CN112358515B - 一种柚皮素(4-o-甲基)葡萄糖苷类化合物在制备抗炎或降脂药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柚皮素(4‑O‑甲基)葡萄糖苷类化合物在制备抗炎或降脂药物中的应用,在生物活性测试中,该化合物表现出下调或抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞产生的某些炎性因子的产生,例如:一氧化氮(NO);也表现出下调或抑制小鼠3T3‑L1前体脂肪细胞增殖和显著降低细胞分化过程中产生的脂质小滴数量。其效果优于苷元,且与苷元相比,该化合物的水溶性显著增强;与葡萄糖苷相比,该化合物转化效率较高,产量更高;与葡萄糖苷相比,该化合物毒性减弱,具有更广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物领域,具体涉及柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类化合物在抗炎或降脂 药物中的用途。
背景技术
柚皮素(Naringenin)是一种常见的天然黄酮类植物次生代谢产物,在柚皮中主要以 苷类形式存在,比其他类黄酮化合物的分布更受限制,并且对柑橘类水果具有特异性。柚皮素被认为对人体健康具有多种生物学和药理活性,例如抗氧化、抗炎症、降血脂、 抑菌、抑制肿瘤生长及保护肝细胞、抑制血小板凝结等活性,因此受到人们的广泛关 注,可应用于医药、食品等领域。然而,柚皮素仅微溶于水,且在哺乳动物体内的代谢 稳定性差,容易受到来自生物体及外界的多种因素的影响,导致自身降解,活性降低, 极大地阻碍了它的应用。葡萄糖基化和甲基化是生物体内常见的修饰反应,可以改变化 合物的水溶性、极性、稳定性等理化性质,从而影响其生物有效性,获得更有价值的活 性化合物。
目前已知的柚皮素糖基化产物有葡萄糖苷、鼠李糖苷、芸香糖苷、新橙皮糖苷等。据研究,糖苷类柚皮素比起其苷元,抗氧化的活性显著减弱。柚皮素-7-O-葡萄糖苷具有 抗糖尿病和/或抗肥胖作用,可防止心肌细胞凋亡并诱导内源性抗氧化酶抵抗阿霉素 (DOX)毒性,也可通过稳定细胞膜和减少活性氧(ROS)的产生来防止心肌细胞受到 DOX诱导的毒性。柚皮素7-O-芸香糖苷在啮齿动物模型中具有多种有益作用,包括:降 糖,降血脂,降压和抗血栓作用,改善NO介导的内皮功能,脂肪肝减少,中风模型的组 织学特征改善和认知结果改善等。4',5,7-三羟基黄烷酮-7-O-鼠李糖苷或柚皮素-7-O-鼠李 糖苷是葡萄柚(Citrus paradisi)中的主要黄烷酮(占干重的10%),是造成柚子汁苦味的 原因。据相关报道,柚皮素(100或200mg/kg,口服)大大延迟了小鼠对热板和甩尾装 置产生的热刺激的反应时间,并减少了乙酸引起的小鼠扭体反应。此外,柚皮素显着降 低了角叉菜胶引起的大鼠足水肿,显示出其抗炎作用。但柚皮素衍生物的抗炎活性少有 报道。
此外,柚皮素葡萄糖苷也显示出一定的降脂和降糖活性,例如柚皮素-7-O-葡萄糖苷 具有抗糖尿病和/或抗肥胖作用,可防止心肌细胞凋亡并诱导内源性抗氧化酶抵抗阿霉素 (DOX)毒性,也可通过稳定细胞膜和减少活性氧(ROS)的产生来防止心肌细胞受到 DOX诱导的毒性,但其甲基糖苷化衍生物降脂活性却少有报道。
发明内容
本发明用玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)ACCC 37814原菌进行柚皮素(化合物 1)饲喂,通过HPLC-HRMS检测柚皮素衍生物。通过增大发酵规模,获取足量提取物后 进行分离、纯化,得到柚皮素7-O-β-D-(4-O-甲基)葡萄糖苷(化合物1a)、柚皮素4'-O-β- D-(4-O-甲基)葡萄糖苷(化合物1b)、柚皮素4'-O-β-d葡萄糖苷(化合物1c)和柚皮素4', 7-O-β-D-(4-O-甲基)葡萄糖苷(化合物1d)三种柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷和一种柚皮 素葡萄糖苷衍生物,其中化合物1b和1d的结构未见报道。溶解度实验结果显示:化合 物1b在水、甲醇、乙醇等多种常用溶剂中的溶解度要明显高于柚皮素(化合物1)本 身,并且与山奈酚葡萄糖苷类化合物1c的溶解度相当。转化率实验结果显示:化合物1b 转化率比化合物1c高,说明柚皮素在饲喂玫烟色棒束孢原菌培养液后的衍生物化合物1b 比1c产量更高。另外,毒性实验结果显示:化合物1b的毒性明显弱于对应的柚皮素葡萄 糖苷类化合物1c。
