ES2281960T3 - Derivados acilados de betulina y dihidrobetulina, su preparacion y su uso. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula I: o sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde R1 es un carboxiacilo C2-C20 sustituido o insustituido; R2 es un carboxiacilo C2-C20 sustituido o insustituido; y R3 es hidrógeno, halógeno, amino, mono- o di-alquilamino opcionalmente sustituido o -OR4 en donde R4 es hidrógeno, alcanoilo C1-4, benzoilo o carboxiacilo C2-C20 sustituido o insustituido; en donde la línea discontinua representa un doble enlace opcional entre C20 y C29 y siempre que el compuesto no sea: 3, 29-di-maleato de betulina; 3, 29-di-[tetra-cloro-ftalato] de betulina; 3, 29-di-ftalato de betulina; o 3, 29-di-succinato de betulina.
Description
Derivados acilados de betulina y
dihidrobetulina, su preparación y su uso.
La presente invención se refiere a nuevos
derivados sintéticos de betulina y dihidrobetulina y al uso de
dichos derivados como productos farmacéuticos.
Los retrovirus son pequeños virus de RNA de
sentido positivo de una sola hebra. Una partícula retroviral
comprende dos moléculas de RNA de sentido positivo de una sola hebra
idénticas. Su genoma contiene, entre otras cosas, la secuencia de
la DNA polimerasa dependiente de RNA, también conocida como
transcriptasa inversa. Muchas moléculas de transcriptasa inversa se
encuentran en asociación estrecha con el RNA genómico en las
partículas virales maduras. Al entrar en una célula, esta
transcriptasa inversa produce una copia de DNA de doble hebra del
genoma viral, que a continuación se inserta en la cromatina de una
célula huésped. Una vez insertada, la secuencia viral se denomina
un provirus. La integración retroviral depende directamente de
proteínas virales. Los extremos del DNA viral lineal (los LTRs) son
los precursores inmediatos del DNA proviral integrado. Existe una
duplicación característica de tramos cortos del DNA del huésped en
el sitio de integración.
Los genomas virales y los mRNAs de la progenie
se transcriben desde la secuencia proviral insertada mediante RNA
polimerasa de la célula huésped en respuesta a señales reguladoras
transcripcionales en las regiones terminales de la secuencia
proviral, las repeticiones terminales largas, o LTRs. La maquinaria
de producción de proteínas de la célula huésped se usa para
producir proteínas virales, muchas de las cuales son inactivas
hasta que son procesadas por proteasas codificadas viralmente.
Típicamente, las partículas virales de la progenie brotan de la
superficie celular de una manera no lítica. La infección retroviral
no interfiere necesariamente con el ciclo vital normal de una
célula o un organismo infectado. Sin embargo, tampoco es siempre
benigna con respecto al organismo huésped. Aunque la mayoría de las
clases de virus de DNA puede estar implicada en la tumorigénesis,
los retrovirus son el único grupo taxonómico de virus de RNA que son
oncogénicos. Diversos retrovirus, tales como el virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV), que es el agente etiológico
responsable del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en
seres humanos, también son responsables de varias enfermedades muy
inusuales del sistema inmunitario de los animales superiores.
El virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) es
un miembro de los lentivirus, una subfamilia de los retrovirus.
Muchos retrovirus son carcinógenos bien conocidos. No se sabe que el
HIV de por sí provoque cáncer en seres humanos u otros animales,
pero presenta un reto formidable para el huésped. El genoma viral
contiene muchos elementos reguladores que permiten al virus
controlar su velocidad de replicación en células tanto en reposo
como en división. De forma más importante, el HIV infecta e invade
células del sistema inmunitario; rompe el sistema inmunitario del
cuerpo y hace al paciente susceptible a infecciones oportunistas y
neoplasmas. El defecto inmunitario parece ser progresivo e
irreversible, con un alto grado de mortalidad que se aproxima al
100% a lo largo de varios años.
El HIV-1 es trófico y citopático
para linfocitos T4, células del sistema inmunitario que expresan el
antígeno de diferenciación de la superficie celular CD4, también
conocido como OKT4, T4 y leu3. El tropismo viral se debe a las
interacciones entre la glicoproteína de envuelta viral, gp120, y las
moléculas de CD4 de la superficie celular (Dalgleish y otros,
Nature 312:763-767 (1984)). Estas
interacciones, no solo median la infección de células susceptibles
por HIV, sino que también son responsables de la fusión inducida por
virus de células T infectadas y no infectadas. Esta fusión celular
da como resultado formación de sincitios multinucleados gigantes,
muerte celular y agotamiento progresivo de células CD4 en pacientes
con SIDA. Estos sucesos dan como resultado inmunosupresión inducida
por HIV y sus secuelas subsiguientes, infecciones oportunistas y
neoplasmas.
Además de las células T CD4+, la gama de
huéspedes de HIV incluye células del linaje fagocítico mononuclear
(Dalgleish y otros, previamente), incluyendo monocitos sanguíneos,
macrófagos tisulares, células de Langerhans de la piel y células
del retículo dendrítico dentro de los nódulos linfáticos. El HIV
también es neurotrópico, capaz de infectar monocitos y macrófagos
en el sistema nervioso central provocando un daño neurológico
grave. Los macrófagos/monocitos son un reservorio principal de HIV.
Pueden interactuar y fusionarse con células T que tienen CD4,
provocando el agotamiento de las células T y contribuyendo así a la
patogénesis del SIDA.
Se ha producido un progreso considerable en el
desarrollo de fármacos para la terapia de HIV-1 en
los últimos años. Existen ahora 12 fármacos aprobados para su uso en
U.S., que incluyen cinco inhibidores de transcriptasa inversa de
analogía nucleosídica (AZT, 3TC, ddl, ddC y D4T), tres inhibidores
de RT no nucleosídicos (nevirapina, delavirdina y efavirenz) y
cuatro inhibidores de proteasas (saquinavir, ritonavir, indinavir y
nelfinavir). Las combinaciones de estos fármacos resultan
particularmente eficaces y pueden reducir los niveles de RNA viral
a niveles indetectables en el plasma y decelerar el desarrollo de
resistencia viral, con mejoras resultantes en la salud y esperanza
de vida del paciente.
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A pesar de estos avances, existen todavía
problemas con los regímenes de fármacos actualmente disponibles.
Muchos de los fármacos exhiben toxicidades severas, otros presentan
efectos secundarios (por ejemplo, redistribución de grasa) o
requieren programas de dosificación complicados que reducen su
aceptación y limitan con ello la eficacia de los mismos. Suelen
aparecer cepas resistentes de HIV durante largos periodos de tiempo
incluso con una terapia de combinación. El alto coste de estos
fármacos constituye también una limitación para poderlos utilizar
de forma amplia, especialmente fuera de países desarrollados.
Existe todavía la necesidad principal de
desarrollar otros fármacos para soslayar dichos problemas.
Idealmente, estos fármacos deberían dirigirse a fases diferentes del
ciclo de vida viral, deberían incorporarse en el armamentario para
la terapia de combinación y deberían exhibir una toxicidad mínima,
al mismo tiempo que sus costes de producción deberían ser más
bajos.
Previamente, se aislaron ácido betulínico y
ácido platánico como principios anti-HIV de
Syzigium claviflorum. El ácido betulínico y el ácido
platánico exhibían actividad inhibidora contra la replicación de
HIV-1 en células linfocíticas H9 con valores de
EC_{50} de 1,4 \muM y 6,5 \muM, respectivamente, y valores
del T.I. de 9,3 y 14, respectivamente. La hidrogenación de ácido
betulínico daba ácido dihidrobetulínico, que mostraba una actividad
anti-HIV ligeramente más potente con un valor del
EC_{50} de 0,9 y un valor del T.I. de 14 (Fujioka, T., et
al., J. Nat. Prod. 57:243-247 (1994)).
La esterificación de ácido betulínico (1) con
ciertos grupos acilo sustituidos, tales como grupos
3',3'-dimetilglutarilo y
3',3'-dimetilsuccinilo, dio lugar a derivados que
tienen una actividad mejorada (Kashiwada, Y., et al., J.
Med. Chem. 39: 1016-1017 (1996)). En la Patente US
No. 5.659.828 se describen también derivados acilados de ácido
betulínico y ácido dihidrobetulínico que son potentes agentes
anti-HIV.
