CN112321408B - 一种从微生物发酵液中提取维生素k2的设备和方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物提取技术领域，涉及一种从微生物发酵液中提取维生素K2的设备和方法。所述设备包括连续动态逆流提取器和中压制备色谱；中压制备色谱包括至少一组色谱组，每一组色谱组包括四根并联的色谱柱，每根色谱柱均单独设置有进料口、A洗脱剂入口、B洗脱剂入口和C洗脱剂入口，进料口连接连续动态逆流提取器的提取液出口，所述A洗脱剂入口、B洗脱剂入口和C洗脱剂入口分别连接A洗脱剂源、B洗脱剂源和C洗脱剂源，这四个物料入口的开启与关闭各自独立地通过阀门控制，同一色谱组中不同色谱柱的阀门同步切换。采用本发明提供的设备能够提高维生素K2的纯度和收率，整个提取过程能够完全实现连续自动化操作。

Description

一种从微生物发酵液中提取维生素K2的设备和方法

技术领域

本发明属于微生物提取技术领域，具体涉及一种从微生物发酵液中提取维生素K2的设备和方法。

背景技术

维生素K2，也称甲基萘醌(Menaquinone)，通常用MK来表示。它由一组化合物组成，共有14种形式，差别在于侧链的长短不一，其中以MK-7(甲萘醌-7)的生物活性最显著。MK-7的化学式如式(1)所示，其在维生素K2侧链上含有7个异戊二烯单元，是一类重要的脂溶性凝血类维生素，是罕见的油脂资源，因其在食品中含量极少，素有“铂金维生素”之称，具有预防和治疗骨质疏松、动脉钙化、心血管疾病、肿瘤及帕金森症等多种重要的生理功能。

WHD的统计数据表明，维生素K2特别是MK-7形式的长链维生素K2，被公认为是优质的天然维生素K2，它的功能和安全性，现已通过美国FDA的认证批准。

随着我国经济社会的发展、人民生活水平的提高以及人口进入老龄化阶段，高纯度的维生素K2无论是作为保健品还是药品，都具有广泛的需求。目前维生素K2(MK-7)主要以化学合成为主，但传统化学合成法存在化学前体原料来源限制、化学反应会产生大量异构体、副产物多、产率低、带来环境污染等问题，且合成的维生素K2中异戊二烯侧链多是顺式结构，活性较低。而微生物发酵法制得的维生素K2(MK-7)均为全反式结构，活性高，稳定性强。因此，微生物发酵法制备维生素K2(MK-7)越来越受到欢迎，采用微生物发酵法进行维生素工业化生产的最大优点在于，能够大大简化生产工序并改善劳动条件、减少环境污染、同时也有利于资源开发和综合利用，而且发酵生产的维生素K2(MK-7)具有很高的生理活性，因此，微生物发酵法生产维生素K2(MK-7)具有重要的科学价值，前景广阔。

CN106631748A公开了一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素K2的方法，该方法通过纳豆芽孢杆菌发酵液离心获得菌体，干燥后采用有机溶剂静置提取，大孔树脂吸附，分子量排阻层析柱纯化，反向硅胶柱分离，结晶，重结晶获得高纯度的维生素K2晶体。CN104177244A公开了一种从淡豆豉中提取、纯化和结晶获得维生素K2(MK-7)的方法，该方法以富含K2(MK-7)的淡豆豉为原料，采用有机溶剂超声振荡提取，借助硅胶柱层析纯化提取的维生素K2(MK-7)，采用混合溶剂进行结晶或重结晶获得维生素K2(MK-7)晶体。上述方法均采用菌体干燥后再静态提取，提取液采用常压柱层析纯化，整个制备过程采用设备种类较多，工艺路线长，溶剂消耗大，且维生素K2(MK-7)菌体在高温干燥环境下不稳定，组分极其容易被破坏，干燥耗时长，能耗增加，从而总回收率降低，成本高，不适合用于工业化生产。

CN103571897A公开了一种维生素K2的制备方法，利用1-羟基-2-萘甲酸抗性黄杆菌株HNA12-D进行发酵培养获得维生素K2发酵液，发酵液破壁后经有机溶剂提取，大孔吸附树脂粗分，硅胶柱精制，获得维生素K2纯品。然而，该方法利用黄杆菌发酵产生的维生素K2的主要成分为MK-4、MK-5或MK-6，MK-7成分很少，并且该方法为湿法提取，需要反复冻融进行破壁，之后再采用大孔吸附树脂和硅胶柱层析进行纯化，过程繁琐，成本较高，不适用于工业化生产。

现有文献资料表明，微生物发酵法提炼的维生素K2(MK-7)市场需求很大，且科学价值很高，前景广阔，但目前提取的方式均为静态提取，还未有文献阐述过将维生素K2(MK-7)湿菌体采用连续动态逆流提取技术结合中压制备色谱全程自动化操作来分离纯化获得高纯度维生素K2(MK-7)。

发明内容

本发明的目的是为了克服采用现有的从微生物发酵液中提取维生素K2(MK-7)的方法所得维生素K2的纯度和/或收率较低且过程繁琐的缺陷，而提供一种能够同时提高维生素K2(MK-7)的纯度和收率的从微生物发酵液中提取维生素K2的设备和方法，整个提取过程能够完全实现自动化操作，工艺稳定性好，分离速度快，耗时短，全程连续作业，能够很好地弥补现有技术中提取纯化过程长、成本高、收率低、需要人工介入、不适合工业化生产的不足。

枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液中富含MK-7，以枯草芽孢杆菌作为发酵菌种极其适用于生产MK-7，采用连续动态逆流提取技术从该维生素K2原液中提取MK-7，能够充分利用固液两相的浓度梯度差，逐级使维生素K2原液中有效成分扩散至起始浓度相对比较低的提取剂中，从而达到最大限度转移MK-7的目的，但与此同时，维生素K2原液中的一些其他油脂类杂质在连续动态逆流提取过程中也容易同时被提取剂萃出，从而会增加后期纯化难度。本发明的发明人经过深入研究之后发现，将连续动态逆流提取与中压制备色谱联合使用，同时将连续动态逆流提取的停留时间控制在0.5～3h，能够获得MK-7和油脂类杂质比例特定的提取液，该提取液进入中压制备色谱中进行进一步分离纯化时，能够实现不同色谱柱的阀门同步切换以完成角色转换，确保同一色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间一致，并确保同一色谱组中不同色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间也一致，整个过程只需要控制阀门切换时间即可实现生产过程全自动化运行，所有工序步骤同时进行，又彼此独立，实现了连续化生产，避免了人工现场观察以及手动切换操作，更为重要的是能够显著提高MK-7的纯度、收率以及产能。基于此，完成了本发明。