其化学结构如式(1)所示:
因此,本发明的目的是提供一种水溶性好、毒性低的柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类 化合物即化合物1b作为抗炎或降脂药物中的应用。因而也提供含有上述化合物的抗炎或 降脂药物。优选的,抗炎是指下调或抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞产生的某些炎性因子的产生,例如:一氧化氮(NO);降脂是指下调或抑制小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖和显 著降低细胞分化过程中产生的脂质小滴数量。
本发明通过实验表明具有有益的技术效果。具体来说,主要评估了柚皮素(化合物1)、柚皮素葡萄糖苷类化合物1c以及柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类化合物1a、1b、1d对 小鼠RAW264.7巨噬细胞NO释放量的影响,以及对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖和细 胞分化的影响。结果显示:与LPS组相比,化合物1b、1c在实验浓度范围内(12.5-200 μg/mL)均能明显抑制或下调NO的释放(P<0.05),且NO下调量与浓度呈现明显的剂量 依赖关系,具有较强的抗炎活性,其中化合物1b在细胞毒性允许范围内,25-200μg/mL 浓度下表现出不同程度的抗炎活性,100ug/ml剂量下NO释放量与Control组相比无明显 差异(P>0.05),抗炎效果高达97%(P<0.05);化合物1c在细胞毒性允许范围内,25- 200μg/mL浓度下表现出不同程度的抗炎活性,100ug/mL剂量下NO释放量与Control组 相比无明显差异(P>0.05),抗炎效果达35%(P<0.05)。另外,本发明通过体外细胞毒活 性实验评估了化合物1、1a-1d对哺乳动物细胞小鼠3T3-L1脂肪细胞的细胞活性抑制作 用。结果显示:与Control组相比,加入12.5-100μg/mL的化合物1和1b时,细胞活力变 化不显著(P>0.05);与化合物1相比,化合物1b在12.5-100μg/mL试验浓度范围内对 3T3-L1脂肪细胞活力影响较小,说明化合物1b在100ug/mL剂量下对人体具有良好的安 全性。因此,化合物1b有望开发成绿色环保、高效低毒的抗炎药物,具备广泛的应用前 景。
细胞增殖结果显示:与Control组相比,化合物1、1-1d在试验浓度范围内,表现出不同降脂活性,其中化合物1b在细胞毒性允许范围内,100ug/ml剂量下细胞增殖抑制效 果最强,高达67%(P<0.05)。细胞诱导分化结果显示:在细胞毒性允许范围内,100 μg/mL浓度下化合物1b在干预分化中的3T3-L1细胞8天后,能明显下调细胞内脂质小滴 的数量。另外,本发明通过体外细胞毒活性实验评估了化合物1、1a-1d对哺乳动物细胞 小鼠3T3-L1前体脂肪细胞的细胞活性抑制作用。结果显示:与Control组相比,化合物 1、1-1d在试验浓度范围内,对细胞活力影响不同,其中化合物1b在试验浓度范围内 (12.5-100μg/mL)对细胞活力影响不显著(P>0.05),说明化合物1b在100ug/mL剂量 下对人体具有良好的安全性。因此,化合物1b有望开发成绿色环保、高效低毒的降脂药 物,具备广泛的应用前景。
附图说明
图1柚皮素生物转化产生1种糖基化衍生物和3种糖甲基化衍生物的色谱图。
图2柚皮素生物转化产生1种糖基化衍生物和3种糖甲基化衍生物的质谱图。
图3柚皮素1及其糖苷化合物对3T3-L1细胞的毒性作用,其中,(a):化合物1的 细胞毒性;(b):化合物1a的细胞毒性;(c):化合物1b的细胞毒性;(d):化合物1c的 细胞毒性;(e):化合物1d的细胞毒性。蓝色和红色折线分别代表空白(Control)组和样 品组毒性趋势。