La Patente US No. 5.468.888 describe derivados
28-amido de lupanos que son descritos como
presentando un efecto citoprotector para células infectadas por
HIV.
La solicitud de Patente japonesa No. J 01
143.832 describe que la betulina (3) y sus
3,28-diésteres son útiles en el campo
anti-cáncer.
"Synthesis of Unsaturated Polyesters
Containing Betulinol Moieties" de Vasnex et al, se refiere
al uso de ciertos 3,28-diésteres de betulina en la
síntesis de polímeros (makroMol. Chem. 188:683-691
(Abril 1987)).
\global\parskip1.000000\baselineskip
"Emulsifierrs of plant origin. II. Formation
of some betulin esters" de Pasich se refiere al uso de ciertos
3,28-diésteres de betulina como agentes
emulsionantes (Herba Polonica
25(2):147-53 (1979)); (CAPLUS
1980:8114).
"Emulsifiers from triterpenoid compounds. Part
VIII. Physical-chemical study of betulin and its
esters" de Pasich se refiere al uso de ciertos
3,28-diésteres de betulina como agentes
emulsionantes. (Farm. Polska 20 (1-2):
9-12 (1965)); (CAPLUS 1965: 433478)
Los tres documentos anteriores describen
diésteres que caen dentro del alcance de la fórmula I, pero que
tienen diferentes usos y han sido desreivindicados del alcance de la
presente invención.
Sigue existiendo la necesidad de disponer de
compuestos que posean una potente actividad anti-HIV
con diferentes modos de acción. Dichos compuestos se necesitan
urgentemente para incorporarse en las terapias
anti-HIV ahora existentes.
Un primer aspecto de la presente invención está
dirigido a nuevos compuestos de fórmula I:
o sus sales farmacéuticamente
aceptables, en
donde
R_{1} es un carboxiacilo
C_{2}-C_{20} sustituido o insustituido;
R_{2} es un carboxiacilo
C_{2}-C_{20} sustituido o insustituido; y
R_{3} es hidrógeno, halógeno, amino, mono- o
di-alquilamino opcionalmente sustituido o -OR_{4}
en donde R_{4} es hidrógeno, alcanoilo C_{1-4},
benzoilo o carboxiacilo C_{2}-C_{20} sustituido
o insustituido;
en donde la línea discontinua representa un
doble enlace opcional entre C20 y C29 y siempre que el compuesto no
sea:
3,29-di-maleato
de betulina;
3,29-di-[tetra-cloro-ftalato]
de betulina;
3,29-di-ftalato
de betulina; o
3,29-di-succinato
de betulina.
Un segundo aspecto de la presente invención está
dirigido a composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más
compuestos de fórmula I y un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable. En estas composiciones se puede incluir también uno o
más compuestos adicionales farmacéuticamente activos.
Los compuestos son útiles como agentes
anti-retrovirales. Por tanto, un tercer aspecto de
la presente invención está dirigido a métodos para inhibir una
infección retroviral en células o tejido de un animal, que
comprende administrar una cantidad eficaz para la inhibición
retroviral de un compuesto de fórmula I. Una modalidad preferida
está dirigida a un método para el tratamiento de un paciente que
padece de una patología de relación retroviral, que comprende
administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz para la inhibición
retroviral de una composición farmacéutica que incluye un compuesto
de fórmula I.
\newpage
Un cuarto aspecto de la presente invención está
dirigido a un método para la preparación de los compuestos de
fórmula I.
Los compuestos de la presente invención tienen
la fórmula general I:
o sus sales farmacéuticamente
aceptables, en
donde
R_{1} es un carboxiacilo
C_{2}-C_{20} sustituido o insustituido;
R_{2} es un carboxiacilo
C_{2}-C_{20} sustituido o insustituido; y
R_{3} es hidrógeno, halógeno, amino, mono- o
di-alquilamino opcionalmente sustituido o -OR_{4}
en donde R_{4} es hidrógeno, alcanoilo C_{1-4},
benzoilo o carboxiacilo C_{2}-C_{20} sustituido
o insustituido;
en donde la línea discontinua representa un
doble enlace opcional entre C20 y C29.
Compuestos preferidos de la presente invención
son aquellos en donde:
R_{1} y R_{2} son cada uno carboxiacilo
C_{2}-C_{20} sustituido o insustituido y R_{3}
es hidrógeno. En una modalidad, el enlace entre C20 y C29 es un
doble enlace. En otra modalidad, el enlace entre C20 y C29 es un
enlace sencillo.
Otro grupo de compuestos preferidos son aquellos
en donde:
R_{1} y R_{2} son cada uno carboxiacilo
C_{2}-C_{20} sustituido o insustituido y R_{3}
es -OR_{4} en donde R_{4} es carboxiacilo
C_{2}-C_{20} sustituido o insustituido. En una
modalidad, el enlace entre C20 y C29 es un doble enlace. En otra
modalidad, el enlace entre C20 y C29 es un enlace sencillo.
Incluso más preferidos son aquellos compuestos
en donde R_{1} y R_{2} son cada uno un grupo carboxialcanoilo
C_{4}-C_{16} que está mono- o
di-sustituido en el átomo de carbono 3'. Dicha
cadena lateral tiene la fórmula:
-C(O)CH_{2}CR'R''(CH_{2})_{b}COOH
en
donde
R' y R'' son cada uno alquilo
C_{1-4}, preferentemente metilo o etilo, o R' es
hidrógeno y R'' es alquilo C_{1-4}, o R' y R''
juntos forman un enlace di-, tri-, tetra- o pentametileno, y b es de
0 a 12, con preferencia de 0 a 4, con suma preferencia 0 o 1.
También se prefieren aquellos compuestos en
donde R_{1} y R_{2} son ambos un grupo carboxialcoxiacetilo
C_{4}-C_{16} de fórmula:
-C(O)CH_{2}O(CH_{2})_{a}COOH,
en donde a es 1 a 10, con
preferencia de 1 a 4, con suma preferencia 1 o
2.
Valores preferidos de R_{3} incluyen:
hidrógeno, halógeno o -OR_{4} en donde R_{4} es preferentemente
hidrógeno;
-C(O)CH_{2}CR'R''(CH_{2})_{b}COOH, en
donde R', R'' y b se definen como anteriormente; o
-C(O)CH_{2}O(CH_{2})_{a}COOH en
donde a se define como anteriormente.
Compuestos particularmente preferidos son
aquellos de fórmula I, en donde:
R_{1} y R_{2} son cada uno de:
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y
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R_{3} es preferentemente hidrógeno, cloro,
bromo o hidroxi o es uno de:
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Se ha comprobado que los derivados acilados de
betulina y dihidrobetulina de acuerdo con la presente invención
tienen una potente actividad anti-HIV. Los grupos
C3-hidroxi, C28-hidroxi y
C20-hexametileno en betulina pueden ser modificados
fácilmente. Se ha comprobado que introduciendo un grupo acilo
C_{2} a C_{20} sustituido o insustituido en los grupos
C3-hidroxi o C28-hidroxi de betulina
y dihidrobetulina se obtienen fácilmente los correspondientes
derivados 3-O-acilo,
28-O-acilo y/o
28-O-acilo.
Los grupos acilo C3 y C28 de los compuestos más
activos tienen grupos dimetilo u oxígeno en la posición C3. Esta
observación sugiere que este tipo de grupo acilo podría ser
importante para lograr una actividad anti-HIV
acentuada.
La invención también está dirigida a un método
para tratar un sujeto infectado con HIV-1 por
administración de al menos uno de los derivados de betulina antes
mencionados, opcionalmente en combinación con cualesquiera de los
productos terapéuticos anti-SIDA conocidos o un
inmunoestimulante.
Otras características, ventajas, modalidades,
aspectos y objetivos de la presente invención estarán claros para
los expertos en las áreas de la técnica pertinente, basándose en la
descripción, las enseñanzas y la guía presentadas aquí.
Se ha descubierto que los compuestos de la
presente invención tienen actividad anti-retroviral,
proporcionó así compuestos y composiciones adecuados para tratar
infecciones retrovirales, opcionalmente con ingredientes
farmacéuticamente activos adicionales, tales como compuestos
anti-retrovirales, anti-HIV y/o
inmunoestimulantes o anticuerpos antivirales o fragmentos de los
mismos.