具体地，本发明提供了一种从微生物发酵液中提取维生素K2(MK-7)的设备，该设备包括连续动态逆流提取器和中压制备色谱；所述连续动态逆流提取器包括提取滚筒，所述提取滚筒的一端设置有菌泥入口及提取液出口且另一端设置有提取剂入口；所述中压制备色谱包括至少一组色谱组，每一组色谱组包括四根并联的色谱柱，每根色谱柱均单独设置有进料口、A洗脱剂入口、B洗脱剂入口和C洗脱剂入口，所述进料口连接连续动态逆流提取器的提取液出口，所述A洗脱剂入口、B洗脱剂入口和C洗脱剂入口分别连接A洗脱剂源、B洗脱剂源和C洗脱剂源，这四个物料入口的开启与关闭各自独立地通过阀门控制，同一色谱组中不同色谱柱的阀门同步切换，且阀门的切换顺序使得同一根色谱柱依次且循环地与连续动态逆流提取器的提取液出口、A洗脱剂源、B洗脱剂源和C洗脱剂源连接。

进一步地，所述连续动态逆流提取器中提取滚筒的长径比为(30～100):1。

进一步地，所述中压制备色谱包括1～8组色谱组。

进一步地，同一色谱组的不同色谱柱中装填的填料相同，选自极性大孔吸附树脂、离子交换树脂、改性氧化铝、无定型硅胶、球型硅胶、高聚物改性填料中的至少一种。

进一步地，所述设备还包括破壁机和固液分离机；优选的，所述固液分离机为离心分离器。

本发明还提供了一种利用所述设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其中，该方法包括：

(1)将枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液经破壁和固液分离后所得湿菌泥与提取剂分别从菌泥入口和提取剂入口引入连续动态逆流提取器中进行连续动态逆流提取，并将连续动态逆流提取的停留时间控制在0.5～3h，得到提取液；

(2)所述提取液从连续动态逆流提取器的提取液出口引出并送入中压制备色谱中进行色谱分离，所述中压制备色谱柱同一色谱组中的1#色谱柱进料口优先开启以实现进料，待1#色谱柱进样完毕后切换至2#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至A洗脱剂入口以采用A洗脱剂进行洗脱，保证1#色谱柱洗脱时间与2#色谱柱进料时间一致，待2#色谱柱进料完毕后切换至3#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至B洗脱剂入口以采用B洗脱剂进行解析，2#色谱柱切换至A洗脱剂入口以采用A洗脱剂进行洗脱，保证1#色谱柱解析时间、2#色谱柱洗脱时间与3#色谱柱进料时间一致，待3#色谱柱进料完毕后切换至4#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至C洗脱剂入口以采用C洗脱剂进行再生，2#色谱柱切换至B洗脱剂入口以采用B洗脱剂进行解析，3#色谱柱切换至A洗脱剂入口以采用A洗脱剂进行洗脱，保证1#色谱柱再生时间、2#色谱柱解析时间、3#色谱柱洗脱时间与4#色谱柱进料时间一致，以此类推，同一色谱组中不同色谱柱的阀门同步切换，且阀门的切换顺序使得同一根色谱柱依次且循环地与连续动态逆流提取器的提取液出口、A洗脱剂源、B洗脱剂源和C洗脱剂源连接，正相色谱中三种洗脱剂的极性由大到小排列顺序依次为B洗脱剂＞A洗脱剂＞C洗脱剂，反相色谱中三种洗脱剂的极性由大到小排列顺序依次为C洗脱剂＞A洗脱剂＞B洗脱剂，收集各色谱柱流出的洗脱液，浓缩后得到维生素K2浓缩液。

进一步地，所述维生素K2原液采用酸或碱进行破壁处理。

进一步地，所述酸为有机酸和/或无机酸，所述有机酸选自甲酸、乙酸、丙酸、乙二酸、氨基磺酸、柠檬酸和乙二胺四乙酸中的至少一种，所述无机酸选自硫酸、盐酸、硝酸和磷酸中的至少一种。

进一步地，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钙和氨水中的至少一种。

进一步地，所述提取剂选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲苯、氯仿、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇、正己烷、正庚烷、二硫化碳、正辛烷、环戊烷、环己烷、甲基环戊烷、二氯甲烷、四氯化碳、石油醚、异丙醚、二异丙醚、四氢呋喃、二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。

进一步地，所述连续动态逆流提取的条件包括温度为15～40℃，所述湿菌泥与有机溶剂的质量体积料液比为1kg:(3～20)L。

进一步地，正相色谱中，所述A洗脱剂含有组分11和组分12，组分12的体积百分比≥55％，优选≥90％；所述B洗脱剂含有组分11和任选的组分12，组分11的体积百分比≥20％，优选≥70％，最优选为100％；所述C洗脱剂含有组分12和任选的组分11，组分12的体积百分比≥90％，优选≥95％，最优选为100％；所述组分11选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇和异戊醇中的至少一种，所述组分12选自石油醚、异丙醚、二异丙醚、乙基丁基醚、正己烷、环己烷、正庚烷、二硫化碳、正辛烷、环戊烷、甲基环戊烷和甲基环己烷中的至少一种。

进一步地，反相色谱中，所述A洗脱剂含有组分21和组分22，组分22的体积百分比≥55％，优选≥75％；所述B洗脱剂含有组分21和任选的组分22，组分21的体积百分比≥20％，优选≥70％，最优选为100％；所述C洗脱剂含有组分22和任选的组分21，组分22的体积百分比≥90％，优选≥95％，最优选为100％；所述组分21选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷和氯仿中的至少一种，所述组分22选自水、甲醇、乙醇、乙腈、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇和N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。

进一步地，所述中压制备色谱的操作参数控制如下：进料液流速为1～1000L/h，洗脱剂流速为1～1000L/h，洗脱温度为0～50℃，压力为5～20bar，切换时间为0.3～2h。

进一步地，本发明提供的从微生物发酵液中提取维生素K2(MK-7)的方法还包括将所述维生素K2(MK-7)浓缩液进行重结晶。

进一步地，所述重结晶的方法为将维生素K2(MK-7)浓缩液采用重结晶试剂溶解，之后依次进行降温结晶、过滤和干燥，得到维生素K2(MK-7)精品。

进一步地，所述维生素K2浓缩液与重结晶试剂的质量比为1:(5～50)。

进一步地，所述重结晶试剂选自甲酸甲酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、冰醋酸、水、苯、正庚烷、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丙醇、乙醚、二氯甲烷、异丙醚、石油醚、二异丙醚、乙基丁基醚、丙酮、丁酮、正己烷和正庚烷中的至少一种。

