CN115611837B

CN115611837B - 一种倍半萜内酯衍生物及其制备方法

Info

Publication number: CN115611837B
Application number: CN202211609319.5A
Authority: CN
Inventors: 徐志勇; 吴磊; 谢传奇; 刘云飞; 文学方; 顾震; 彭建军
Original assignee: Institute of Applied Chemistry Jiangxi Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Applied Chemistry Jiangxi Academy of Sciences
Priority date: 2022-12-15
Filing date: 2022-12-15
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2042-12-15
Also published as: CN115611837A

Abstract

本发明公开了一种倍半萜内酯衍生物及其制备方法，将提取完冰片的龙脑樟枝彻底干燥后粉碎，取粉碎后的龙脑樟枝，用有机溶剂浸泡搅拌提取，减压浓缩后得到龙脑樟枝粗提物，将龙脑樟枝粗提物用水溶解，然后加入乙酸乙酯萃取，之后减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位浸膏；对乙酸乙酯萃取部位浸膏进行脱色处理，之后通过硅胶柱层析，梯度洗脱，收集目标馏分，最后经MCI柱，洗脱得到单体化合物。本发明所提取的倍半萜内酯衍生物可用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种倍半萜内酯衍生物及其制备方法

技术领域

本发明属于中药提取技术领域，涉及一种倍半萜内酯衍生物及其制备方法。

背景技术

龙脑樟是目前获取天然冰片的最佳植物选择，但对于提取冰片之后的龙脑樟枝的应用研究很少，利用率极低，造成了一定程度的资源浪费和环境污染，亟待深入研究，对提取冰片之后的龙脑樟枝化学成分进行研究，有望从中挖掘出功能分子，实现龙脑樟资源的多功能产业化，最大化利用植物资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种倍半萜内酯衍生物及其制备方法。

本发明采用的技术方案如下：一种倍半萜内酯衍生物，其结构式如下：

。

一种倍半萜内酯衍生物的制备方法，将提取完冰片的龙脑樟枝干燥后粉碎，取粉碎后的龙脑樟枝，用有机溶剂浸泡搅拌提取，减压浓缩后得到龙脑樟枝粗提物，将龙脑樟枝粗提物用水溶解，然后加入乙酸乙酯萃取，之后采用旋转蒸发仪减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位浸膏；对乙酸乙酯部位浸膏进行脱色处理，之后冷冻干燥，得到脱色后的乙酸乙酯部位样品，通过硅胶柱层析；用二氯甲烷和甲醇按体积比100:0、100:2、100:4、10:1、5:1、3:1梯度洗脱，收集第13-26个馏分，过硅胶柱，再用石油醚和乙酸乙酯按体积比9:1、8:2梯度洗脱，收集第8-19个馏分，再经MCI柱，乙腈洗脱得到单体化合物。

进一步优选，所述有机溶剂是浓度为95%的乙醇溶液。

进一步优选，采用活性炭对乙酸乙酯部位浸膏进行脱色处理。

本发明还提供另一种倍半萜内酯衍生物的制备方法，将提取完冰片的龙脑樟枝干燥后粉碎，取粉碎后的龙脑樟枝，用纯乙酸乙酯浸泡，搅拌提取，之后采用旋转蒸发仪减压浓缩后得到龙脑樟枝乙酸乙酯粗提物，将龙脑樟枝乙酸乙酯粗提物用水溶解，加入等量二氯甲烷萃取，之后进行旋转蒸发、减压浓缩得到二氯甲烷萃取部位浸膏；用活性炭对二氯甲烷部位浸膏进行脱色处理，之后冷冻干燥，得到脱色后的二氯甲烷部位样品，通过硅胶柱层析，用石油醚：乙酸乙酯按体积比9:1、8:2梯度洗脱，收集第9-19个馏分，再经MCI柱，乙腈洗脱得到单体化合物。