Por el término "actividad
anti-retroviral" o "actividad
anti-HIV" se entiende la capacidad para inhibir
al menos uno de:
(1) integración de pro-DNA viral
en el genoma de la célula huésped:
(2) unión retroviral a células;
(3) entrada viral en células;
(4) metabolismo celular que permite la
replicación viral;
(5) inhibición de la extensión intercelular del
virus;
(6) síntesis y/o expresión celular de antígenos
virales;
(7) actividad de enzimas codificadas por virus
(tales como transcriptasa inversa, integrasa y proteasas); y/o
(8) cualesquiera acciones patógenas retrovirales
o de HIV conocidas, tales como, por ejemplo, la inmunosupresión.
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Así, cualquier actividad que tienda a inhibir
cualquiera de estos mecanismos es "actividad
anti-retroviral" o "actividad
anti-HIV".
Un derivado de betulina o dihidrobetulina de la
presente invención puede usarse para el tratamiento de una
infección retroviral (por ejemplo, HIV) solo o en combinación con
otros modos de terapia conocidos en la técnica. Tales modos de
terapia pueden incluir quimioterapia con fármacos tales como, pero
no de forma limitativa, al menos uno de AZT, ddC, ddA, ddT, ddI o
cualesquiera otros fármacos o anticuerpos
anti-retrovirales en combinación entre sí, o
asociados con un agente terapéutico basado biológicamente, tal como,
por ejemplo, CD4 soluble, anticuerpos para CD4 y conjugados de CD4
o anti-CD4, o según se presenta adicionalmente
aquí.
Debido a que los derivados de betulina o
dihidrobetulina de la presente invención son relativamente menos
tóxicos o substancialmente atóxicos para células normales, su
utilidad no está limitada al tratamiento de infecciones
retrovirales establecidas. Por ejemplo, un derivado de betulina de
acuerdo con la presente invención puede usarse para tratar
productos sanguíneos, tales como los mantenidos en bancos de sangre.
El suministro de sangre de una nación se prueba actualmente con
respecto a anticuerpos para HIV. Sin embargo, la prueba todavía es
imperfecta y las muestras que dan pruebas negativas todavía pueden
contener virus HIV. Tratar la sangre y los productos sanguíneos con
los derivados de ácido betulina de la presente invención puede
añadir un margen de seguridad adicional destruyendo cualquier
retrovirus que pueda haber quedado sin detectar.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden comprender al menos uno de los derivados de
betulina o dihidrobetulina. Las composiciones farmacéuticas de
acuerdo con la presente invención también pueden comprender
adicionalmente otros agentes anti-virales tales
como, pero no de forma limitativa, AZT (Glaxo Wellcome), 3TC (Glaxo
Wellcome), ddI (Bristol-Myers Squibb), ddC
(Hoffmann-La Roche), D4T
(Bristol-Myers Squibb), abacavir (Glaxo Wellcome),
nevirapine (Boehringher Ingelheim), delavirdine (Pharmacia and
Upjohn), efavirenz (DuPont Pharmaceuticals), saquinavir
(Hoffmann-La Roche), ritonavir (Abbott
Laboratories), indinavir (Merck and Company), nelfinavir (Agouron
Pharmaceuticals), amprenavir (Glaxo Wellcome), adefovir (Gilead
Sciences) e hydroxyurea (Bristol-Meyers
Squibb).
Agentes antivirales adecuados adicionales para
uso óptimo con un derivado de betulina de la presente invención
pueden incluir, pero no de forma limitativa: AL-721
(mezcla de lípidos) preparado por Ethigen Corporation y Matrix
Research Laboratories; Ester metílico de anfotericina B; Ampligen
(RNA desapareado) desarrollado por DuPont HEM Research; anticuerpo
anti-SIDA (Nisshon Food); 1 AS-101
(inmunoestimulante basado en metal pesado); Betaseron
(\beta-interferón) preparado por Triton
Biosciences (Shell Oil); hidroxitolueno butilado; Carrosyn
(polimanoacetato); Castanospermine; Contracan (derivado de ácido
esteárico); Creme Pharmatex (que contiene cloruro de benzalconio)
preparado por Pharmelac; CS-87 (derivado
5-insustituido de Zidovudine); Cytovene
(ganciclovir) preparado por
Syntex Corporation; sulfato de dextrano; D-penicilamina (3-mercapto-D-valina) preparada por Carter-Wallace y Degussa Pharmaceutical; Foscarnet (fosfonoparamiato trisódico) preparado por Astra AB; ácido fusídico preparado por Leo Lovens; glicirricina (un constituyente de la raíz de regaliz); HPA-23 (21-tungsto-9-antimoniato amónico) preparado por Rhone-Poulenc Santé; agente antiviral de virus inmune humano desarrollado por Porton Products Internacional; Ornidyl (eflornitina) preparado por Merrell-Dow; nonoxinol; isetionato de pentamidina (PENTAM-300) preparado por Lipho Med; Peptide T (secuencia octapeptídica) preparado por Peninsula Laboratories; Phenytoin (Warner-Lambert); Ribavirin; Rifabutin (ansamicina) preparado por Adria Laboratories; CD4-IgG2 (ProgenicsPharmaceuticals) u otras moléculas que contienen CD4 o a base de CD4; T-20 (Trimeris); Trimetrexato preparado por Warner-Lambert Company; SK-818 (agente antiviral derivado de germanio) preparado por Sanwa Kagahu; suramina y análogos de la misma preparados por Miles Pharmaceuticals, UA001 fabricado por Ueno Fine Chemicals Industry; y Wellferon (\alpha-interferón) preparado por Glaxo Wellcome.
Syntex Corporation; sulfato de dextrano; D-penicilamina (3-mercapto-D-valina) preparada por Carter-Wallace y Degussa Pharmaceutical; Foscarnet (fosfonoparamiato trisódico) preparado por Astra AB; ácido fusídico preparado por Leo Lovens; glicirricina (un constituyente de la raíz de regaliz); HPA-23 (21-tungsto-9-antimoniato amónico) preparado por Rhone-Poulenc Santé; agente antiviral de virus inmune humano desarrollado por Porton Products Internacional; Ornidyl (eflornitina) preparado por Merrell-Dow; nonoxinol; isetionato de pentamidina (PENTAM-300) preparado por Lipho Med; Peptide T (secuencia octapeptídica) preparado por Peninsula Laboratories; Phenytoin (Warner-Lambert); Ribavirin; Rifabutin (ansamicina) preparado por Adria Laboratories; CD4-IgG2 (ProgenicsPharmaceuticals) u otras moléculas que contienen CD4 o a base de CD4; T-20 (Trimeris); Trimetrexato preparado por Warner-Lambert Company; SK-818 (agente antiviral derivado de germanio) preparado por Sanwa Kagahu; suramina y análogos de la misma preparados por Miles Pharmaceuticals, UA001 fabricado por Ueno Fine Chemicals Industry; y Wellferon (\alpha-interferón) preparado por Glaxo Wellcome.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención también pueden comprender inmunomoduladores.
Imunomoduladores adecuados para el uso óptimo con un derivado de
betulina de la presente invención de acuerdo con la presente
invención pueden incluir, pero no de forma limitativa: ABPP
(Bropririmine); Ampligen (RNA desapareado) DuPont/HEM Research);
anticuerpo anti-interferón \alpha humano (Advance
Biotherapy y Concepts); anticuerpo anti-SIDA
(Nisshon Food); AS-101 (imunoestimulante basado en
metal pesado); ácido ascórbico y derivados del mismo;
interferón-\beta; Carrosyn (polimanoacetato);
Ciamexon (Boehringer-Mannheim); ciclosporina;
cimetidina; CL-246.738 (American Cyanamide);
factores estimulantes de colonias, incluyendo GM-CSF
(Syoz; Genetics Institute); dinitroclorobenceno; HE2000
(Hollis-Eden Pharmaceuticals);
interferón-\alpha;
interferón-gamma; glucano; gammaglobulina
hiperimune (Bayer); IMREG-1 (dializado de
leucocitos) e IMREG-2 (IMREG Corp.); inmutiol
(dietiltiocarbamato sódico) (Institut Merieux); interleuquina 1
(Cetus Corporation; Hoffmann-LaRoche; Imminex;
interleuquina 2
(IL-2) (Chiron Corporation); isoprinosina (inosina pranobex); Krestin(Sankyo); LC-9018 (Yakult); lentinano (Ajinomoto/Yamanouchi); LF-1695 (Fournier); metionina-encefalina (TNI Pharmaceuticals; Sigma Chemicals); Minophagen C; tripéptido muramílico; MTP-PE (Ciba-Geigy); naltrexona ("Trexan" DuPont); Neutropin, inmunomodulador de RNA (Nippon Shingaku); Remune (Immune Response Corporation); Reticulosa (Advanced Viral Research Corporation); shosaikoto y ginseng; factor humoral tímico; TP-05 (Thymopentin, Ortho Pharmaceuticals); Thymosin factor 5 y Thymosin 1; Thymostimulin; TNF (Factor de necrosis tumoral) preparado por Genentech; y preparados de vitamina B.