进一步地，所述降温结晶过程的降温速率控制在5～15℃/h，终温控制在0～25℃。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用的连续动态逆流提取技术对湿菌泥进行预提取，使湿菌泥与提取剂在提取滚筒中沿相反方向运动，连续而充分地进行接触，充分利用了固液两相的浓度梯度差，逐级将湿菌泥中有效成分扩散至起始浓度相对较低的提取剂中，达到了最大限度转移维生素K2(MK-7)的目的，整个提取过程在密闭状态下进行，提取过程达到了连续、逆流、动态、自动化、智能化，与机械搅拌式提取、渗漉法提取、静置提取相比，连续动态逆流提取的最大优点是不存在中间切换及重复繁重的出渣和投加新物料的过程操作，有效成分得率高、浸出液浓度高、生产效率高，并能够节约能源，安全可靠，很大程度上降低了生产成本。

(2)本发明采用中压制备色谱进行深度提取，相比现有技术采用的常压柱色谱分离，中压制备色谱具有上样量大、分离速度快、效率高且可短时间内完成分离提纯的优势，在将连续动态逆流提取的停留时间控制在0.5～3h的前提下，能够保证同一色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间一致，同时保证同一色谱组中不同色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间也一致，不同色谱柱的阀门同步切换以完成角色转换，使色谱柱在一个工艺循环中依次完成吸附、洗脱、解吸和再生的全部工艺过程，只需控制切换时间即可实现生产过程全自动化，避免了人工现场观察以及手动切换操作，生产效率高；

(3)本发明通过连续动态逆流提取联合中压制备色谱从枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液中提取MK-7，所得MK-7的纯度能够达到99％以上，收率能够达到90％以上，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的一种实施方式所提供的从微生物发酵液中提取维生素K2的设备示意图。

具体实施方式

如图1所示，本发明提供的从微生物发酵液中提取维生素K2的设备包括连续动态逆流提取器VT102和中压制备色谱；所述连续动态逆流提取器包括提取滚筒，所述提取滚筒的一端设置有菌泥入口及提取液出口且另一端设置有提取剂入口；所述中压制备色谱包括至少一组色谱组(图1示出了一组色谱组)，每一组色谱组包括四根并联的色谱柱，按顺序编号为1#色谱柱、2#色谱柱、3#色谱柱和4#色谱柱，每根色谱柱均单独设置有进料口、A洗脱剂入口、B洗脱剂入口和C洗脱剂入口，所述进料口连接连续动态逆流提取器的提取液出口，所述A洗脱剂入口、B洗脱剂入口和C洗脱剂入口分别连接A洗脱剂源(存储于罐体R301中)、B洗脱剂源(存储于罐体R302中)和C洗脱剂源(存储于罐体R303中)，这四个物料入口的开启与关闭各自独立地通过阀门控制，同一色谱组中不同色谱柱的阀门同步切换，且阀门的切换顺序使得同一根色谱柱依次且循环地与连续动态逆流提取器的提取液出口、A洗脱剂源、B洗脱剂源和C洗脱剂源连接，以使得同一色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间一致，并且同一色谱组中不同色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间也一致。

工作时，枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液经破壁和固液分离后所得固体产物即为湿菌泥，该湿菌泥从位于提取滚筒低端的菌泥入口引入连续动态逆流提取器中，在螺旋推进器的推动下一边作旋转运动，一边沿筒体向高端移动，提取剂从位于提取滚筒高端的提取剂入口引入连续动态逆流提取器中，在筒体内与湿菌泥混合并向下端流动，湿菌泥和提取剂形成运动方向相反的逆流提取过程，利用固液两相的浓度梯度差，逐级将湿菌泥中的MK-7扩散至起始浓度相对较低的提取剂中，从而达到最大限度转移MK-7的目的，所得提取液引入中压制备色谱中进行色谱分离(起始阶段所有色谱柱的物料入口均关闭)，1#色谱柱进料口优先开启以实现进料，待1#色谱柱进样完毕后切换至2#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至A洗脱剂入口以采用A洗脱剂进行洗脱，保证1#色谱柱洗脱时间与2#色谱柱进料时间一致，待2#色谱柱进料完毕后切换至3#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至B洗脱剂入口以采用B洗脱剂进行解析，2#色谱柱切换至A洗脱剂入口以采用A洗脱剂进行洗脱，保证1#色谱柱解析时间、2#色谱柱洗脱时间与3#色谱柱进料时间一致，待3#色谱柱进料完毕后切换至4#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至C洗脱剂入口以采用C洗脱剂进行再生，2#色谱柱切换至B洗脱剂入口以采用B洗脱剂进行解析，3#色谱柱切换至A洗脱剂入口以采用A洗脱剂进行洗脱，保证1#色谱柱再生时间、2#色谱柱解析时间、3#色谱柱洗脱时间与4#色谱柱进料时间一致，以此类推，同一色谱组中不同色谱柱的阀门同步切换，且阀门的切换顺序使得同一根色谱柱依次且循环地与连续动态逆流提取器的提取液出口、A洗脱剂源、B洗脱剂源和C洗脱剂源连接，以使得同一色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间一致，并且同一色谱组中不同色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间也一致，各色谱柱洗脱分离出的组分可以通过检测器进行结构确定，结合检测器谱图的变化来确定MK-7纯度范围，从而确定中压制备色谱柱切换收集高纯度MK-7组分的最佳时间，避免了常规的检测分析手段带来的时间滞后、工序复杂等缺点，可实现高度自动化的生产流程。其中，所述检测器可以选自高效液相色谱、紫外光谱、红外光谱、飞行时间质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱中的至少一种，检测波长可选择在245nm～365nm之间，优选为紫外光谱，检测波长为254nm。各色谱柱流出的高纯MK-7洗脱液统一收集至收集罐V202中。

在本发明中，整个提取过程在密闭状态下进行，提取过程达到了连续、逆流、动态、自动化、智能化，与机械搅拌式提取、渗漉法提取、静置提取相比，连续动态逆流提取的最大优点是不存在中间切换及重复繁重的出渣和投加新物料的过程。提取实现连续化后，提取后无效成分通过螺旋出渣机进行隔离管道排放。该技术既避免了维生素K2(MK-7)组分在高温干燥过程中的破坏、干燥时间长的弊端，同时实现了提取过程的连续性，自动化操作，时间短，溶剂消耗少，所得提取液浓度高。