图4柚皮素1及其糖苷化合物对RAW264.7细胞释放NO的影响,其中,(a)化合 物1a对NO释放量的影响;(b)化合物1b对NO释放量的影响;(c)化合物1c对NO 释放量的影响;(d)化合物1d对NO释放量的影响。
图5柚皮素1及其糖苷化合物对对3T3-L1细胞增殖的影响,其中,(a)化合物1对3T3-L1细胞增殖的影响;(b)化合物1a对3T3-L1细胞增殖的影响;(c)化合物1b对 3T3-L1细胞增殖的影响;(d)化合物1c对3T3-L1细胞增殖的影响;(e)化合物1d对 3T3-L1细胞增殖的影响。蓝色和红色折线分别代表空白(Control)组和样品组的细胞增 殖趋势。
图6油红O染色图,柚皮素1及其糖苷化合物对3T3-L1细胞分化的影响,脂质油滴呈橘红色,Adipocyte(对照组),化合物1b-100(100μg/mL的化合物1b)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明,但并不是对本发明的限制,仅仅作示例说明。
实施例1玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea ACCC 37814)对柚皮素的甲基糖基化修 饰
1.1仪器与材料
实验中所用菌株:玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)ACCC 37814来源于中国农业 微生物菌种保藏管理中心(ACCC)。化合物:购自上海源叶生物技术有限公司(中国上海)。实验所用试剂均为国产分析纯产品。培养基:真菌培养基为马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA,Difco,Sparks,MD,USA)培养基和马铃薯葡萄糖肉汤(PDB,Difco,Sparks, MD,USA)培养基,若制固体培养基,加入2%琼脂粉。
高效液相色谱(安捷伦公司,Agilent 1260Infinity II HPLC和Agilent1290Infinity II HPLC),C18色谱柱(安捷伦公司,Poroshell 120SB-C18,2.7μm,4.6mm×150mm和 Zorbax SB-C18,1.8μm,2.1×50mm)。质谱(安捷伦公司,Agilent QTOF 6530)。旋转蒸发 仪(BUCHI公司,DL-400);循环冷却器(郑州长城科工贸有限公司)。
实施例中其它未注明具体条件的实验方法,按照常规方法进行。
1.2实验方法
首先将适量的玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)ACCC 37814菌液均匀的涂在马铃 薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上,25℃下培养7~10d然后分别用无菌水(0.1%Triton-X100)充满平板,收集孢子,各菌株孢子液浓度稀释至106/mL。对于高效黄酮类 化合物的筛选实验,将收集到的浓度为106/mL的孢子接种到装有50mL马铃薯葡萄糖肉 汤(PDB)液体培养基的100mL锥形瓶中。将烧瓶置于25℃的旋转摇床中,并以220 rpm的速度摇荡3d。之后,在各烧瓶中分别加入柚皮素1底物0.5mg(10μL溶于 DMSO的化合物溶液,浓度为50mg/mL),并将烧瓶在相同条件下再保持4d。在相同条 件下各孵育两个对照:(1)添加无底物DMSO溶液的玫烟色棒束孢发酵液;(2)添加含 有底物的DMSO溶液的无微生物PDB培养基。相同孵育条件下各做三个重复。发酵7d 后对所有发酵液进行产物分析。
发酵产物用乙酸乙酯提取,乙酸乙酯与发酵液的比例为1:1,即用50mL的乙酸乙酯提取发酵产物;旋转蒸发仪回收乙酸乙酯干燥萃取物,1mL甲醇复溶萃取物。