(IL-2) (Chiron Corporation); isoprinosina (inosina pranobex); Krestin(Sankyo); LC-9018 (Yakult); lentinano (Ajinomoto/Yamanouchi); LF-1695 (Fournier); metionina-encefalina (TNI Pharmaceuticals; Sigma Chemicals); Minophagen C; tripéptido muramílico; MTP-PE (Ciba-Geigy); naltrexona ("Trexan" DuPont); Neutropin, inmunomodulador de RNA (Nippon Shingaku); Remune (Immune Response Corporation); Reticulosa (Advanced Viral Research Corporation); shosaikoto y ginseng; factor humoral tímico; TP-05 (Thymopentin, Ortho Pharmaceuticals); Thymosin factor 5 y Thymosin 1; Thymostimulin; TNF (Factor de necrosis tumoral) preparado por Genentech; y preparados de vitamina B.
El sujeto animal preferido de la presente
invención es un mamífero. Por el término "mamífero" se
entiende un individuo perteneciente a la clase Mammalia. La
invención es particularmente útil en el tratamiento de pacientes
humanos.
El término "tratar" significa administrar a
sujetos un derivado de ácido betulínico o ácido dihidrobetulínico
con propósitos que pueden incluir la prevención, la mejora o la cura
de una patología relacionada con retrovirus.
Se considera que los medicamentos se
proporcionan "en combinación" entre sí si se proporcionan al
paciente simultáneamente o si el tiempo entre la administración de
cada medicamento es tal que permite un solapamiento de la actividad
biológica.
En una modalidad preferida, al menos un derivado
de betulina o dihidrobetulina comprende una sola composición
farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas para
administración de acuerdo con la presente invención pueden
comprender al menos un derivado de betulina o dihidrobetulina de
acuerdo la presente invención en una forma farmacéuticamente
aceptable opcionalmente combinado con un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Estas composiciones pueden administrarse mediante
cualquier medio que alcance sus propósitos pretendidos. Las
cantidades y los regímenes para la administración de un derivado de
betulina de acuerdo con la presente invención pueden ser
determinados fácilmente por los expertos normales en la técnica
clínica del tratamiento de una patología retroviral.
Por ejemplo, la administración puede ser
mediante vía parenteral, tal como subcutánea, intravenosa,
intramuscular, intraperitoneal, transdérmica o bucal.
Alternativamente, o simultáneamente, la administración puede ser
mediante la vía oral. La dosificación administrada depende de la
edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento
previo o simultáneo, si lo hay, la frecuencia del tratamiento y la
naturaleza del efecto deseado.
Las composiciones dentro del alcance de esta
invención incluyen todas las composiciones que comprenden al menos
un derivado de betulina o dihidrobetulina de acuerdo con la presente
invención en una cantidad eficaz para alcanzar su propósito
pretendido. Aunque las necesidades individuales varían, la
determinación de intervalos óptimos de cantidades eficaces de cada
componente está dentro de la experiencia de la técnica.
Dosificaciones típicas comprenden de aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones
preferidas comprenden de aproximadamente 1 a aproximadamente 100
mg/kg de peso corporal del ingrediente activo. Las dosificaciones
más preferidas comprenden de aproximadamente 10 a aproximadamente
100 mg/kg de peso corporal.
La administración terapéutica también puede
incluir administración previa, simultánea, subsiguiente o adjunta
de al menos un derivado de betulina o dihidrobetulina adicional de
acuerdo con la presente invención u otro agente terapéutico, tal
como un agente antiviral o inmunoestimulante. En tal sistema, la
dosificación del segundo fármaco puede ser preferiblemente la misma
que o diferente de la dosificación del primer agente terapéutico.
Preferiblemente, los fármacos se administran en días alternos en las
cantidades recomendadas de cada fármaco.
La administración de un compuesto de la presente
invención también puede incluir opcionalmente terapia previa,
simultánea, subsiguiente o adjunta usando reparadores del sistema
inmunitario o imunomoduladores. Además de los compuestos
farmacológicamente activos, una composición farmacéutica de la
presente invención también puede contener vehículos
farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y
adyuvantes que facilitan el procesamiento de los compuestos activos
en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente.
Preferiblemente, las preparaciones, particularmente las
preparaciones que pueden administrarse oralmente y que pueden
usarse para el tipo de administración preferido, tales como
comprimidos, grageas y cápsulas, y también preparaciones que pueden
administrarse rectalmente, tales como supositorios, así como
soluciones adecuadas para la administración mediante inyección u
oralmente, contienen de aproximadamente 0,01 a 99 por ciento,
preferiblemente de aproximadamente 20 a 75 por ciento de compuesto o
compuestos activos, junto con el excipiente.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente
invención se fabrican de una manera que es conocida de por sí, por
ejemplo, por medio de procedimientos de mezcladura, granulación,
elaboración de grageas, disolución o liofilización convencionales.
Así, pueden usarse preparaciones farmacéuticas para uso oral
combinando los compuestos activos con excipientes sólidos,
opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la
mezcla de gránulos, después de añadir adyuvantes adecuados, si se
desea o es necesario, para obtener comprimidos o núcleos de
grageas.
Excipientes adecuados son, por ejemplo, cargas
tales como un sacárido, por ejemplo, lactosa o sacarosa, manitol o
sorbitol; preparaciones de celulosa y/o fosfatos cálcicos, tales
como fosfato tricálcico o hidrogenofosfato cálcico; así como
aglutinantes tales como pasta de almidón, usando, por ejemplo,
almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de
patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o
polivinilpirrolidona. Si se desea, pueden añadirse agentes
desintegrantes tales como los almidones mencionados previamente y
también carboximetilalmidón, polivinilpirrolidona reticulada, agar
o ácido algínico o una sal de mismo, tal como alginato sódico. Los
adyuvantes son, sobre todo, agentes reguladores del flujo y
lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico o sales del
mismo, tales como estearato magnésico o estearato cálcico, y/o
polietilenglicol. Los núcleos de gragea se proveen de revestimientos
adecuados, que, si se desea, son resistentes a los jugos gástricos.
Para este propósito, pueden usarse soluciones de sacárido
concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco,
polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio,
soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes
orgánicos adecuados. Para producir revestimientos resistentes a los
jugos gástricos, se usan soluciones de preparaciones de celulosa
adecuadas tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de
hidroxipropilmetilcelulosa. Pueden añadirse colorantes o pigmentos
a las comprimidos o los revestimientos de gragea, por ejemplo, para
la identificación o para caracterizar combinaciones de dosis de
compuestos activos.
Otras preparaciones farmacéuticas que pueden
usarse oralmente incluyen cápsulas de ajuste a presión hechas de
gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un
plastificante tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste
a presión pueden contener los compuestos activos en la forma de
gránulos que pueden mezclarse con cargas, tales como lactosa,
aglutinantes, tales como almidones, y/o lubricantes, tales como
talco o estearato magnésico, y, opcionalmente, estabilizantes. En
las cápsulas blandas, los compuestos activos se disuelven o
suspenden preferiblemente en líquidos adecuados, tales como aceites
grasos o parafina líquida. Además, pueden añadirse
estabilizantes.
Preparaciones farmacéuticas posibles que pueden
usarse rectalmente incluyen, por ejemplo, supositorios que
consisten en una combinación de los compuestos activos con una base
para supositorios. Bases para supositorios adecuadas son, por
ejemplo, triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarburos
parafínicos. Además, también es posible usar cápsulas rectales de
gelatina que consisten en una combinación de los compuestos activos
con una base. Posibles materiales de base incluyen, por ejemplo,
triglicéridos líquidos, polietilenglicoles o hidrocarburos
parafínicos.