在本发明中，所述连续动态逆流提取的停留时间为0.5～3h，例如，可以为0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1h、1.1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2.0h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h、2.5h、2.6h、2.7h、2.8h、2.9h、3.0h等。当连续动态逆流提取的停留时间短于0.5h时，菌泥与提取剂接触不充分，提取不完全，提取收率低；当连续动态逆流提取的停留时间长于3h时，会造成时间和能源上的浪费。此外，当连续动态逆流提取的停留时间短于0.5h或者长于3h，所得提取液采用中压制备色谱中进行分离纯化，同一色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间无法保证一致，并且同一色谱组中不同色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间也无法保证一致，也即，无法实现不同色谱柱阀门的同步切换，进而无法实现全自动化控制，只能人工现场观察并手动切换完成色谱柱角色转换，费时费力。

在本发明中，所述连续动态逆流提取器中提取滚筒的长径比优选为(30～100):1，此时不仅能够将湿菌泥中的MK-7组分充分浸提出来，而且通过将提取停留时间控制在0.5～3h，能够获得MK-7和油脂类杂质比例特定的提取液，这一提取液通过中压制备色谱柱进一步分离提纯之后，能够很容易将其中的油脂类杂质去除，从而获得纯度和收率均较高的维生素K2(MK-7)。

所述中压制备色谱可以包括1～8组色谱组，也即，总共包括4～32根色谱柱。工作时，不同色谱组之间单独工作，相互独立，互不影响，同一色谱组中不同色谱柱的阀门同步切换，以使得同一色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间一致，并且同一色谱组中不同色谱柱的进料、洗脱、解析和再生时间也一致，从而实现全自动化控制，提高产能。此外，不同色谱组中装填的填料可以相同，也可以不同，但同一色谱组的不同色谱柱中装填的填料应该相同，具体可以选自极性大孔吸附树脂、离子交换树脂、改性氧化铝、无定型硅胶、球型硅胶、高聚物改性填料(聚二乙烯基苯、硅胶基质键合的C18填料)中的至少一种。

本发明采用酸或碱对维生素K2原液进行破壁处理的目的是因枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2(MK-7)不完全为胞外产物，有部分为胞内产物，需采用破壁工艺将细胞破碎，使胞内的维生素K2(MK-7)完全释放出来，且更利于后续维生素K2(MK-7)的提取。其中，所述酸可以为有机酸，也可以为无机酸，还可以为两者的混合物。所述有机酸的具体实例包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、乙二酸、氨基磺酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸中的至少一种。所述无机酸的具体实例包括但不限于：硫酸、盐酸、硝酸、磷酸中的至少一种。所述碱的具体实例包括但不限于：氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钙、氨水中的至少一种。此外，维生素K2原液与酸或碱的质量比可以为(50～300):1。

本发明对提取剂的种类没有特别的限定，可以为现有的各种能够溶解MK-7组分的有机溶剂，其具体实例包括但不限于：丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲苯、氯仿、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇、正己烷、正庚烷、二硫化碳、正辛烷、环戊烷、环己烷、甲基环戊烷、二氯甲烷、四氯化碳、石油醚、异丙醚、二异丙醚、四氢呋喃、二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。所述湿菌泥与提取剂的质量体积料液比优选为1kg:(3～20)L，最优选为1kg:(10～15)L。此外，所述连续动态逆流提取的温度优选为15～40℃，停留时间优选为0.8～2h。

在本发明中，采用A洗脱剂进行洗脱的目的是将提取液中不同吸附能力的杂质进行色谱分离，洗脱过程中先将易被洗脱的杂质去除，接着洗脱下来的即为目标产物，洗脱过程中通过检测器检测收集目标产物；待目标产物收集完毕后采用B洗脱剂进行洗脱(解析)，B洗脱剂洗脱(解析)的目的是为了提高溶剂极性，将吸附性很强的后段杂质洗脱下来，以使其不影响下次层析的柱效；采用C洗脱剂进行洗脱的目的是将色谱柱进行柱平衡，为了使色谱分离柱再生后可多次重复套用，从而增加了填料的使用次数。正相色谱中，三种洗脱剂的极性由大到小排列顺序依次为B洗脱剂＞A洗脱剂＞C洗脱剂。在一种具体实施方式中，所述A洗脱剂含有组分11和组分12，组分12的体积百分比≥55％，优选≥90％；所述B洗脱剂含有组分11和任选的组分12，组分11的体积百分比≥20％，优选≥70％，最优选为100％；所述C洗脱剂含有组分12和任选的组分11，组分12的体积百分比≥90％，优选≥95％，最优选为100％；所述组分11选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇和异戊醇中的至少一种，所述组分12选自石油醚、异丙醚、二异丙醚、乙基丁基醚、正己烷、环己烷、正庚烷、二硫化碳、正辛烷、环戊烷、甲基环戊烷和甲基环己烷中的至少一种。反相色谱中，三种洗脱剂的极性由大到小排列顺序依次为C洗脱剂＞A洗脱剂＞B洗脱剂。在一种具体实施方式中，所述A洗脱剂含有组分21和组分22，组分22的体积百分比≥55％，优选≥75％；所述B洗脱剂含有组分21和任选的组分22，组分21的体积百分比≥20％，优选≥70％，最优选为100％；所述C洗脱剂含有组分22和任选的组分21，组分22的体积百分比≥90％，优选≥95％，最优选为100％；所述组分21选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷和氯仿中的至少一种，所述组分22选自水、甲醇、乙醇、乙腈、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇和N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。

在一种具体实施方式中，所述中压制备色谱的操作参数控制如下：进料液流速为1～1000L/h，洗脱剂流速为1～1000L/h，洗脱温度为0～50℃，压力为5～20bar，切换时间为0.3～2h。在本发明中，所述压力均指表压。

本发明提供的从微生物发酵液中提取维生素K2(MK-7)的方法优选还包括将所述维生素K2(MK-7)浓缩液进行重结晶。所述重结晶的方法可以为将维生素K2(MK-7)浓缩液采用重结晶试剂溶解，之后依次进行降温结晶、过滤和干燥，得到维生素K2(MK-7)精品。其中，所述降温结晶过程的降温速率优选控制在5～15℃/h，终温优选控制在0～25℃。所述维生素K2(MK-7)浓缩液与重结晶试剂的质量比优选控制在1:(5～50)。所述重结晶试剂的具体实例包括但不限于：甲酸甲酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、冰醋酸、水、苯、正庚烷、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丙醇、乙醚、二氯甲烷、异丙醚、石油醚、二异丙醚、乙基丁基醚、丙酮、丁酮、正己烷和正庚烷中的至少一种。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1(反相色谱柱)

