CN110041184B - 一种维生素甲萘醌-7的提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种维生素甲萘醌‑7的提纯方法，所述方法为：先在MK‑7发酵液中加入适量絮凝剂絮凝沉淀，通过板框过滤，去除大部分水溶性物质。烘干滤渣，粉碎，得到干菌粉。再利用溶剂提取干菌体中的MK‑7，提取液再通过大孔树脂吸附纯化，色谱填料纯化，溶剂结晶，得到高纯度的MK‑7纯品。本发明的方法解决了现有工艺填料无法重复利用，生产成本高的问题，便于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及化合物提纯领域，尤其涉及一种维生素甲萘醌-7的提纯方法。
背景技术
由于维生素K具有促进凝血的作用,又被称为凝血维生素。近半个世纪以来，人们对维生素K的认识仅限于其对凝血系统的影响，直到1960年Bouckaert发现维生素K可以促进兔子的骨折愈合。1975年，Pettifor等首次提出维生素K参与人体骨代谢的假说之后，人们对维生素K在骨骼新陈代谢的作用才有了深入的认识。
维生素K族包括数个脂溶性的2-甲基-1,4-萘醌衍生物。天然的维生素K包括维生素K1(即叶绿醌)和维生素K2(即甲萘醌类)，其以在2-甲基-1,4-萘醌环状结构的3号位置上的亲脂性侧链为特征。叶绿醌的侧链是确定长度的不饱和烃链，甲萘醌的侧链则是不确定长度的不饱和烃链(维生素K1即叶绿醌为一种化合物，维生素K2为一系列化合物)。
维生素K2(甲萘醌-7)是维生素K2的一个类型，即维生素K2侧链上含有7个异戊二烯单元，其是一种脂溶性维生素，是人体中不可缺少的重要维生素之一。
专利公开号为CN104262129A的发明专利公开了一种从纳豆枯草芽孢杆菌中提纯维生素甲萘醌-7的方法。该方法将纳豆菌发酵液喷雾干燥,用溶剂提取或者浸溶纳豆菌发酵液喷干粉，获得浸溶液。浸溶液浓缩得到浸膏，浸膏通过柱层析，并进行梯度或等度洗脱，收集液浓缩，得到维生素甲萘醌-7。最后将维生素甲萘醌-7粗品结晶提纯，得到维生素甲萘醌-7(MK-7)纯品。
专利公开号为CN106631748A的发明专利则公开了一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素K2的方法。将纳豆芽孢杆菌发酵液离心获得菌体，烘干后，溶剂提取，提取蒸干后用极性溶剂重新溶解，通过大孔树脂吸附纯化后，再经过分子量排阻层析柱纯化，最后溶剂洗脱，再经过反相硅胶柱分离。最后结晶得到高纯度维生素K2。
上述两篇专利文献采用离心或者喷雾的方法对发酵液进行固液分离，由于喷雾干燥是在高温下进行操作，导致产品可能存在降解；同时，若直接将发酵液进行喷雾，没有进行过滤处理，则发酵液中大量水溶性的杂质没有分离，一起喷雾成粉后提高后续分离的难度。另外，采用离心操作，由于维生素K2菌体很细，离心的转速需求高。由于高转速离心机生产规模小，导致产品处理量小，难以工业化生产。
另外，上述两篇专利中，需要通过硅胶纯化工艺才能获得高纯度MK-7，由于维生素K2中含有大量的杂质，导致硅胶难以通过高温处理再重复利用。因此，维生素K2采用硅胶纯化存在生产成本高，无法重复利用等缺点。
发明内容
为了克服现有技术不足，本发明的目的是提供一种操作简单，条件温和，生产成本低的维生素甲萘醌-7的提纯方法。
为实现上述目的，发明人提供了一种维生素甲萘醌-7的提纯方法，所述提纯方法包括以下步骤：
10)在纳豆芽孢杆菌发酵液中加入絮凝剂搅拌混合均匀,静置絮凝沉淀后进行板框过滤，将过滤后的菌渣在60-100℃下烘干、粉碎、得到干菌体；
20)将步骤10)得到的干菌体采用第一有机溶剂搅拌提取后，提取液采用大孔吸附树脂吸附，然后采用第二有机溶剂洗涤大孔吸附树脂，再用第三有机溶剂洗涤大孔吸附树脂，收集纯度大于50％的维生素甲萘醌-7的大孔吸附树脂洗脱液；
30)将步骤20)得到的所述维生素甲萘醌-7的大孔吸附树脂洗脱液减压浓缩后，采用第四有机溶剂溶解再进行过色谱填料层析，然后采用第五有机溶剂洗脱，收集纯度大于90％的维生素甲萘醌-7的色谱填料洗脱液：