Formulaciones adecuadas para la administración
parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en
forma soluble en agua, por ejemplo sales solubles en agua. Además,
pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como
suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Disolventes o
vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como
aceite de sésamo, o ésteres de ácido graso sintéticos, tales como
oleato de etilo o triglicéridos. Suspensiones acuosas para inyección
que pueden contener substancias que incrementan la viscosidad de la
suspensión incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica,
sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede
contener estabilizantes.
Una formulación farmacéutica para la
administración sistémica de acuerdo con la invención puede
formularse para la administración enteral, parenteral o tópica. En
efecto, los tres tipos de formulación pueden usarse simultáneamente
para alcanzar la administración sistémica del ingrediente
activo.
Formulaciones adecuadas para la administración
oral incluyen cápsulas de gelatina duras o blandas, grageas,
píldoras, comprimidos, incluyendo comprimidos revestidos, elixires,
suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberación
controlada de las mismas.
Formas de dosificación sólidas además de las
formuladas para la administración oral incluyen supositorios
rectales.
Los derivados de betulina o dihidrobetulina de
la presente invención también pueden administrarse en la forma de
un implante cuyo se combinan con un vehículo de liberación lenta
biodegradable. Alternativamente, los derivados de betulina o
dihidrobetulina de la presente invención pueden formularse como un
parche transdérmico para la liberación continua del ingrediente
activo.
Formulaciones adecuadas para la administración
tópica incluyen cremas, geles, gelatinas, mucílagos, pastas y
pomadas. Soluciones inyectables adecuadas incluyen soluciones
inyectables intravenosas, subcutáneas e intramusculares.
Alternativamente, los derivados de betulina o dihidrobetulina pueden
administrarse en la forma de una solución para infusión o como una
inhalación nasal o un aerosol.
Los compuestos de la presente invención se
preparan mediante reacción de betulina o dihidrobetulina con un
anhídrido adecuado en piridina anhidra, para esterificar la betulina
o dihidrobetulina. La betulina o dihidrobetulina se calentó durante
la noche a 95ºC con seis veces del anhídrido adecuado en piridina
anhidra, en presencia de 4-(dimetilamino)piridina. Cuando la
TLC indicó el consumo completo de material de partida, la solución
de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución de HCl al
10%. La capa de EtOAc se secó entonces sobre MgSO_{4} y se
sometió a cromatografía en columna.
El esquema 1 muestra la vía de síntesis seguida
en el ejemplo 1 para los compuestos en donde R_{1} y R_{2} son
carboxiacilo C_{2}-C_{20} sustituido o
insustituido y R_{3} es hidrógeno.
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Esquema
1
El esquema 2 muestra la vía de síntesis seguida
en el ejemplo 1 para los compuestos en donde R_{1} y R_{2} son
cada uno carboxiacilo C_{2}-C_{20} sustituido o
insustituido y R_{3} es -OR_{4} en donde R_{4} es hidrógeno
o acilo, incluyendo carboxiacilo C_{2}-C_{20}
sustituido o insustituido.
\newpage
Esquema
2
Los compuestos 11 y 14 (cuyas estructuras
aparecen después del ejemplo 1) se prepararon mediante
calentamiento de betulina y del compuesto 13 durante la noche a 40ºC
con dos veces de anhídrido de 3,3-dimetilglutarilo
en piridina anhidra en presencia de 4-(dimetilamino)piridina,
seguido por una elaboración similar a la usada para los compuestos
4-6 y 8-10. Los residuos fueron
purificados por cromatografía en columna.
El compuesto 12 se preparó agitando el compuesto
11 con 1,5 equivalentes de clorocromato de piridinio en
CH_{2}Cl_{2} a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la
mezcla de reacción de color negro se diluyó con Et_{2}O y se
filtró a través de una columna rellena corta. El filtrado se
concentró y se cromatografió [n-hexano:acetona
(4:1)] para proporcionar el compuesto 12 en un rendimiento del
72%.
Se añadió gota a gota una solución de betulina y
trifenilfosfina (4 equivalentes) en THF seco a azodicarboxilato de
dietilo (4 equivalentes) en un baño de hielo. La solución de
reacción se agitó durante 12 horas. Después de separar el THF bajo
vacío, el residuo se cromatografió con
n-hexano:EtOAc (15:1) como eluyente para
proporcionar el compuesto 13.
La evaluación biológica de la inhibición de
HIV-1 se realizó de acuerdo con protocolos
establecidos (Kashiwada, Y., et al., J. Med. Chem.
39:1016-1017 (1996); Hashimoto, F., et al.,
Bioorg. & Med. Chem. 5:2133-2143 (1997)). La
línea de células T, H9, se mantuvo en cultivo continuo con medio
completo (RPMI 1640 con suero vacuno fetal al 10% suplementado con
L-glutamina en CO_{2} al 5% y 37ºC). Solo se
utilizó una parte alícuota de esta línea celular en los
experimentos cuando se encontraba en una fase logarítmica de
crecimiento. Las muestras de ensayo fueron disueltas primeramente
en dimetilsulfóxido. Para la evaluación se emplearon de la forma
usual las siguientes concentraciones finales de fármaco: 100, 20, 4
y 0,8 \mug/ml. Para los agentes activos, se prepararon diluciones
adicionales para posterior ensayo, con el fin de que se pudiera
conseguir un valor EC_{50} exacto (definido a continuación). A
medida que se preparaban las muestras de ensayo, se infectó una
parte alícuota de la línea celular H9 con HIV-1
(aislado IIIB) mientras que otra parte alícuota se infectó a modo
de simulacro con medio completo. El material vírico usado para estos
estudios tenía habitualmente un valor TCID_{50} de 104 unidades
infecciosas/ml. A la primera parte alícuota de células H9 se añadió
la cantidad adecuada de virus para una multiplicidad de infección
(moi) comprendida entre 0,1 y 0,01 unidades infecciosas/célula. La
otra parte alícuota solo recibió medio de cultivo y se emplearon
estas células infectadas en forma simulada para las determinaciones
de la toxicidad (IC_{50}), definido a continuación). Después de 4
horas de incubación a 37ºC y CO_{2} al 5%, se lavaron ambas
poblaciones de células tres veces con medio nuevo y luego se
añadieron a los pocillos adecuados de una placa de 24 pocillos que
contiene las diversas concentraciones del fármaco del ensayo o
medio de cultivo (control infectado positivo/control fármaco
negativo). Además, también se ensayó AZT durante cada experimento
como un control de fármaco positivo. Las placas se incubaron a 37ºC
y en presencia de 5% de CO_{2} durante 4 días. Se recogieron los
sobrenadantes libres de células en el día 4 para su uso en un
ensayo ELISA de antígeno p24. El antígeno p24 es una proteína de
núcleo de HIV y, por tanto, es una medida indirecta del virus
presente en los sobrenadantes. Se determinó la toxicidad efectuando
recuentos de células mediante un Contador Coulter sobre las células
H9 infectadas de forma simulada que habían recibido medio de
cultivo (sin toxicidad), muestra de ensayo o AZT. En el caso de que
una muestra de ensayo presentara capacidad supresiva y no fuese
tóxica, se anotaron sus efectos en los siguientes términos:
IC_{50}, la concentración de muestra de ensayo que resultó tóxica
para el 50% de las células H9 infectadas a modo de simulacro;
EC_{50}, la concentración de la muestra de ensayo
que fue capaz de suprimir la replicación de HIV en un 50%; y el Indice Terapéutico (TI), la relación de IC_{50} a EC_{50}.
que fue capaz de suprimir la replicación de HIV en un 50%; y el Indice Terapéutico (TI), la relación de IC_{50} a EC_{50}.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero
no limitativos, del método y composiciones de la presente
invención. Dentro del espíritu y alcance de la invención quedan
incluidas otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de la
variedad normalmente encontrada de condiciones y parámetros y que
resultan evidentes para el experto en la materia.
Se calentó betulina o dihidrobetulina durante la
noche a 95ºC con seis veces del anhídrido adecuado en piridina
anhidra, en presencia de 4-(dimetilamino)piridina. Cuando la
TLC indicó el consumo completo de material de partida, la solución
de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución de HCl al
10%. La capa de EtOAc se secó entonces sobre MgSO_{4} y se
sometió a cromatografía en columna.