本实施例采用连续动态逆流提取结合中压制备色谱分离纯化的方式从微生物发酵液中分离提取纯化维生素K2(MK-7)，具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液50L，用浓硫酸进行破壁处理，再采用管式离心机进行固液分离，获得湿菌泥3.0kg。将该湿菌泥与丙酮-乙醇混合溶剂(v:v＝1:2)按质量体积比1kg:10L在连续动态逆流提取器(长径比为30:1)中进行动态逆流提取，控制提取温度为40℃，提取停留时间为1h，获得维生素K2(MK-7)浓度为6860mg/L、提取收率为98.87％的提取液。

(2)将提取液采用中压制备色谱在4根ODS色谱柱上进行连续分离纯化，具体地，将提取液上样到1#色谱柱，待1#色谱柱进料完毕，切换至2#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用丙酮-N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂(v:v＝1:4)进行洗脱，保证1#色谱柱洗脱时间与2#色谱柱进料时间一致，2#色谱柱进料完毕，切换至3#色谱柱进行进料，同时1#色谱柱切换至B洗脱剂入口，用丙酮-N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂(v:v＝7:3)进行解析，2#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用丙酮-N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂(v:v＝1:4)进行洗脱，保证1#色谱柱解析时间、2#色谱柱洗脱时间与3#色谱柱进料时间一致，待3#色谱柱进料完毕后切换至4#色谱柱开始进料，同时1#色谱柱切换至C洗脱剂入口，用N,N-二甲基甲酰胺进行再生，2#色谱柱切换至B洗脱剂入口，用丙酮-N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂(v:v＝7:3)进行解析，3#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用丙酮-N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂(v:v＝1:4)进行洗脱，保证1#色谱柱再生时间、2#色谱柱解析时间、3#色谱柱洗脱时间与4#色谱柱进料时间一致，以此类推，将提取液连续上样到4根中压制备色谱柱内，不同色谱柱的阀门同步切换，切换时间为0.3h，进料流量控制在3.75L/h，洗脱流速控制在6.4L/h，柱压控制在5bar，柱温控制在35℃，洗脱液采用紫外检测器在检测波长为254nm条件下监控并确证出高纯度维生素K2(MK-7)组分，将不同色谱柱的高纯度维生素K2(MK-7)组分收集到一起浓缩即得维生素K2(MK-7)浓缩物，采用HPLC法鉴定其纯度为99.27％，色谱分离收率为95.09％。

(3)向维生素K2(MK-7)浓缩物中加入15倍质量的乙醇，控制加热温度为70℃，待完全溶解后，以10℃/h速率降温至15℃结晶，陈化30min后离心过滤，滤饼经干燥即得维生素K2(MK-7)精品，含量为96.22％，纯度为99.28％，结晶收率为97.32％，总收率为91.50％。其中，总收率＝提取收率×色谱分离收率×结晶收率，下同。

实施例2(反相色谱柱)

本实施例采用连续动态逆流提取结合中压制备色谱分离纯化的方式从微生物发酵液中提取纯化维生素K2(MK-7)，具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液50L，用浓盐酸进行破壁处理，再采用管式离心机进行固液分离，获得湿菌泥3.2kg。将该湿菌泥与甲醇-二氯甲烷混合溶剂(v:v＝3:1)按质量体积比1kg:8L在连续动态逆流提取器(长径比为100:1)中进行动态逆流提取，控制提取温度为30℃，提取停留时间为1h，获得维生素K2(MK-7)浓度为8160mg/L、提取收率为97.94％的提取液。

(2)将提取液采用中压制备色谱在4根PDVB色谱柱上进行连续分离纯化，具体地，将提取液上样到1#色谱柱，待1#色谱柱进料完毕，切换至2#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂(v:v＝1:5)进行洗脱，保证1#色谱柱洗脱时间与2#色谱柱进料时间一致，2#色谱柱进料完毕，切换至3#色谱柱进行进料，同时1#色谱柱切换至B洗脱剂入口，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂(v:v＝7:3)进行解析，2#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂(v:v＝1:5)进行洗脱，保证1#色谱柱解析时间、2#色谱柱洗脱时间与3#色谱柱进料时间一致，待3#色谱柱进料完毕后切换至4#色谱柱开始进料，同时1#色谱柱切换至C洗脱剂入口，用甲醇进行再生，2#色谱柱切换至B洗脱剂入口，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂(v:v＝7:3)进行解析，3#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂(v:v＝1:5)进行洗脱，保证1#色谱柱再生时间、2#色谱柱解析时间、3#色谱柱洗脱时间与4#色谱柱进料时间一致，以此类推，将提取液连续上样到4根中压制备色谱柱内，不同色谱柱的阀门同步切换，切换时间为0.3h，进料流量控制在3.2L/h，洗脱流速控制在5.5L/h，柱压控制在5bar，柱温控制在35℃，洗脱液采用紫外检测器在检测波长为268nm条件下监控并确证出高纯度维生素K2(MK-7)组分，将不同色谱柱的高纯度维生素K2(MK-7)组分收集到一起浓缩即得维生素K2(MK-7)浓缩物，采用HPLC法鉴定其纯度为99.07％，色谱分离收率为95.81％。

(3)向维生素K2(MK-7)浓缩物中加入20倍质量的乙醇，控制加热温度为70℃，待完全溶解后，以15℃/h速率降温至10℃结晶，陈化1h后离心过滤，滤饼经过干燥即得维生素K2(MK-7)精品，含量为97.22％，纯度为99.33％，结晶收率为96.32％，总收率为90.38％。

实施例3(反相色谱柱)

本实施例采用连续动态逆流提取结合中压制备色谱分离纯化的方式从微生物发酵液中分离提取纯化维生素K2(MK-7)，具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液3m3，用醋酸进行破壁处理，再采用蝶式离心机进行固液分离，获得湿菌泥180kg。将该湿菌泥与甲醇-乙酸乙酯混合溶剂(v:v＝3:1)按质量体积比1kg:10L在连续动态逆流提取器(长径比为60:1)中进行动态逆流提取，控制提取温度为35℃，提取停留时间为1.5h，获得维生素K2(MK-7)浓度为7730mg/L、提取收率为99.05％的提取液。