40)将步骤30)所得的所述维生素甲萘醌-7洗脱液浓缩，再用第六有机溶剂在40-85℃下溶解后，在-40-0℃静置36-48h析晶，然后进行抽滤，烘干滤饼，得到纯度大于98％的维生素甲萘醌-7。
采用本发明的提纯方法，先通过加絮凝剂絮凝，再通过板框过滤分离含有维生素甲萘醌-7的纳豆芽孢杆菌发酵液，操作简单，条件温和，处理能力大，且获得的初品纯度高。通过该过滤操作可大大提高维生素甲萘醌-7提纯的效率，及减少后续进一步提纯的难度。
进一步，所述步骤10)中的絮凝剂为聚合氧化铝或聚丙烯酰胺,所述加入的絮凝剂的质量为纳豆芽孢杆菌发酵液质量的1％-5％。
进一步，所述步骤20)中的第一有机溶剂为下列中的一种或两种以上的混合：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮、正丁醇、正己烷、二氯甲烷或乙酸丁酯。
进一步，所述步骤20)中所述大孔吸附树脂为非极性树脂，吸附流速为0.5-2倍柱体积/h。所述大孔吸附树脂通过洗脱可反复利用，可降低提纯成本。
进一步，所述步骤20)中，所述第二有机溶剂为下列中的一种或两种以上的混合：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮或异丙醇。
进一步，所述步骤20)中，所述第三有机溶剂为下列中的一种或两种以上的混合：甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、正庚烷、石油醚或正戊烷。
进一步，所述步骤30)中，所述色谱填料为反相色谱填料，层析条件为流速0.5-2倍柱体积/h。所述反相色谱填料可反复利用，从而可降低提纯成本，实现工业化生产。
进一步，所述步骤30)中，所述第四有机溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇；所述第五有机溶剂为下列中的一种或两种以上的混合：甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲苯、正庚烷、乙酸乙酯、正己烷、正戊烷、石油醚、三氯甲烷、丙酮或异丙醇。
进一步，所述步骤40)中所述第六有机溶剂为甲醇或乙醇溶液。
本发明的有益效果为：
1、采用板框过滤分离纳豆芽孢杆菌发酵液，操作简单，条件温和，处理能力大，获得的维生素甲萘醌-7初品纯度高。
2、采用大孔树脂-反向填料相结合的分离纯化方法，填料可重复利用，大大降低生产成本，便于工业化生产。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。
对照实施例：(参考专利CN104262129A)
将纳豆芽孢杆菌发酵液直接进行喷雾干燥得到维生素甲萘醌-7(MK-7)干菌粉，采用6倍量甲醇溶剂搅拌提取发酵液喷干粉，获得甲醇提取液。
提取液浓缩得到浸膏，浸膏与石油醚按1：1溶解后，上硅胶柱进行柱层析，采用石油醚进行预洗，洗脱倍数5BV，采用三氯甲烷和石油醚＝1：9进行洗脱，收集液浓缩，得到MK-7纯度为20％。将洗脱液浓缩，浓缩后采用30倍正丁醇溶解后，蒸发结晶。对结晶物在进行一次重结晶。得到的MK-7纯度仅为50％。
实施例1
10)在纳豆芽孢杆菌发酵液中加入聚合氧化铝，所述加入的聚合氧化铝的质量为纳豆芽孢杆菌发酵液质量的1％，静置絮凝2h，板框过滤。菌渣在80℃条件下真空干燥，粉碎，得到干菌体。
20)步骤10)得到的维生素甲萘醌-7(MK-7)干菌体采用5倍量甲醇搅拌提取后，提取液直接采用大孔吸附树脂吸附,然后采用甲醇预洗，最后用乙酸乙酯:甲醇体积比＝6:1进行洗脱，流速1BV/h。收集纯度大于50％的MK-7大孔吸附树脂洗脱液。
30)将步骤20)得到的MK-7大孔吸附树脂洗脱液减压浓缩后，采用乙醇溶解后过色谱填料层析，再采用甲醇：正己烷体积比3:1洗脱，收集纯度大于90％的MK-7色谱填料洗脱液。