Se prepararon los compuestos 11 y 14 mediante
calentamiento de betulina y del compuesto 13 durante la noche a
40ºC con dos veces de anhídrido de
3,3-dimetilglutarilo en piridina anhidra, en
presencia de 4-(dimetilamino)piridina, seguido por una
elaboración similar a la usada para los ejemplos 4-6
y 8-10. Los residuos fueron purificados por
cromatografía en columna.
Se preparó el compuesto 12 agitando el compuesto
11 con 1,5 equivalentes de clorocromato de piridinio en
CH_{2}Cl_{2} a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la
mezcla de reacción de color negro se diluyó con Et_{2}O y se
filtró a través de una columna rellena corta. El filtrado se
concentró y se cromatografió [n-hexano:acetona
(4:1)] para proporcionar el compuesto 12 en un rendimiento del
72%.
Se añadió gota a gota una solución de betulina y
trifenilfosfina (4 equivalentes) en THF seco a azodicarboxilato de
dietilo (4 equivalentes) en un baño de hielo. La solución de
reacción se agitó durante 12 horas. Después de separar el THF bajo
vacío, el residuo se cromatografió con
n-hexano:EtOAc (15:1) como eluyente para
proporcionar el compuesto 13.
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rendimiento 75% (después de cromatografía en
CHCl_{3}-acetona[19:1]); un polvo amorfo
blanquecino; [\alpha]25_{D}+21,9 (c = 0,2, CHCl_{3});
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0,84, 0,85, 0,86, 0,97,
1,03 (cada 3H, s; 4-(CH_{3})2, 8-CH_{3},
10-CH_{3}, 14-CH_{3}), 1,14
(12H, s; 3'-(CH_{3})2 y 3''-(CH_{3})_{2}),
1,68 (3H, s; 20-CH_{3}), 2,42-2,50
(9H, m, H2-2', 2'', 4', 4'' y H-19),
3,86, 4,30 (cada 1H, d, J = 11,1 Hz; H2-28), 4,49
(1H, dd, J = 5,2, 11,4 Hz; H-3), 4,59, 4,69 (cada
1H, br s; H_{2}-29).
Anal, Calcd para C_{44}H_{70}O_{8}, ½
H_{2}O: C 71,80, H 9,72; encontrado C 71,73, H 9,66.
rendimiento 94% (después de cromatografía en
n-hexano:EtOAc[6:1]); un polvo amorfo
blanquecino; [\alpha]25_{D}+13,2 (c=0,5, CHCl_{3});
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0,85, 0,86, 0,91, 0,98,
1,04 (cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2}, 8- CH_{3}, 10-
CH_{3}, 14- CH_{3}), 1,09 (6H, s; 3'- CH_{3} y 3''- CH_{3}),
1,69 (3H, s; 20- CH_{3}), 2,41-2,57 (9H, m;
H_{2}-2', 2'', 4', 4'' y H-19),
3,87, 4,30 (cada 1H, d, J = 11,0 Hz; H_{2}-28),
4,52 (1H, dd, J = 4,6, 11,0 Hz; H-3), 4,60, 4,70
(cada 1H, br s; H_{2}-29).
Anal, Calcd para C_{46}H_{74}O_{8}, ½
H_{2}O: C 72,31, H 9,89; encontrado C 72,34, H 9,93.
rendimiento 86% (después de cromatografía en
n-hexane:EtOAc [8:1]); un polvo amorfo blanquecino;
[\alpha]25_{D}+13,9 (c=0,99, CHCl_{3});
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0,85, 0,86, (x 2), 0,98,
1,04 (cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2}, 8-CH3,
10-CH_{3}14-CH_{3}), 1,69 (3H,
s; 20- CH_{3}), 2,45 (1H, dt; J= 5,8, 10,6 Hz;
H-19), 2,52-2,59 (8H, m,
H2-2', 2'', 4', y 4''), 3,88, 4,29 (cada 1H, d, J=
11,1 Hz; H_{2}-28), 4,51 (1H, dd, J= 5,0, 10,8
Hz; H-3), 4,60, 4,70 (cada 1H, br s;
H_{2}-29).
Anal, Calcd para C_{48}H_{74}O_{8},
H_{2}O: C 72,33, H 9,61; encontrado C 72,43, H 9,51.
rendimiento 94%; un polvo incoloro;
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0.76, 0.77 (cada 3H, d, J=
3.4 Hz; 20-(CH_{3})_{2}), 0.83, 0.85, 0.96, 0.97, 1.03
(cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2}, 8-CH_{3},
10-CH_{3}, 14-CH_{3}), 3.20
(1H, dd, J = 5.3, 11.0 Hz; H-3), 3.30, 3.79 (cada
1H, d, J = 11.0 Hz; H_{2}-28). Anal. Calcd para
C_{30}H_{52}O_{2}: C 81.02, H 11.78; encontrado C 81.05, H
11.71.
rendimiento 81% (después de cromatografía en
CHCl_{3}-acetona [19:1]); un polvo amorfo;
[\alpha]25_{D}-15,0 (c=0,2, CHCl_{3});
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0,77, 0,84, (cada 3H, d,
J= 6,7 Hz; 20-(CH_{3})_{2}), 0,85, 0,86 (x 2), 0,95,
1,04 (cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2},
8-CH_{3}, 10-CH_{3},
14-CH_{3}), 1,14 (12H, s;
3'-(CH_{3})_{2} y 3''-(CH_{3})_{2}),
2,43-2,54 (8H, m, H_{2}-2', 2'',
4', y 4''), 3,83, 4,29 (cada 1H, d, J = 11,0 Hz;
H_{2}-28), 4,52 (1H, dd, J = 4,8, 11,0 Hz;
H-3).
Anal, Calcd para C_{44}H_{72}O_{8}: C
72,49, H 9,95; encontrado C 72,28, H 9,95.
rendimiento 84% (después de cromatografía en
n-hexano:EtOAc [6:1]); un polvo amorfo blanquecino;
[\alpha]25_{D}-17,6 (c = 0,49,
CHCl_{3}); ^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0,78, 0,85,
(cada 3H, d, J = 6,6 Hz; 20-(CH_{3})_{2}), 0,86 x 2,
0,87, 0,91, 1,05 (cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2},
8-CH_{3}, 10-CH_{3},
14-CH_{3}), 1,09 (6H, s;
3'-CH_{3} y 3''-CH_{3}),
2,40-2,56 (8H, m, H_{2}-2', 2'',
4', y 4''), 3,84, 4,30 (cada 1H, d, J= 11,0 Hz;
H_{2}-28), 4,52 (1H, dd, J = 4,6, 11,0 Hz;
H-3), 4,60, 4,70 (cada 1H, br s;
H_{2}-29).
Anal, Calcd para C_{46}H_{76}O_{8}: C
72,98, H 10,12; encontrado C 73,08, H 10,09.
rendimiento 89% (después de cromatografía en
n-hexano:EtOAc [8:1]); un polvo amorfo blanquecino;
[\alpha]25_{D}-18,2 (c = 0,52,
CHCl_{3}); ^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0,78,0,85,
(cada 3H, d, J= 6,6 Hz; 20-(CH_{3})_{2}), 0,85, 0,87 (x
2), 0,96, 1,05 (cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2},
8-CH_{3}, 10-CH_{3},
14-CH_{3}), 2,52-2,63 (8H, m,
H_{2}-2', 2'', 4', y 4''), 3,84, 4,28 (cada 1H, d,
J = 11,1 Hz; H_{2}-28), 4,51 (1H, dd, J = 5,4,
10,3 Hz; H-3).
Anal, Calcd para C_{48}H_{76}O_{8},
3/2H_{2}O: C 71,34, H 9,85; encontrado C 71,57, H 9,53.
rendimiento 71% (después de cromatografía en
n-hexano:acetona [9:1]); un polvo amorfo
blanquecino; [\alpha]_{D}+12,3 (c=0,49, CHCl_{3});
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0,77, 0,83, 0,98 x 2, 1,04
(cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2}, 8-CH_{3},
10-CH_{3}, 14-CH_{3}), 1,15 (6H,
s; 3'-(CH_{3})_{2}), 1,69 (3H, s,
20-CH_{3}), 2,40, 2,48 (1H, m,
H-19), 2,48 (4H, s; H_{2}-2' y
H_{2}-4), 3,20 (1H, dd, J= 5,2, 10,9 Hz;
H-3), 3,87, 4,29 (cada 1H, d, J = 11,1 Hz;
H_{2}-28), 4,60, 4,70 (cada 1H, br s;
H_{2}-29).