(2)将提取液采用中压制备色谱在4根RP-18色谱柱上进行连续分离纯化，具体地，将提取液经出料口上样到1#色谱柱，待1#色谱柱进料完毕，切换至2#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用乙酸乙酯-甲醇混合溶剂(v:v＝1:4)进行洗脱，保证1#色谱柱洗脱时间与2#色谱柱进料时间一致，2#色谱柱进料完毕，切换至3#色谱柱进行进料，同时1#色谱柱切换至B洗脱剂入口，用乙酸乙酯-甲醇混合溶剂(v:v＝7:3)进行解析，2#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用乙酸乙酯-甲醇混合溶剂(v:v＝1:4)进行洗脱，保证1#色谱柱解析时间、2#色谱柱洗脱时间与3#色谱柱进料时间一致，待3#色谱柱进料完毕后切换至4#色谱柱开始进料，同时1#色谱柱切换至C洗脱剂入口，用甲醇进行再生，2#色谱柱切换至B洗脱剂入口，用乙酸乙酯-甲醇混合溶剂(v:v＝7:3)进行解析，3#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用乙酸乙酯-甲醇混合溶剂(v:v＝1:4)进行洗脱，保证1#色谱柱再生时间、2#色谱柱解析时间、3#色谱柱洗脱时间与4#色谱柱进料时间一致，以此类推，将提取液连续上样到4根中压制备色谱柱内，不同色谱柱的阀门同步切换，切换时间为0.5h，进料流量控制在600L/h，洗脱流速控制在890L/h，柱压控制在5bar，柱温控制在35℃，洗脱液采用紫外检测器在检测波长为254nm条件下监控并确证出高纯度维生素K2(MK-7)组分，将不同色谱柱的高纯度维生素K2(MK-7)组分收集到一起浓缩即得维生素K2(MK-7)浓缩物，采用HPLC法鉴定其纯度为99.42％，色谱分离收率为97.09％。

(3)向维生素K2(MK-7)浓缩物中加入15倍质量的乙酸乙酯-甲醇(v:v＝2:1)，控制加热温度为70℃，待完全溶解后，以15℃/h速率降温至5℃结晶，陈化2h后离心过滤，滤饼经干燥即得维生素K2(MK-7)精品，含量为95.92％，纯度为99.31％，结晶收率为97.52％，总收率为93.78％。

实施例4(反相色谱柱)

本实施例采用连续动态逆流提取结合中压制备色谱分离纯化的方式从微生物发酵液中分离提取纯化维生素K2(MK-7)，具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液10m³，用醋酸进行破壁处理，再采用蝶式离心机进行固液分离，获得湿菌泥630kg。将该湿菌泥与丙酮-甲醇混合溶剂(v:v＝1:2)按质量体积比1kg:10L在连续动态逆流提取器(长径比为30:1)中进行动态逆流提取，控制提取温度为40℃，提取停留时间为1h，获得维生素K2(MK-7)浓度为8351mg/L、提取收率为99.13％的提取液。

(2)将提取液采用中压制备色谱在4根ODS色谱柱上进行连续分离纯化，具体地，将提取液上样到1#色谱柱，待1#色谱柱进料完毕，切换至2#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用丙酮-甲醇混合溶剂(v:v＝7:13)进行洗脱，保证1#色谱柱洗脱时间与2#色谱柱进料时间一致，2#色谱柱进料完毕，切换至3#色谱柱进行进料，同时1#色谱柱切换至B洗脱剂入口，用丙酮-甲醇混合溶剂(v:v＝3:1)进行解析，2#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用丙酮-甲醇混合溶剂(v:v＝7:13)进行洗脱，保证1#色谱柱解析时间、2#色谱柱洗脱时间与3#色谱柱进料时间一致，待3#色谱柱进料完毕后切换至4#色谱柱开始进料，同时1#色谱柱切换至C洗脱剂入口，用甲醇进行再生，2#色谱柱切换至B洗脱剂入口，用丙酮-甲醇混合溶剂(v:v＝3:1)进行解析，3#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用丙酮-甲醇混合溶剂(v:v＝7:13)进行洗脱，保证1#色谱柱再生时间、2#色谱柱解析时间、3#色谱柱洗脱时间与4#色谱柱进料时间一致，以此类推，将提取液连续上样到4根中压制备色谱柱内，不同色谱柱的阀门同步切换，切换时间为0.8h，进料流量控制在850L/h，洗脱流速控制在1000L/h，柱压控制在7bar，柱温控制在35℃，洗脱液采用紫外检测器在检测波长为268nm条件下监控并确证出高纯度维生素K2(MK-7)组分，将不同色谱柱的高纯度维生素K2(MK-7)组分收集到一起浓缩即得维生素K2(MK-7)浓缩物，采用HPLC法鉴定其纯度为99.33％，色谱分离收率为97.32％。

(3)向维生素K2(MK-7)浓缩物中加入15倍质量的乙醇，控制加热温度为70℃，待完全溶解后，以15℃/h速率降温至10℃结晶，陈化2h后离心过滤，滤饼经干燥即得维生素K2(MK-7)精品，含量为97.07％，纯度为99.53％，结晶收率为98.05％，总收率为94.59％。

实施例5(正相色谱柱)

本实施例采用连续动态逆流提取结合中压制备色谱分离纯化的方式从微生物发酵液中分离提取纯化维生素K2(MK-7)，具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液15m³，用醋酸进行破壁处理，再采用蝶式离心机进行固液分离，获得湿菌泥950kg。将该湿菌泥与异丙醇-正己烷混合溶剂(v:v＝1:2)按质量体积比1kg:15L在连续动态逆流提取器(长径比为30:1)中进行动态逆流提取，控制提取温度为30℃，提取停留时间为2h，获得维生素K2(MK-7)浓度为9015mg/L、提取收率为98.97％的提取液。

(2)将提取液采用中压制备色谱在4根硅胶色谱柱上进行连续分离纯化，具体地，将提取液上样到1#色谱柱，待1#色谱柱进料完毕，切换至2#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用异丙醇-正己烷混合溶剂(v:v＝1:49)进行洗脱，保证1#色谱柱洗脱时间与2#色谱柱进料时间一致，2#色谱柱进料完毕，切换至3#色谱柱进行进料，同时1#色谱柱切换至B洗脱剂入口，用异丙醇-正己烷混合溶剂(v:v＝4:1)进行解析，2#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用异丙醇-正己烷混合溶剂(v:v＝1:49)进行洗脱，保证1#色谱柱解析时间、2#色谱柱洗脱时间与3#色谱柱进料时间一致，待3#色谱柱进料完毕后切换至4#色谱柱开始进料，同时1#色谱柱切换至C洗脱剂入口，用正己烷进行再生，2#色谱柱切换至B洗脱剂入口，用异丙醇-正己烷混合溶剂(v:v＝4:1)进行解析，3#色谱柱切换至A洗脱剂入口，用异丙醇-正己烷混合溶剂(v:v＝1:49)进行洗脱，保证1#色谱柱再生时间、2#色谱柱解析时间、3#色谱柱洗脱时间与4#色谱柱进料时间一致，以此类推，将提取液连续上样到4根中压制备色谱柱内，不同色谱柱的阀门同步切换，切换时间为0.5h，进料流量控制在1180L/h，洗脱流速控制在1300L/h，柱压控制在5bar，柱温控制在35℃，洗脱液采用紫外检测器在检测波长为268nm条件下监控并确证出高纯度维生素K2(MK-7)组分，将不同色谱柱的高纯度维生素K2(MK-7)组分收集到一起浓缩即得维生素K2(MK-7)浓缩物，采用HPLC法鉴定其纯度为99.63％，色谱分离收率为96.22％。