将上述所得发酵产物经高速离心后用通过高效液相色谱(HPLC)和高分辨质谱(HRMS/MS)检测。1260HPLC检测条件如下:采用乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,梯 度洗脱条件:10-95%的乙腈-水洗脱20min,95%的乙腈-水洗脱10min,5min内逐渐降 到10%乙腈-水,10%乙腈-水洗脱5min,流速为0.5mL/min。检测波长为300nm。 HPLC-HRESIMS光谱在Agilent 1290Infinity II HPLC和Agilent QTOF 6530仪器上获得, 该仪器分别使用3.6kV和40-150V的毛细管和锥形电压在负离子模式下操作。为了进行 精确的质量测量,每次使用质核比(m/z)150-1900范围内的标准校准混合物(Agilent) 校准仪器。1290HPLC检测条件如下:10-50%的乙腈-水线性梯度洗脱4min,50-95%的 乙腈-水线性梯度洗脱4min,95%的乙腈-水洗脱2min,1min内降至10%的乙腈-水,流 速为0.35mL/min,检测波长为300nm。
1.3实验结果与分析
HPLC分析结果显示:饲喂原料柚皮素几乎完全转化生成得到四种衍生物,编号为1a,1b,1c,1d,对四种糖苷产物的转化率进行统计,分别为30.9%、39.9%、13.6%、 8.3%,说明柚皮素在饲喂玫烟色棒束孢原菌培养液后的衍生物化合物1b比1c产量更 高。通过HRMS分析发现,转化后的四个峰中,峰1c化合物的分子量比柚皮素的分子量 多出162amu,推测为葡萄糖基化产物,峰1a、1b化合物的分子量比柚皮素的分子量多 出176amu,推测为甲基葡萄糖基化产物,峰1d化合物的分子量比柚皮素的分子量多出 352amu,推测为二甲基葡萄糖基化产物。通过HRMS/MS分析发现,当碰撞能量为15 eV时,峰1a、1b、1d化合物的二级质谱基峰均为柚皮素[M+H]-的分子量,并未发现柚 皮素甲基化后[M+H]-的分子量,说明糖基与甲基同时脱落,因此甲基修饰极有可能在糖 基的羟基上,而非柚皮素的羟基上。
发酵产物色谱图及质谱图见图1和图2。
实施例2化合物1a-1d的提取分离及结构鉴定
2.1仪器与材料
实验室中用的色谱纯水、色谱乙腈、分析纯乙酸乙酯、色谱或普通纯甲醇、二氯甲烷等购自Fisher(美国)公司;柱层析硅胶(100~200目)购自青岛海洋化工厂公司。 BUCHIDL-400型旋转蒸发仪,由瑞士BUCHI公司生产。循环冷却器由郑州长城科工贸 有限公司生产。半自动制备液相色谱仪为Agilent 1260Infinity II,C18色谱柱为Eclipse XDB-C18,5μm,9.4×250mm。使用装有Poroshell 120SB-C18反相柱(2.7μm,4.6 mm×150mm)的Agilent1260Infinity II分析HPLC仪器进行样品纯度检测,需无杂峰, 纯样品以备HMBC-NMR检测。检测条件如下:采用乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,10- 95%的乙腈-水洗脱20min,95%的乙腈-水洗脱10min,5min内逐渐降到10%乙腈-水, 10%乙腈-水洗脱5min,流速为0.5mL/min,检测波长为300nm。将纯化得到的各目标 产物在Agilent 600DD2光谱仪上记录1H-,13C-,HSQC-和HMBC-NMR光谱。化学位移 值(δ)以百万分率(ppm)给出,耦合常数(J值)以Hz为单位。化学位移参考 DMSO-d6的残余溶剂峰。
2.2实验方法
发酵培养3L的柚皮素1发酵上清液用等体积的乙酸乙酯萃取三次,用旋转蒸发仪蒸 干,得到1.4448g的粗提物Ⅰ。使用硅胶柱色谱对Ⅰ进行分离。使用二氯甲烷-甲醇进行 梯度洗脱,得到五种级分(组分A,二氯甲烷,100%;组分B,二氯甲烷,98%;组分 C,二氯甲烷,95%;组分D,二氯甲烷,93%;组分E,二氯甲烷,90%;v/v)。通过 LC-MS仪器分析这些级分以检测潜在的产物。分析可知,化合物1的目标产物在D级 分。通过Agilent 1260InfinityII半制备HPLC进一步分离纯化,使用乙腈-水(25:75, v/v)作为洗脱液,以2mL/min的流速分离提取物Ⅰ的D级分,得到2.3mg化合物1a, 保留时间为23.2min;3.2mg化合物1b,保留时间为27.3min;6.5mg化合物1c,保留 时间为18.5min;1.5mg化合物1d,保留时间为13.4min。
2.3实验结果与分析