本发明还提供了这种倍半萜内酯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的优点是：本发明从龙脑樟枝中提取得到了一种新的倍半萜内酯衍生物Bl-A（Borneolactone A），命名为3-(4-羟基-5a,9-二甲基-8,9-烯-十氢萘并[1,2-b]呋喃)-甲基乙酰胺。

附图说明

图1为化合物Bl-A的主要COSY和HMBC相关图（粗实线代表COSY；箭头代表HMBC）。图2-图7和图9中出现的f1、f2代表化学位移。

图2为化合物Bl-A的氢谱。

图3为化合物Bl-A的碳谱。

图4为化合物Bl-A的Dept谱。

图5为化合物Bl-A的HSQC谱。

图6为化合物Bl-A的COSY谱。

图7为化合物Bl-A的HMBC谱。

图8为化合物Bl-A的HR-MS谱。

图9为化合物Bl-A的NOESY谱。

图10为化合物Bl-A的抗肿瘤实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步详细阐明本发明。

实施例1

原材料采集：龙脑樟枝，由江西樟乡天然冰片有限责任公司提供，经江西省科学院应用化学研究所李雄辉研究员鉴定为龙脑樟枝，样本编号为 PML202102。

提取与分离：将提取完冰片的龙脑樟枝彻底干燥后粉碎，取粉碎后的龙脑樟枝5kg，浓度为95%的乙醇溶液浸泡搅拌提取3次，采用旋转蒸发仪减压浓缩后得到龙脑樟枝乙醇粗提物（1765g），将龙脑樟枝乙醇粗提物用温水打散，加入等量乙酸乙酯萃取，之后进行旋转蒸发、减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位浸膏。用活性炭对乙酸乙酯部位浸膏进行脱色处理，之后冷冻干燥，得到脱色后的乙酸乙酯部位样品（623g），通过硅胶柱层析，用二氯甲烷和甲醇按体积比100:0、100:2、100:4、10:1、5:1、3:1梯度洗脱共收集40个馏分，通过TLC点板特征合并相同馏分得到5个组份，把第1-6个馏分命名为组分L-1, 第7-12个馏分命名为组分L-2，第13-26个馏分命名为组分L-3，第27-34个馏分命名为组分L-4，第35-40个馏分命名为组分L-5，取组分L-3过硅胶柱，石油醚和乙酸乙酯按体积比9:1、8:2梯度洗脱共收集25个馏分，通过TLC点板特征合并相同馏分得到4个亚组份（L-3-1~L-3-4），亚组份L-3-2（第8-19个馏分）再经MCI柱, 35%乙腈洗脱得到单体化合物（25.2g），经一维、二维核磁和质谱鉴定为化合物Bl-A （Borneolactone A）。

化合物Bl-A的结构鉴定：新化合物的氢碳数据如表1，化合物主要的COSY和HMBC相关图见图1，化合物的氢谱、碳谱、DEPT、HSQC、COSY、HMBC、HR-MS谱如图2-图8所示。在紫外灯254nm和高效液相波长254nm下吸收很淡，波长210nm下吸收较为明显。TLC斑点遇碘化铋钾显色剂显橘黄色，可能含氮。氢谱（甲醇）显示峰信号位移分布在δH0.9~5.4ppm，表明至少二十三个氢的存在，其中包括一个烯基氢信号（5.37, s, 1H），三个甲基信号（1.78, s, 3H）、（1.96, s, 3H）和（0.95, s, 3H），碳谱、HSQC 和 Dept 135表明化合物含有十七个碳信号，其中包括四个季碳（可能含有两个羰基碳，其中一个酯羰基碳），六个次甲基[一个连氧次甲基（4.09, dd, J = 11.6, 10.4 Hz, 81.2），一个连羟基次甲基（3.99, td, J = 10.7,4.2 Hz, H-4, 68.5）]，四个亚甲基和三个甲基，与氢谱相呼应，猜测结构可能为倍半萜内酯类衍生物。结合阳离子HR-MS m/z 308.1850 [M+H]+ (C₁₇H₂₆NO₄)，330.1688 [M+Na]+(C₁₇H₂₅NO₄Na)，因此该化合物分子式为 C₁₇H₂₅NO₄，含有六个不饱和度，其中除了三个不饱和度（两个羰基、一个双键）外，剩余三个不饱和度可能归于三个环。再结合COSY和HMBC谱图确定化合物的平面结构：H-6/H-7、H-7/H-8的COSY相关信号，H-15/C-8, C-9, C-9a、H-6/C-9a、H-8/C-9a、H-14/C-6、H-14/C-9a的HMBC相关信号证实了9,5a二取代甲基环己烯的存在；类似地，H-9a/H-1a、H-1a/H-3a、H-3a/H-4、H-4/H-5的COSY相关信号，H-14/C-5、H-5/C-9a、H-5/C-3a、H-4/C-1a、H-3a/C-9a的HMBC相关信号证实了二取代环己烷的存在，并共用5a、9a两个位点，H-3a/H-3、H-3/H-10的COSY相关信号，H-3/C-1a、H-3a/C-10、H-3/C-11、H-10/C-2、H-13/C-11的HMBC相关信号，结合氢碳位移，证实了五元内酯环的存在，并在位点3有酰胺片段。将新化合物命名为Borneolactone A，结构式如下：