(3)向维生素K2(MK-7)浓缩物中加入20倍质量的乙醇，控制加热温度为70℃，待完全溶解后，以15℃/h速率降温至10℃结晶，陈化2h后离心过滤，滤饼经干燥即得维生素K2(MK-7)精品，含量为96.89％，纯度为99.45％，结晶收率为98.36％，总收率为93.67％。

对比例1(采用静置提取方式)

本对比例采用静置的方式从微生物发酵液中分离提取维生素K2(MK-7)，具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液50L，用浓硫酸进行破壁处理，再采用管式离心机进行固液分离，获得湿菌泥3.0kg。将该湿菌泥与乙醇-丙酮混合溶剂(v:v＝2:1)按质量体积比1kg:10L进行静置萃取，萃取温度为40℃，提取时间为1h，提取次数为1次，获得维生素K2(MK-7)浓度为500mg/L、萃取收率为85.8％的提取液。

(2)将所得维生素K2(MK-7)提取液通过膜分离设备(膜孔径≤0.45μm)除去不溶性杂质，将获得的维生素K2(MK-7)滤液减压蒸干，然后以甲醇重新溶解，获取维生素K2(MK-7)上柱原液。

(3)将维生素K2(MK-7)上柱原液通过大孔吸附树脂柱吸附(芳香族吸附剂)，采用湿法上柱(上柱条件为：高径比为3:1，流速为0.025倍柱体积/min)，然后以极性有机溶剂清洗(用量为大孔吸附树脂柱柱体积的1倍)，最后用二氯甲烷进行洗脱(用量为大孔吸附树脂柱柱体积的1倍)，收集相应洗脱液并对其进行浓缩，获得纯度为65％、大孔吸附树脂分离收率为95.22％的低纯度维生素K2(MK-7)浓缩液。

(4)将低纯度维生素K2(MK-7)浓缩液经过分子量排阻层析柱纯化，以苯进行洗脱(其用量为分子量排阻层析柱柱体积的1倍)，收集相应洗脱液并对其进行浓缩，获得纯度为80％、层析柱纯化收率为95.19％的较高纯度维生素K2(MK-7)浓缩液。

(5)将较高纯度维生素K2(MK-7)浓缩液溶解于甲醇后，通过反相硅胶柱(反相硅胶柱的硅胶粒径为10μm，高径比为5:1，流速为0.015倍柱体积/min，柱高与较高纯度的维生素K2(MK-7)浓缩液上液高度比为7:1)分离，然后用甲醇洗脱并分段收集，纯度>85％的层析液进行浓缩，得到纯度为93.51％、反相硅胶柱分离收率为95.82％的维生素K2(MK-7)浓缩物。

(6)向维生素K2(MK-7)浓缩物中加入10倍质量的乙醇，控制加热温度为60℃，待完全溶解后，以5℃/h速率降温至15℃结晶，陈化30min后离心过滤，滤饼经过滚筒干燥得到维生素K2(MK-7)成品，纯度为99.48％，结晶收率为98.38％，总收率(总收率＝萃取收率×大孔吸附树脂分离收率×层析柱纯化收率×反相硅胶柱分离收率×结晶收率)为74.40％。

对比例2(采用超声振荡提取方式)

本实施例采用超声振荡的方式从微生物发酵液中分离提取维生素K2(MK-7)，具体步骤如下：

将枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液10L，用浓硫酸进行破壁处理，再采用管式离心机进行固液分离，烘干得到干菌泥。称取90g干菌泥，加入7倍体积的甲苯:乙酸丙酯＝10:1(体积比)混合溶剂进行超声振荡提取，控制温度40℃，每次超声振荡30min，分3次提取，离心分离，合并提取液。滤渣再加入7倍体积的甲醇:二丙醚＝10:1(体积比)混合溶剂，再在相同条件下超声振荡提取3次，离心，弃渣，合并提取液，将先后两次混合提取液分别减压浓缩，回收溶剂，合并浓缩物，称重，得75g提取浓缩物，纯度48％，超声提取收率97.38％。用220g层析硅胶进行装柱，再用甲苯与乙酸丙酯(100:1，v/v)配制的洗脱溶剂密实柱子3小时。密实柱子完成后，用75g层析硅胶与所得75g提取浓缩物混合拌样，上柱，然后用上述洗脱溶剂进行洗脱，并用TLC检测(硅胶G板)控制流速及洗脱质量，收集含维生素K2(MK-7)洗脱液。将收集的含维生素K2(MK-7)的洗脱液减压浓缩，回收溶剂，称重，得到含维生素K2(MK-7)的纯化物40g，纯度90.48％，硅胶柱分离收率92.33％。避光操作，将40g含维生素K2(MK-7)的纯化物加入8倍异丙醇:四氢呋喃＝3.3:1(体积比)混合溶剂中，在40℃加热溶解后，在10℃下进行静态结晶，结晶完成后，真空抽滤，收集所得晶体，将其转入真空干燥器中，在避光环境下，干燥48小时，干燥完成后，称重，得到18g维生素K2(MK-7)结晶品，含量为95.23％，纯度为95.48％，结晶收率为92.18％，总收率(总收率＝超声提取收率×硅胶柱分离收率×结晶收率)为82.88％。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (28)

1.一种利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，

所述设备包括连续动态逆流提取器和中压制备色谱；所述连续动态逆流提取器包括提取滚筒，所述提取滚筒的一端设置有菌泥入口及提取液出口且另一端设置有提取剂入口；所述中压制备色谱包括至少一组色谱组，每一组色谱组包括四根并联的色谱柱，每根色谱柱均单独设置有进料口、A洗脱剂入口、B洗脱剂入口和C洗脱剂入口，所述进料口连接连续动态逆流提取器的提取液出口，所述A洗脱剂入口、B洗脱剂入口和C洗脱剂入口分别连接A洗脱剂源、B洗脱剂源和C洗脱剂源，这四个物料入口的开启与关闭各自独立地通过阀门控制，同一色谱组中不同色谱柱的阀门同步切换，且阀门的切换顺序使得同一根色谱柱依次且循环地与连续动态逆流提取器的提取液出口、A洗脱剂源、B洗脱剂源和C洗脱剂源连接；