通过解析高分辨质谱、一维和二维核磁共振谱,鉴定了化合物1a-1d的结构如式(1)所示。其中,化合物1a和化合物1c分别为已报道的柚皮素7-O-β-D-(4-O-甲基)葡 萄糖苷和柚皮素4'-O-β-D葡萄糖苷,化合物1b为柚皮素4'-O-β-D-(4-O-甲基)葡萄糖苷, 化化合物1d为柚皮素4',7-二-O-β-D-(4-O-甲基)葡萄糖苷,化合物1b、1d结构未见报 道。化合物1a-1d的结构鉴定数据如下:
化合物1a:高分辨质谱m/z 447.1289[M-H]-,calcd.447.1291,分子式为C22H24O10;1H NMR(600MHz)和13C NMR(150MHz)数据归属如表1所示。
化合物1b:高分辨质谱m/z 447.1294[M-H]-,calcd.447.1291,分子式为C22H24O10;1H NMR(600MHz)和13C NMR(150MHz)数据归属如表1所示。
化合物1c:高分辨质谱m/z 433.1122[M-H]-,calcd.433.1135,分子式为C21H22O10;1H NMR(600MHz)和13C NMR(150MHz)数据归属如表1所示。
化合物1d:高分辨质谱m/z 623.1950[M-H]-,calcd.623.1976,分子式为C29H36O15;1H NMR(600MHz)和13C NMR(150MHz)数据归属如表1所示。
表1和表2是化合物1a-1d的核磁共振数据(测试溶剂为氘代二甲基亚砜)
表1化合物1a和1b的核磁数据(δin ppm,J in Hz)
Table 11H-(600MHz)and 13C-NMR(150MHz)Data of 1a and 1b in DMSO-d6
表2化合物1c和1d的核磁数据(δin ppm,J in Hz)
Table 21H-(600MHz)and 13C-NMR(150MHz)Data of 1c and 1d in DMSO-d6
实施例3柚皮素及其糖苷类化合物的溶解性测试
3.1实验目的
确定糖甲基化对柚皮素在不同溶剂中的溶解度影响。
3.2实验方法
分别称取柚皮素与化合物1b、1c各0.5mg,置于25℃±2℃500uL的不同溶剂 中,每隔5min强力振摇30s;观察30min内的溶解情况,如看不见溶质颗粒或液滴 时,即视为完全溶解。所选取溶剂有蒸馏水,甲醇,乙醇等。
3.3实验结果及分析
柚皮素及其糖基化衍生物(化合物1c)、糖甲基化衍生物(化合物1b)在不同溶剂中的溶解性如表3所示。
表3柚皮素、化合物1b和1c在不同溶剂中的溶解性
注:不溶-;微溶-+;部分溶解+;大部分溶解++;完全溶解+++
如表3所示,糖基化和糖甲基化与修饰前相比,均能显著提高柚皮素的溶解性,但糖 基化和糖甲基化产物溶解性无明显差异。
实施例4柚皮素及其糖苷类化合物的细胞毒作用
4.1仪器与材料
PerkinElmer Lambda 25紫外分光光度计为美国Bio-RAD公司;3308型二氧化碳恒温 细胞培养箱为Thermo公司;SW-CJ-1F超净工作台为苏州净化设备公司;DMIL倒置显微镜为LEICA公司。
细胞:3T3-L1细胞(小鼠前体脂肪细胞)、小鼠单核RAW264.7巨噬细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。
高糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)均购自 Sigma-aldrich贸易有限公司;MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购于美国BD公司; 96孔细胞培养板、细胞培养瓶(75cm2)、移液管(5mL、10mL、25mL、50mL)、离 心管、枪头等均购于美国NUNC公司。
4.2实验方法
取对数生长期的3T3-L1细胞加入96孔板中,每孔加100uL含有约20000个细胞, 培养24h,待贴壁。
用PBS清洗两次,再加入不同浓度的1,1a-1d,以未加样品的细胞孔作为空白对照组,每组设三个平行孔,置于37℃含5%CO2的细胞培养箱内静置培养24h。
24h后,取出96孔板,每孔加入10uL MTT(5mg/mL)后继续培养4h。
移除孔内液体,用PBS清洗两次并向每孔中加入DMSO代替培养基静置1h。