命名为：3-(4-羟基-5a,9-二甲基-8,9-烯-十氢萘并[1,2-b]呋喃)-甲基乙酰胺。

化合物Bl-A的空间构型的确定：在NOESY谱图中（如图9），发现H-1a、H-4均与H-14存在明显相关信号，表明H-1a、H-4、H-14位于分子的同一侧（β）。发现H-9a与H-3a、H-6a、H-5b存在明显相关信号，表明H-9a、H-3a、H-6a、H-5b位于分子的另一侧（α）。然而，并未发现H-9a与H-14存在相关信号，表明两个环通过反式稠合形成了反式十氢化萘结构。通过核磁氢谱H-1a裂分为dd峰，耦合常数为11.6和10.4 Hz，表明该质子与H-9a、H-3a均为反偶。即H-9a、H-1a、H-3a均位于直立键a（二面角为180°）。通过耦合常数判断H-10偕偶产生耦合常数14.0 Hz，H-3与H-10耦合产生耦合常数12.3 Hz。在NOESY谱图中，并未发现H-3与H-3a存在相关信号，表明H-3与H-3a不在同一平面。综上所述；该化合物的空间结构确定为：

实施例2

化合物Bl-A的二次提取与分离：针对已经鉴定出来的化合物的性质（溶解性、极性大小、紫外吸收），改变提取分离方法，以提高化合物Bl-A的产率。将提取完冰片的龙脑樟枝干燥后粉碎，取粉碎后的龙脑樟枝5 kg，用纯乙酸乙酯浸泡，搅拌提取3次，旋转蒸发，减压浓缩后得到龙脑樟枝乙酸乙酯粗提物（1032g），将龙脑樟枝乙酸乙酯粗提物用温水打散，加入等量二氯甲烷萃取，之后采用旋转蒸发仪减压浓缩得到二氯甲烷萃取部位浸膏。用活性炭对二氯甲烷部位浸膏进行脱色处理，之后冷冻干燥，得到脱色后的二氯甲烷部位样品（958g），通过硅胶柱层析，用石油醚：乙酸乙酯按体积比9:1, 8:2梯度洗脱，共收集35个馏分，通过TLC点板特征合并相同馏分得到6个组份，把第1-4个馏分命名为组分L’-1, 第5-8个馏分命名为组分L’-2，第9-19个馏分命名为组分L’-3，第20-25个馏分命名为组分L’-4，第26-31个馏分命名为组分L’-5，第32-35个馏分命名为组分L’-6，组分L’-3再经MCI柱,35%乙腈洗脱得到单体化合物（26.3g），产率由0.504%增加到0.526%。

