心10min，合并两次有机相，空气浓缩仪上浓缩至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析；
b)样品分析：
色谱柱：kinetex C18；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：A为乙腈，B为用甲酸调节pH为3.5的10mM甲酸铵水溶液；梯度洗脱：0.2min，A为10％，B为90％；3.0min，A为95％，B为5％；5.0min，A为95％，B为5％；5.1min，A为10％，B为90％；7.0min，A为10％，B为90％；流速为0.5mL/min；
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)，两对离子对定性，其中一对离子对定量；电喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；雾化气压力：55psi；气帘气压力：35psi；辅助气压力：55psi。
2.根据权利要求1所述的检验方法，其中a)样品前处理还能够替换为：移取液体样品，加入pH5.8的磷酸盐缓冲液，混匀后，将样品加入固相支撑液液萃取柱中,用正压将样品压入柱中，静置5min，将乙酸乙酯分两次加入到萃取柱中，流速为0.5mL/min～1.0mL/min；再将柱中残余的液体挤出；萃取完毕后，将萃取液用氮气流吹至干，然后用初始流动相定容至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
3.根据权利要求1-2任一所述的检验方法，其中液体样品为血液、尿液、唾液；所述组织样品为肝脏、肾脏。
4.根据权利要求1-2任一所述的检验方法，其中C18柱为3.0mm×50mm，2.6μm柱。
5.根据权利要求1-2任一所述的检验方法，其中取液体样品1.0mL-2.0mL；或者组织样品1.0g-2.0g。
6.根据权利要求2所述的检验方法，其中乙酸乙酯的加入量为8mL。
7.根据权利要求2所述的检验方法，其中pH5.8的磷酸盐缓冲液的加入量为0.5mL。
8.权利要求1-2任一所述的检验方法的应用，其特征在于，应用于生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。
9.根据权利要求8所述的应用，其中生物样品为血、尿、肝、肾。
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|---|---|---|---|---|
| CN103429251A (zh) * | 2010-11-22 | 2013-12-04 | 菲尼克斯生物技术公司 | 用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物治疗神经病症的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| US9011937B2 (en) * | 2010-11-22 | 2015-04-21 | Phoenix Biotechnology, Inc. | Method of treating neurological conditions with extract of Nerium species or Thevetia species |
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2015
- 2015-06-29 CN CN201510370285.2A patent/CN104914193B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103429251A (zh) * | 2010-11-22 | 2013-12-04 | 菲尼克斯生物技术公司 | 用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物治疗神经病症的方法 |
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Also Published As
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