使用PerkinElmer Lambda 25紫外分光光度计测定各孔溶液在570nm波长处的吸光度 值(OD),根据吸光度值计算细胞存活率,用细胞毒性反应细胞活性。
细胞毒性(%)=(1-样品吸光度/control组吸光度)×100
以上实验,各做三个重复。所有操作均在无菌超净台进行。
4.3实验结果与分析
由表4和图3可知,在试验浓度范围内,化合物对细胞的活性影响与浓度均呈负相关趋势。与Control组相比,加入12.5-100μg/mL的化合物1和1b时,细胞活力变化 不显著(P>0.05),而加入200μg/mL的化合物1、1a、1b时,细胞活力显著下降(P<0.05);加入12.5-50μg/mL的化合物1c时,细胞活力变化不显著(P>0.05),而 加入100-200μg/mL的化合物1c时,细胞活力显著下降(P<0.05);加入12.5-200 μg/mL的化合物1d时,细胞活力显著下降(P<0.05)。因此12.5-100μg/mL浓度下, 化合物1和1b对细胞活力影响不显著(P>0.05)。然而,与化合物1相比,化合物1b在 12.5-100μg/mL试验浓度范围内对3T3-L1脂肪细胞活力影响更小。
表4柚皮素1及其糖苷化合物对3T3-L1细胞的毒性作用
注:“-”表示化合物对3T3-L1脂肪细胞有营养作用。“*”表示与空白组(Control)之间存在显著(P<0.05)性差异。
实施例5柚皮素及其糖苷类化合物对小鼠单核RAW264.7巨噬细胞的抗炎能力测试
5.1实验目的
一氧化氮(NO)是一种多功能免疫调节和炎症反应的效应因子,既是免疫调节系统中关键的调节因子,又可由于过量分泌而导致炎症反应,具有多种功能活性。NO的释放 量通常是巨噬细胞炎症反应程度的一个重要评价依据,是巨噬细胞被激活的重要标志。 本实验通过测定并比较柚皮素及其糖苷类化合物对RAW264.7巨噬细胞的NO释放量的影 响,展示柚皮素及其糖苷类化合物的抗炎活性。其中空白组(Control)为RAW264.7细 胞和培养基,对照组为脂多糖(LPS),由于LPS能明显提高NO释放量,使细胞产生炎 症反应,因此以添加LPS为阳性对照,NO释放量越接近空白组(Control)说明抗炎效果 越好。
5.2实验方法
样品测定:将处于对数生长期的RAW264.7细胞用PBS清洗两次后,用胰酶消化并收集,并转移至离心管,于4℃条件下1000rpm离心4min,细胞沉淀重悬后,加入 RPMI 1640完全培养基调整细胞密度至2.0×105个/mL的密度,取96孔细胞培养板,每 孔分别加入100μL细胞、100μL化合物1,1a-1d样品溶液(12.5μg/mL,25μg/mL,50 μg/mL,100μg/mL,200μg/mL)以及10uL LPS(20μg/mL)溶液,对照组加入等量 LPS,空白组加入等量的培养基,置于CO2培养箱(5%CO2,37℃,饱和湿度)中贴壁 培养24h,24h后分别取各组上清液各50μL,加入50μL Griess试剂,室温反应15 min,除去气泡后于PerkinElmer Lambda 25紫外分光光度计测定540nm波长下测定吸光 度值,计算上清液中NO产生量。
以上实验,各做三个重复。所有操作均在无菌超净台进行。
5.3实验结果及分析
由表5和图4可知,Control组对RAW264.7细胞释放的NO量为56.7μM,而LPS 组为204.2μM,在试验浓度范围内,化合物对NO释放量的影响与浓度均呈负相关趋 势。与Control组相比,实验组加LPS后促进NO的释放。与LPS组相比,加入25-200 μg/mL的化合物1b、1c时,均显著抑制NO释放(P<0.05),且在100μg/mL时NO释放 量与Control组相比无明显差异(P>0.05),抗炎效果较好;加入50-200μg/mL的化合 物1、1d时,均显著抑制NO释放(P<0.05),且在200μg/mL时NO释放量与Control 组相比无明显差异(P>0.05),抗炎效果较好;加入100-200μg/mL的化合物1a时,显 著抑制NO释放(P<0.05),但NO释放量与Control组相比差异明显(P<0.05),抗炎效 果较差。因此,在试验浓度为100μg/mL时,化合物1b、1c抗炎效果显著(P<0.05)。 由前面细胞毒性实验可知,化合物1b在浓度为12.5-100μg/mL时对细胞活力没有显著 影响,因此,在试验浓度为100μg/mL时,化合物1b抗炎效果最强,高达97%(P< 0.05)。