Anal, Calcd para C_{36}H_{60}O_{5},
1/4H_{2}O: C 74,89, H 10,59; encontrado C 74,89, H 10,56.
rendimiento 72% (después de cromatografía en
n-hexano:acetona [4:1]); un polvo amorfo
blanquecino; [\alpha]25_{D}+
32,4 (c=0,33, CHCl_{3}); ^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0,94,1,00, 1,04, 1,08 x 2 (cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2}, 8-CH_{3}, 10-CH_{3} 14-CH_{3}), 1,16 (6H, s; 3'-(CH_{3})_{2}), 1,69 (3H, w; 20-CH_{3}), 2,41-2,54 (7H, m, H_{2}-2, 2', 4', y H-19), 3,87, 4,30 (cada 1H, d, J = 11,1 Hz; H_{2}-28), 4,61, 4,70 (cada 1H, br s; H_{2}-29).
32,4 (c=0,33, CHCl_{3}); ^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0,94,1,00, 1,04, 1,08 x 2 (cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2}, 8-CH_{3}, 10-CH_{3} 14-CH_{3}), 1,16 (6H, s; 3'-(CH_{3})_{2}), 1,69 (3H, w; 20-CH_{3}), 2,41-2,54 (7H, m, H_{2}-2, 2', 4', y H-19), 3,87, 4,30 (cada 1H, d, J = 11,1 Hz; H_{2}-28), 4,61, 4,70 (cada 1H, br s; H_{2}-29).
Anal, Calcd para C_{36}H_{58}O_{5}: C
76,24, H 10,03; encontrado C 76,47, H 10,31.
rendimiento 74% (después de cromatografía en
n-hexano:EtOAc [15:1]);
[\alpha]25_{D}+46.5 (c = 0.2, CHCl_{3});
^{1}H-NMR (CDCl_{3}) 0.90, 0.93, 0.96, 0.99,
1.04 (cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2},
8-CH_{3}, 10-CH_{3},
14-CH_{3}), 1.68 (3H, s;
20-CH_{3}), 2.32-2.53 (2H, m,
H-2a, y H-19), 2.85 (1H, ddd, J=
5.5, 11.1, 11.1 Hz; H-2e), 4.61, 4.74 (cada 1H, br,
s; H,-29), 9.65 (1H, s; H-28).
Anal. Calcd para C_{30}H_{48}O. 1/4H_{2}O:
C 83.95, H 11.39; encontrado C 84.00, H 11.34.
rendimiento 83% (después de cromatografía en
n-hexano: CHCl_{3} [8:2:1]); un polvo amorfo
blanquecino; [\alpha]25_{D}+26,37 (c = 0,49,
CHCl_{3}); ^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 0,84, 0,85,
0,92, 0,97,1,04 (cada 3H, s; 4-(CH_{3})_{2},
8-CH_{3}, 10-CH_{3},
14-CH_{3}), 1,13 (6H, s,
3'-CH_{3})_{2}), 1,67 (3H, s,
20-CH_{3}), 2,39-2,50 (1H, m,
H-19), 2,45, 2,45 (cada 2H, s;
H_{2}-2' y H_{2}-4'), 3,86, 4,28
(cada 1H, d, J = 11,1 Hz; H_{2}-28), 4,58, 4,67
(cada 1H, br, s; H_{2}-29),
5,34-5,37 (2H, m; H-2 y
H-3).
Anal, Calcd para C_{37}H_{60}O_{4}: C
78,12, H 10,63; encontrado C 77,99, H 10,47.
Los compuestos de la presente invención fueron
ensayados respecto a la actividad anti-HIV de
acuerdo con los siguientes procedimientos de ensayo.
La línea de células T, H9, y la línea de células
promonocíticas, U937, se mantuvieron separadamente en cultivo
continuo con medio completo (RPMI 1640 con suero de ternero fetal al
10%) a 5% de CO_{2} y 37ºC. Las líneas celulares se usaron en
experimentos solo cuyo estaban en la fase logarítmica de
crecimiento; mientras que células mononucleares de sangre
periférica (PBMCs) no infectadas se estimularon en primer lugar con
PHA (1 \mug/ml) durante 3 días. Todas las dianas celulares se
incubaron con HIV-1 (aislado IIIB, TCID_{50}
10^{4} UI/ml, a una multiplicidad de infección de
0,01-0,01 UI/célula) durante 1 hora a 37ºC y 5% de
CO_{2}. Las líneas celulares y las PBMCs se lavaron a fondo para
retirar viriones no adsorbidos y se resuspendieron a 4 x 10^{5}
células/ml en medio completo o medio completo con 10% v/v de
interleuquina 2 (IL-2), respectivamente. Partes
alícuotas de 1 ml se pusieron en pocillos de placas de cultivo de 24
pocillos que contenían un volumen igual de compuestos de prueba
(diluidos en el medio de cultivo apropiado). La toxicidad de cada
compuesto se evaluó determinando el número de células no infectadas
expuestas a compuesto que permanecía después de 4 días a 37ºC y 5%
de CO_{2}. Se usó un ensayo de ELISA de antígeno p24 para
determinar los niveles de virus liberados en el medio de los
cultivos infectados con HIV. El ensayo del antígeno p24 usaba un
anticuerpo monoclonal específico anti-p24 de
HIV-1 como el anticuerpo de captura revestido sobre
placas de 96 pocillos. Después de un período de incubación de la
muestra, se usó suero de conejo que contenía anticuerpos para p24
de HIV-1 para etiquetar cualquier p24
"capturado": sobre la superficie de los pocillos de
microvaloración. Se usa a continuación anti-(suero de conejo) de
cabra conjugado a peroxidasa para etiquetar anticuerpos de conejo
específicos para p24 de HIV-1 que se habían
complejado con p24 capturado. La presencia de p24 en las muestras
de prueba se reveló a continuación mediante la adición de substrato.
El corte para el ensayo de ELISA de p24 era 12,5 pg/ml. Se
cuantificó p24 en el medio de cultivo frente una curva estándar que
contenía cantidades conocidas de p24. Se determinaron las
concentraciones eficaz (EC_{50}) e inhibidora (IC_{50}) para la
actividad anti-HIV y la citotoxicidad,
respectivamente.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los compuestos 3-6,
8-14 y AZT fuero examinados respecto a la actividad
anti-HIV en linfocitos H9 como se muestra en la
tabla 1.
La betulina (3) con un grupo hidroxi C28 fue
menos potente que el ácido betulínico (1) con un ácido carboxílico
C-28. Sin embargo, la incorporación de dos ésteres
de 3',3'-dimetilglutarilo a la betulina (3)
proporcionó un compuesto 4 que mostró una actividad
significativamente mejorada y un índice terapéutico notablemente
alto (TI) con valores EC_{50} y TI de 0,00066 \muM y 21,515,
respectivamente. Debido a que el compuesto 4 fue aproximadamente
tres veces más potente y tenía un valor TI mayor que el compuesto 2,
la cadena lateral acilo C-28 condujo a una
actividad mejorada. Cuando la sustitución 3' se cambió a
3'-etil-3'-metilo
(5) o 3',3'-tetrametileno (6), los valores
EC_{50} fueron todavía del orden nanomolar, pero los compuestos
fueron menos activos en comparación con el compuesto 4. La
saturación del doble enlace C20-C29 en el compuesto
4 proporcionó el compuesto 8 y condujo a una caída de 7 y 9 veces
aproximadamente en la actividad y en el TI, respectivamente. De
manera similar, los compuestos dihidro 9 y 10 mostraron una menor
inhibición que los compuestos 5 y 6 insaturados. Debido a que los
compuestos 6 y 10, que contienen un grupo
3',3'-tetrametilenglutarilo, exhibieron la menor
actividad y los valores TI más bajos entre las dos series de
compuestos (4-6 y 8-10,
respectivamente), la aportación de más masa en la posición 3' no
resulta favorable para la actividad anti-HIV.