40)将步骤30)得到的MK-7色谱填料洗脱液浓缩后采用甲醇在60℃溶解后，低温-20℃放置40h析晶，低温抽滤，烘干。最后得到纯度大于98％的维生素甲萘醌-7(MK-7)。
实施例2
10)在纳豆芽孢杆菌发酵液中加入聚合氧化铝，所述加入的聚合氧化铝的质量为纳豆芽孢杆菌发酵液质量的3％，静置絮凝2h，板框过滤。菌渣在80℃条件下真空干燥，粉碎，得到干菌体。
20)步骤10)得到的维生素甲萘醌-7(MK-7)干菌体采用5倍量乙醇搅拌提取后，提取液直接采用非极性大孔吸附树脂吸附,然后采用乙醇预洗，最后用正己烷:乙醇体积比5：1进行洗脱，流速0.5BV/h。收集纯度大于50％的MK-7大孔吸附树脂洗脱液。
30)将步骤20)得到的MK-7大孔吸附树脂洗脱液减压浓缩后，采用异丙醇溶解后过反相色谱填料层析，再采用异丙醇：正己烷体积比3：1洗脱，流速为1BV/h，收集纯度大于90％的MK-7色谱填料洗脱液
40)将步骤30)得到的所得的MK-7色谱填料洗脱液浓缩后采用乙醇在60℃下溶解后，低温-20℃放置48h析晶，低温抽滤，烘干。最后得到纯度大于98％的维生素甲萘醌-7(MK-7)。
实施例3
10)在纳豆芽孢杆菌发酵液中加入聚丙烯酰胺，所述加入的聚丙烯酰胺的质量为纳豆芽孢杆菌发酵液质量的2％，静置絮凝2h，板框过滤。菌渣在80℃条件下真空干燥，粉碎，得到干菌体。
20)步骤10)得到的维生素甲萘醌-7(MK-7)干菌体采用5倍量乙酸乙酯搅拌提取后，提取液直接采用非极性大孔吸附树脂吸附,然后采用乙酸乙酯预洗，最后用乙酸乙酯:二氯甲烷体积比2：3进行洗脱，流速2BV/h。收集纯度大于50％的MK-7大孔吸附树脂洗脱液。
30)将步骤20)得到的MK-7大孔吸附树脂洗脱液减压浓缩后，采用异丙醇溶解后过反相色谱填料层析，再采用甲醇：石油醚体积比1:2洗脱，流速为2BV/h，收集纯度大于90％的MK-7色谱填料洗脱液。
40)将步骤30)得到的所得的MK-7色谱填料洗脱液浓缩后采用乙醇在60℃下溶解后，低温-20℃放置36h析晶，低温抽滤，烘干。最后得到纯度大于98％的维生素甲萘醌3-7(MK-7)。
实施例4
10)在纳豆芽孢杆菌发酵液中加入聚丙烯酰胺，所述加入的聚丙烯酰胺的质量为纳豆芽孢杆菌发酵液质量的5％，静置絮凝2h，板框过滤。菌渣在80℃条件下真空干燥，粉碎，得到干菌体。
20)步骤10)得到的维生素甲萘醌-7(MK-7)干菌体采用5倍量丙酮搅拌提取后，提取液直接采用非极性大孔吸附树脂吸附,然后采用丙酮预洗，最后用正庚烷进行洗脱，流速1BV/h。收集纯度大于50％的MK-7大孔吸附树脂洗脱液。
30)将步骤20)得到的MK-7大孔吸附树脂洗脱液减压浓缩后，采用异丙醇溶解后过反相色谱填料层析，再采用乙醇：正己烷体积比3:1洗脱，流速为1BV/h，收集纯度大于90％的MK-7色谱填料洗脱液
40)将步骤30)得到的所得的MK-7色谱填料洗脱液浓缩后采用乙醇在60℃下溶解后，低温-20℃放置42h析晶，低温抽滤，烘干。最后得到纯度大于98％的维生素甲萘醌-7(MK-7)。
实施例5
10)在纳豆芽孢杆菌发酵液中加入聚合氧化铝，所述加入的聚合氧化铝的质量为纳豆芽孢杆菌发酵液质量的5％，静置絮凝2h，板框过滤。菌渣在80℃条件下真空干燥，粉碎，得到干菌体。
20)步骤10)得到的维生素甲萘醌-7(MK-7)干菌体采用5倍量乙醇搅拌提取后，提取液直接采用非极性大孔吸附树脂吸附,然后采用乙醇预洗，最后用正己烷进行洗脱，流速1.5BV/h。收集纯度大于50％的MK-7大孔吸附树脂洗脱液。
30)将步骤20)得到的MK-7大孔吸附树脂洗脱液减压浓缩后，采用异丙醇溶解后过反相色谱填料层析，再采用三氯甲烷：正戊烷体积比3：1洗脱，流速为0.5BV/h，收集纯度大于90％的MK-7色谱填料洗脱液。
40)将步骤30)得到的所得的MK-7色谱填料洗脱液浓缩后采用甲醇在60℃下溶解后，低温-20℃放置45h析晶，低温抽滤，烘干。最后得到纯度大于98％的维生素甲萘醌-7(MK-7)。