表5柚皮素1及其糖苷化合物对RAW264.7细胞释放NO的影响
实施例6柚皮素及其糖苷类化合物对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞的降脂能力测试
6.1实验目的
脂肪系3T3-L1的细胞在指数生长过程中是未分化的成纤维细胞。当细胞静止时,它 们中的一小部分会积聚甘油三酸酯,并且在形态上与成熟的脂肪细胞没有区别。在成纤维细胞指数增长停止后,胰岛素可作为诱导剂添加到静态培养物中,增强先前促成的细 胞中脂质的产生,诱导多达50%的前脂肪细胞分化为脂肪细胞。然而脂质的过度积聚不 仅会造成肥胖,影响身体健康,还会造成大脑以及身体其它器官血液堵塞,严重时危及 生命。本实验通过测定并比较柚皮素及其糖苷类化合物对3T3-L1前体脂肪细胞的增殖和 分化的影响,展示柚皮素及其糖苷类化合物的降脂活性。其中空白组(Control)为3T3- L1细胞和培养基。
6.2实验方法
将处于对数生长期的3T3-L1细胞用PBS清洗两次后,用胰酶消化并收集,并转移至离心管,于4℃条件下3000rpm离心10min,去上清,用预热并且含有双抗和10%FBS 的高糖DMEM培养基缓慢吸打混匀,将细胞浓度调整为2×105,取96孔细胞培养板,每 孔分别加入100μL细胞、100μL化合物1、1a-1d样品溶液(12.5μg/mL,25μg/mL,50 μg/mL,100μg/mL,200μg/mL),以未加样品的细胞孔作为空白对照组,每组设三个平 行孔,置于37℃含5%CO2的细胞培养箱内静置培养48h;48h后,取出96孔板,每孔 加入10uL MTT(5mg/mL),培养4h;吸掉孔内液体,用等体积PBS清洗,吸掉PBS, 重复两次,然后向每孔中加入DMSO振荡10min,使结晶充分溶解;使用PerkinElmer Lambda 25紫外分光光度计测定各孔溶液在570nm波长处的吸光度值(OD)。
以上实验,各做三个重复。所有操作均在无菌超净台进行。
(2)3T3-L1细胞分化实验:
铺板:取12孔板,每个孔加细胞1mL(2.0×105),37℃含5%CO2的细胞培养箱, 静置贴壁培养,待细胞长至融合,12h后约90%-100%一层细胞。
换液:取出12孔板,缓慢吸掉孔内的培养液,缓缓加入新的DMEM培养液,37℃ 含5%CO2的细胞培养箱培养48h,待细胞长至两层细胞状态,肉眼可见白色脂肪。
加诱导液1:48h后缓慢吸出孔内液体,缓缓加1mL配好的诱导液1。
加诱导液2:24h后缓慢吸出孔内液体,缓缓加1mL配好的诱导液2。
加样品:48h后缓慢吸出孔内液体,每个孔加1mL配好的样品液。
染色:分化过程进行到第8d时,前体脂肪细胞的80%-90%完成分化,可进行油红O染色。吸掉孔内的培养液,加10%甲醛固定10min;1mL蒸馏水洗两遍;染色10-20min (0.5%油红O原液:蒸馏水=3:2,混匀,室温放置10min,过滤待用);1mL PBS缓冲 液洗两遍;加1mLPBS缓冲液显微镜下观察细胞内脂质着色情况。
以上实验,设两个对照,一个诱导不加药含DMEM培养基,另一个加药不诱导含DMEM培养基,各做三个重复。所有操作均在无菌超净台进行。
6.3实验结果及分析
由表6和图5可知,在试验浓度范围内,化合物1、1b、1d对细胞增殖的影响与浓 度均呈负相关趋势,化合物1a、1c对细胞增殖的影响与浓度先呈正相关后成负相关趋 势。与Control组相比,加入12.5-50μg/mL的化合物1和1b时,细胞增殖不显著 (P>0.05),而加入100-200μg/mL的化合物1和1b时,显著抑制细胞增殖 (P<0.05);加入12.5-100μg/mL的化合物1d时,细胞增殖没有显著影响(P>0.05), 而加入200μg/mL的化合物1d时,显著抑制细胞增殖(P<0.05);加入12.5-100 μg/mL的化合物1a时,促进细胞增殖,且50-100μg/mL下,显著促进细胞增殖 (P<0.05);加入12.5-50μg/mL的化合物1c时,促进细胞增殖,但并不显著,而加入 100-200μg/mL化合物1c时,显著抑制细胞增殖(P<0.05)。然而,与化合物1相比, 化合物1b、化合物1c在100-200μg/mL试验浓度范围内,尤其是100μg/mL剂量下, 对3T3-L1脂肪细胞抑制效果更好。