化合物Bl-A的抗肿瘤实验：抗肿瘤实验使用 MTT 法测试，经超净工作台，96 孔板，酶标仪和 CO₂细胞培养箱等完成，供试细胞为 HepG2，对照组只添加DMSO，实验组包括化合物Bl-A浓度分别为10μM、20μM、40μM的低剂量组、中剂量组、高剂量组。待测样品用DMSO 溶解， MEM培养基（不含胎牛血清）配制成浓度梯度 0μM、10μM、 20μM、40μM；待细胞长至约铺满培养皿的70%，加入0.25%胰蛋白酶放置在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中消化2-3min，取出，轻轻吸走胰蛋白酶，加入含有10%胎牛血清的 MEM 培养基，终止消化，小心用吸管吹打细胞，形成单细胞悬液，再用移液枪吸入 15mL 离心管中，在离心转速为1000rpm的条件下离心5min，小心弃掉上清液，用 MEM 培养基配制细胞悬液至 1×10⁵-3×10⁵个/mL，在细胞培养箱中过夜，待用。取出96 孔板细胞，弃掉之前的培养液，加入100μL不同浓度的待测样品培养液，继续培养一天；取出之后再弃培养液，用 PBS 清洗，并再加入新鲜 MEM培养基后，加入20μL 5mg/mL 的 MTT 溶液（PBS 配制），培养四小时后形成紫色结晶；再缓缓弃掉上清液，每孔加入200μL DMSO，570nm波长条件下测其OD值，抑制率%=（无待测样-含待测样）OD值/无待测样OD *100。实验结果表明化合物Bl-A对肿瘤细胞HepG2表现抑制作用，化合物Bl-A在浓度为40μM时，抑制率为36%，如图10所示。图10中的*代表低剂量组、中剂量组、高剂量组与对照组比较具有显著性差异，p<0.05。

以上所述实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种倍半萜内酯衍生物，其特征在于，结构式如下：

。

2.一种如权利要求1所述的倍半萜内酯衍生物的制备方法，其特征在于，将提取完冰片的龙脑樟枝干燥后粉碎，取粉碎后的龙脑樟枝，用浓度为95%的乙醇溶液浸泡搅拌提取，减压浓缩后得到龙脑樟枝粗提物，将龙脑樟枝粗提物用水溶解，然后加入乙酸乙酯萃取，之后采用旋转蒸发仪减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位浸膏；对乙酸乙酯部位浸膏进行脱色处理，之后冷冻干燥，得到脱色后的乙酸乙酯部位样品，通过硅胶柱层析；用二氯甲烷和甲醇按体积比100:0、100:2、 100:4、10:1、5:1、3:1梯度洗脱，收集第13-26个馏分，过硅胶柱，再用石油醚和乙酸乙酯按体积比9:1、8:2梯度洗脱，收集第8-19个馏分，再经MCI柱，乙腈洗脱得到所述倍半萜内酯衍生物。

3.根据权利要求2所述的倍半萜内酯衍生物的制备方法，其特征在于，采用活性炭对乙酸乙酯部位浸膏进行脱色处理。

4.一种如权利要求1所述的倍半萜内酯衍生物的制备方法，其特征在于，将提取完冰片的龙脑樟枝干燥后粉碎，取粉碎后的龙脑樟枝，用纯乙酸乙酯浸泡，搅拌提取，之后采用旋转蒸发仪减压浓缩后得到龙脑樟枝乙酸乙酯粗提物，将龙脑樟枝乙酸乙酯粗提物用水溶解，加入等量二氯甲烷萃取，之后采用旋转蒸发仪减压浓缩得到二氯甲烷萃取部位浸膏；用活性炭对二氯甲烷部位浸膏进行脱色处理，之后冷冻干燥，得到脱色后的二氯甲烷部位样品，通过硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯按体积比9:1、8:2梯度洗脱，收集第9-19个馏分，再经MCI柱，乙腈洗脱得到所述倍半萜内酯衍生物。

5.如权利要求1所述的倍半萜内酯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。