El compuesto 11 está esterificado únicamente en
la posición C-28 y es 6 veces más potente en
comparación con el compuesto 3. Sin embargo, el compuesto 11 es
mucho menos potente que el compuesto 4, confirmando ello la
importancia de la cadena lateral 3-acilo en relación
con una mayor actividad. La sustitución del grupo
3-hidroxi del compuesto 11 por una cetona hizo
descender aún más la actividad (compárense los compuestos 1 y 12).
La deshidratación del anillo "A" de betulina proporcionó el
compuesto 13 insaturado, el cual tenía un valor EC_{50}
ligeramente mejorado en comparación con el compuesto 3. El producto
acilado, el compuesto 14, exhibió una mayor actividad
anti-HIV, pero quizá debido a la ausencia de una
mitad 3-acilo, el valor EC_{50} del compuesto 14
fue de solo 5,4 \muM.
En conclusión, el derivado diacilado de betulina
4 mostró una actividad anti-HIV notable incluso
mayor que la del derivado de ácido betulínico 2. La cadena lateral
acilo en C-28 podría aumentar aún más la actividad
anti-HIV así como el valor TI, pero la cadena
lateral acilo en C-3 resultó esencial para lograr
una actividad óptima. El grupo
3',3'-dimetilglutarilo proporcionó la mejor
actividad entre los tres diferentes ésteres
3',3'-disustituidos. Además, los derivados de
betulina (4-6) fueron más potentes que sus
correspondientes compuestos de dihidrobetulina
(8-10).
Claims (26)
1. Un compuesto de fórmula I:
o sus sales farmacéuticamente
aceptables, en
donde
R_{1} es un carboxiacilo
C_{2}-C_{20} sustituido o insustituido;
R_{2} es un carboxiacilo
C_{2}-C_{20} sustituido o insustituido; y
R_{3} es hidrógeno, halógeno, amino, mono- o
di-alquilamino opcionalmente sustituido o -OR_{4}
en donde R_{4} es hidrógeno, alcanoilo C_{1-4},
benzoilo o carboxiacilo C_{2}-C_{20} sustituido
o insustituido;
en donde la línea discontinua representa un
doble enlace opcional entre C20 y C29 y siempre que el compuesto no
sea:
3,29-di-maleato
de betulina;
3,29-di-[tetra-cloro-ftalato]
de betulina;
3,29-di-ftalato
de betulina; o
3,29-di-succinato
de betulina.
2. Un compuesto según la
reivindicación 1, en donde R_{1} y R_{2} son cada uno
carboxiacilo C_{2}-C_{20} sustituido o
insustituido y R_{3} es hidrógeno.
3. Un compuesto según la
reivindicación 1, en donde R_{1} y R_{2} son cada uno
carboxiacilo C_{2}-C_{20} sustituido o
insustituido y R_{3} es halógeno o -OR_{4} en donde R_{4} es
hidrógeno o carboxiacilo sustituido o insustituido.
4. Un compuesto según la
reivindicación 1, en donde R_{1} y R_{2} son cada uno un grupo
carboxialcanoilo C_{4}-C_{16} que está
geminalmente sustituido en el átomo de carbono 3'.
5. Un compuesto según la
reivindicación 1, en donde R_{1} y R_{2} tienen cada uno la
fórmula:
-C(O)CH_{2}CR'R''(CH_{2})_{b}
COOH en donde R' y R'' son cada uno alquilo C_{1-4} o R' es hidrógeno y R'' es alquilo C_{1-4}, o bien R' y R'' juntos forman un enlace di-, tri-, tetra- o pentametileno, y p es de cero a doce.
COOH en donde R' y R'' son cada uno alquilo C_{1-4} o R' es hidrógeno y R'' es alquilo C_{1-4}, o bien R' y R'' juntos forman un enlace di-, tri-, tetra- o pentametileno, y p es de cero a doce.
6. Un compuesto según la
reivindicación 5, en donde b es cero a cuatro.
7. Un compuesto según la
reivindicación 6, en donde R' y R'' son cada uno metilo y b es cero
o uno.
8. Un compuesto según la
reivindicación 1, en donde R_{1} y R_{2} tienen cada uno la
fórmula:
-C(O)CH_{2}O(CH_{2})_{a}COOH en
donde a es de cero a doce.
9. Un compuesto según la
reivindicación 1, en donde R_{3} es uno de:
- i.
- hidrógeno;
- ii.
- -C(O)CH_{2}CR'R''(CH_{2})_{b}COOH en donde R' y R'' son cada uno alquilo C_{1-4} o R' es hidrógeno y R'' es alquilo C_{1-4}, o bien R' y R'' juntos forman un enlace di-, tri-, tetra- o pentametileno y b es de cero a doce;
- iii.
- -C(O)CH_{2}O(CH_{2})_{a}COOH en donde a es de cero a doce; o
- iv.
- -OH.
10. Un compuesto según la
reivindicación 1, en donde R_{3} es:
-C(O)CH_{2}CR'R''(CH_{2})_{b}COOH
en donde R' y R'' son cada uno metilo y b es cero o uno.
11. Un compuesto según la
reivindicación 1, en donde R_{1} y R_{2} son cada uno de:
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y
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R_{3} es hidrógeno, hidroxi o es uno de:
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
12. Un compuesto según la
reivindicación 1, en donde R_{1} y R_{2} son cada uno
y R_{3} es
hidrógeno.
\global\parskip1.000000\baselineskip
13. Una composición farmacéutica que
comprende uno o más compuestos según la reivindicación 1 o un
éster, sal, éter, sulfato o glucurónido farmacéuticamente aceptables
de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Una composición farmacéutica según
la reivindicación 13, que comprende además un fármaco seleccionado
entre un agente anti-viral o un agente
inmunoestimulante.
15. Una composición farmacéutica según
la reivindicación 14, en donde dicho agente
anti-viral se elige del grupo consistente en
nevirapina, delavirdina, efavirenz, saquinavir, ritonavir,
indinavir, nelfinavir, amprenavir, hidroxiurea,
interleuquina-2, \gamma-globulina,
amantadina, guanidina hidroxibencimidazol,
interferon-\alpha,
interferon-\beta,
interferon-\gamma, una tiosemicarbazona,
metisazona, rifampin, ribavirin, un análogo de pirimidina, un
análogo de purina, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, un
dideoxinucleósido y ganciclovir.
16. Una composición farmacéutica según
la reivindicación 14, en donde dicho agente
anti-viral es un análogo de nucleósido.
17. Una composición farmacéutica según
la reivindicación 16, en donde dicho análogo de nucleósido se elige
del grupo consistente en AZT, 3TC, ddl, ddC, D4T, abacavir y
adefovir.
18. Una composición farmacéutica que
comprende uno o más compuestos según la reivindicación 5 o un
éster, sal, éter, sulfato o glucurónido farmacéuticamente aceptables
de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. Una composición farmacéutica según
la reivindicación 18, que comprende además un fármaco seleccionado
entre un agente anti-viral o un agente
inmunoestimulante.
20. Una composición farmacéutica según
la reivindicación 19, en donde dicho agente
anti-viral se elige del grupo consistente en
nevirapina, delavirdina, efavirenz, saquinavir, ritonavir,
indinavir, nelfinavir, amprenavir, hidroxiurea,
interleuquina-2, \gamma-globulina,
amantadina, guanidina hidroxibencimidazol,
interferon-\alpha,
interferon-\beta,
interferon-\gamma, una tiosemicarbazona,
metisazona, rifampin, ribavirin, un análogo de pirimidina, un
análogo de purina, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, un
dideoxinucleósido y ganciclovir.
21. Una composición farmacéutica según
la reivindicación 19, en donde dicho agente
anti-viral es un análogo de nucleósido.
22. Una composición farmacéutica según
la reivindicación 21, en donde dicho análogo de nucleósido se elige
del grupo consistente en AZT, 3TC, ddl, ddC, D4T, abacavir y
adefovir.
23. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 22 para inhibir una
infección retroviral en células o tejido de un animal.
24. Una composición farmacéutica según
la reivindicación 23, en donde dicho animal es un ser humano.
25. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 22 para el tratamiento de
un paciente que padece de una patología de relación retroviral.
26. Una composición farmacéutica según
la reivindicación 25, en donde dicha patología de relación
retroviral es una infección por HIV.
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