表6柚皮素1及其糖苷化合物对3T3-L1细胞增殖的影响
注:“*”表示与空白组(Control)之间存在显著(P<0.05)性差异。
由毒性实验和细胞增殖实验可知,化合物1b在12.5-100μg/mL试验浓度范围内对3T3-L1脂肪细胞活力影响不显著(P>0.05),且在100-200μg/mL试验浓度范围内对 3T3-L1脂肪细胞抑制效果较显著(P<0.05)。因此,选用100μg/mL化合物1b作为合适 浓度干预细胞分化。
诱导3T3-L1前体脂肪细胞2d后,细胞体积发生变化,局部出现椭圆隆起,且随着分化时间延长隆起逐渐变大。当细胞分化4d后,部分出现能够反光的脂质小滴,且脂 质小滴的数目随分化时间的延长逐渐增加。此时细胞的形态由梭形慢慢转变为椭圆形或 圆形,且细胞数目增多。当细胞分化8d后,80%-90%的前体脂肪细胞完成分化,接近成 熟。
油红O染料是一种脂溶性偶氮染料,溶于细胞脂质,且特异性的使得甘油三酯着色,呈现橘红色脂滴。由于溶解度差异,当与细胞接触时,染料则从溶解度小的溶剂中 转移到溶解度大的脂质中,从而将其染成橘红色。
用100μg/mL的化合物1b持续干预分化中的3T3-L1细胞8d后,油红O染色, 并观察细胞内染色脂质的数量,与对照组相比,化合物1b能够明显下调细胞内脂质小滴 的数量(图6)。
Claims (9)
2.一种柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类化合物在制备抗炎药物中的应用,其特征在于,所述的柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类化合物是如权利要求1所述的柚皮素4'-O-β -D-(4-O-甲基)葡萄糖苷。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述抗炎是指下调或抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞产生的炎性因子的产生的药物。
4.含有柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类化合物作为活性成分的抗炎药物,其特征在于,所述的柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类化合物是指:如权利要求1所述的柚皮素4'-O-β -D-(4-O-甲基)葡萄糖苷。
5.如权利要求4所述的药物,其特征在于,所述抗炎药物是指下调或抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞产生的炎性因子的产生的药物。
6.一种柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类化合物在制备降脂药物中的应用,其特征在于,所述的柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类化合物是如权利要求1所述的柚皮素4'-O-β -D-(4-O-甲基)葡萄糖苷。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述降脂是指下调或抑制前体脂肪细胞增殖和显著降低细胞分化过程中产生的脂质小滴数量。
8.含有柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类化合物作为活性成分的降脂药物,其特征在于,所述的柚皮素(4-O-甲基)葡萄糖苷类化合物是如权利要求1所述的柚皮素4'-O-β -D-(4-O-甲基)葡萄糖苷。
9.如权利要求8所述的药物,其特征在于,所述降脂是指下调或抑制前体脂肪细胞增殖和显著降低细胞分化过程中产生的脂质小滴数量。
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