根据对照实施例可知，采用参考专利CN104262129A的提纯方法，得到的MK-7纯度仅为50％。同时，在该参考专利技术中，通过行喷雾干燥得到干菌体，其操作复杂，得到的MK-7粗品纯度低，提高后续提纯MK-7的难度。另外，该专利中进一步通过硅胶柱柱层析干菌体提取液，不仅操作繁琐，且硅胶柱无法多次利用，提纯成本高，不利于提纯方法工业化。
而采用本发明的技术方案，实施例1-5提纯得到的MK-7纯度达98％以上。本发明先在MK-7发酵液中加入适量絮凝剂絮凝沉淀，通过板框过滤，去除大部分水溶性物质。烘干滤渣，粉碎，得到干菌粉。再利用溶剂提取干菌体中的MK-7，提取液再通过大孔树脂吸附纯化，色谱填料纯化，溶剂结晶，得到高纯度的MK-7纯品。解决了现有工艺填料无法重复利用，生产成本高的问题，便于工业化生产。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (9)
1.一种维生素甲萘醌-7的提纯方法，其特征在于：所述提纯方法包括以下步骤：
10）在纳豆芽孢杆菌发酵液中加入絮凝剂搅拌混合均匀,静置絮凝沉淀后进行板框过滤，将过滤后的菌渣在60-100℃下烘干、粉碎、得到干菌体；
20）将步骤10）得到的干菌体采用第一有机溶剂搅拌提取后，提取液采用非极性树脂的大孔吸附树脂吸附，然后采用第二有机溶剂洗涤大孔吸附树脂，再用第三有机溶剂洗涤大孔吸附树脂，收集纯度大于50%的维生素甲萘醌-7的大孔吸附树脂洗脱液；
30）将步骤20）得到的所述维生素甲萘醌-7的大孔吸附树脂洗脱液减压浓缩后，采用第四有机溶剂溶解再进行过反相色谱填料层析，然后采用第五有机溶剂洗脱，收集纯度大于90%的维生素甲萘醌-7的色谱填料洗脱液：
40）将步骤30）所得的所述维生素甲萘醌-7洗脱液浓缩，再用第六有机溶剂在40-85℃下溶解后，在-40-0℃静置36-48h析晶，然后进行抽滤，烘干滤饼，得到纯度大于98%的维生素甲萘醌-7。
2.根据权利要求1所述的维生素甲萘醌-7的提纯方法，其特征在于：所述步骤10）中的絮凝剂为聚合氧化铝或聚丙烯酰胺,所述加入的絮凝剂的质量为纳豆芽孢杆菌发酵液质量的1%-5%。
3.根据权利要求1所述的维生素甲萘醌-7的提纯方法，其特征在于：所述步骤20）中的第一有机溶剂为下列中的一种或两种以上的混合：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮、正丁醇、正己烷或二氯甲烷。
4.根据权利要求1所述的维生素甲萘醌-7的提纯方法，其特征在于：所述步骤20）中所述大孔吸附树脂为非极性树脂，吸附流速为0.5-2倍柱体积/h。
5.根据权利要求1或4所述的维生素甲萘醌-7的提纯方法，其特征在于：所述步骤20）中，所述第二有机溶剂为下列中的一种或两种以上的混合：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮或异丙醇。
6.根据权利要求1或4所述的维生素甲萘醌-7的提纯方法，其特征在于：所述步骤20）中，所述第三有机溶剂为下列中的一种或两种以上的混合：甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、正庚烷、石油醚或正戊烷。
7.根据权利要求1所述的维生素甲萘醌-7的提纯方法，其特征在于：所述步骤30）中，所述色谱填料为反相色谱填料，层析条件为流速0.5-2倍柱体积/h。
8.根据权利要求1或7所述的维生素甲萘醌-7的提纯方法，其特征在于：所述步骤30）中，所述第四有机溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇；所述第五有机溶剂为下列中的一种或两种以上的混合：甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲苯、正庚烷、乙酸乙酯、正己烷、正戊烷、石油醚、三氯甲烷、丙酮或异丙醇。
9.根据权利要求1所述的维生素甲萘醌-7的提纯方法，其特征在于：所述步骤40）中所述第六有机溶剂为甲醇或乙醇溶液。
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