该方法包括：

(1)将枯草芽孢杆菌发酵产生的维生素K2原液经破壁和固液分离后所得湿菌泥与提取剂分别从菌泥入口和提取剂入口引入连续动态逆流提取器中进行连续动态逆流提取，并将连续动态逆流提取的停留时间控制在0.5～3h，得到提取液；

(2)所述提取液从连续动态逆流提取器的提取液出口引出并送入中压制备色谱中进行色谱分离，所述中压制备色谱柱同一色谱组中的1#色谱柱进料口优先开启以实现进料，待1#色谱柱进样完毕后切换至2#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至A洗脱剂入口以采用A洗脱剂进行洗脱，保证1#色谱柱洗脱时间与2#色谱柱进料时间一致，待2#色谱柱进料完毕后切换至3#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至B洗脱剂入口以采用B洗脱剂进行解析，2#色谱柱切换至A洗脱剂入口以采用A洗脱剂进行洗脱，保证1#色谱柱解析时间、2#色谱柱洗脱时间与3#色谱柱进料时间一致，待3#色谱柱进料完毕后切换至4#色谱柱开始进料，进料的同时1#色谱柱切换至C洗脱剂入口以采用C洗脱剂进行再生，2#色谱柱切换至B洗脱剂入口以采用B洗脱剂进行解析，3#色谱柱切换至A洗脱剂入口以采用A洗脱剂进行洗脱，保证1#色谱柱再生时间、2#色谱柱解析时间、3#色谱柱洗脱时间与4#色谱柱进料时间一致，以此类推，同一色谱组中不同色谱柱的阀门同步切换，且阀门的切换顺序使得同一根色谱柱依次且循环地与连续动态逆流提取器的提取液出口、A洗脱剂源、B洗脱剂源和C洗脱剂源连接，正相色谱中三种洗脱剂的极性由大到小排列顺序依次为B洗脱剂＞A洗脱剂＞C洗脱剂，反相色谱中三种洗脱剂的极性由大到小排列顺序依次为C洗脱剂＞A洗脱剂＞B洗脱剂，收集各色谱柱流出的洗脱液，浓缩后得到维生素K2浓缩液；

正相色谱中，所述A洗脱剂含有组分11和组分12；所述B洗脱剂含有组分11和任选的组分12；所述C洗脱剂含有组分12和任选的组分11；所述组分11选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇和异戊醇中的至少一种，所述组分12选自石油醚、异丙醚、二异丙醚、乙基丁基醚、正己烷、环己烷、正庚烷、二硫化碳、正辛烷、环戊烷、甲基环戊烷和甲基环己烷中的至少一种；

反相色谱中，所述A洗脱剂含有组分21和组分22；所述B洗脱剂含有组分21和任选的组分22；所述C洗脱剂含有组分22和任选的组分21；所述组分21选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷和氯仿中的至少一种，所述组分22选自水、甲醇、乙醇、乙腈、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇和N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述连续动态逆流提取器中提取滚筒的长径比为(30～100):1。

3.根据权利要求1或2所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述中压制备色谱包括1～8组色谱组。

4.根据权利要求3所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，同一色谱组的不同色谱柱中装填的填料相同，选自极性大孔吸附树脂、离子交换树脂、改性氧化铝、无定型硅胶、球型硅胶和高聚物改性填料中的至少一种。

5.根据权利要求1或2所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述设备还包括破壁机和固液分离机。

6.根据权利要求5所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述固液分离机为离心分离器。

7.根据权利要求1所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述维生素K2原液采用酸或碱进行破壁处理。

8.根据权利要求7所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述酸为有机酸和/或无机酸，所述有机酸选自甲酸、乙酸、丙酸、乙二酸、氨基磺酸、柠檬酸和乙二胺四乙酸中的至少一种，所述无机酸选自硫酸、盐酸、硝酸和磷酸中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钙和氨水中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述提取剂选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲苯、氯仿、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇、正己烷、正庚烷、二硫化碳、正辛烷、环戊烷、环己烷、甲基环戊烷、二氯甲烷、四氯化碳、石油醚、异丙醚、二异丙醚、四氢呋喃、二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。

11.根据权利要求1所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述连续动态逆流提取的条件包括温度为15～40℃，所述湿菌泥与提取剂的质量体积料液比为1kg:(3～20)L。

12.根据权利要求1所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，正相色谱中，所述A洗脱剂中，组分12的体积百分比≥55％；所述B洗脱剂中，组分11的体积百分比≥20％；所述C洗脱剂中，组分12的体积百分比≥90％；

反相色谱中，所述A洗脱剂中，组分22的体积百分比≥55％；所述B洗脱剂中，组分21的体积百分比≥20％；所述C洗脱剂中，组分22的体积百分比≥90％。

13.根据权利要求12所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，正相色谱中，所述A洗脱剂中，组分12的体积百分比≥90％。

14.根据权利要求12所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，正相色谱中，所述B洗脱剂中，组分11的体积百分比≥70％。

15.根据权利要求14所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，正相色谱中，所述B洗脱剂中，组分11的体积百分比为100％。

16.根据权利要求12所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，正相色谱中，所述C洗脱剂中，组分12的体积百分比≥95％。

17.根据权利要求16所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，正相色谱中，所述C洗脱剂中，组分12的体积百分比为100％。

18.根据权利要求12所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，反相色谱中，所述A洗脱剂中，组分22的体积百分比≥75％。

19.根据权利要求12所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，反相色谱中，所述B洗脱剂中，组分21的体积百分比≥70％。

20.根据权利要求19所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，反相色谱中，所述B洗脱剂中，组分21的体积百分比为100％。

21.根据权利要求12所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，反相色谱中，所述C洗脱剂中，组分22的体积百分比≥95％。

22.根据权利要求21所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，反相色谱中，所述C洗脱剂中，组分22的体积百分比为100％。

23.根据权利要求1所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述中压制备色谱的操作参数控制如下：进料液流速为1～1000L/h，洗脱剂流速为1～1000L/h，洗脱温度为0～50℃，压力为5～20bar，切换时间为0.3～2h。

24.根据权利要求1所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，该方法还包括将所述维生素K2浓缩液进行重结晶。

25.根据权利要求24所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述重结晶的方法为将维生素K2浓缩液采用重结晶试剂溶解，之后依次进行降温结晶、过滤和干燥，得到维生素K2精品。

26.根据权利要求25所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述维生素K2浓缩液与重结晶试剂的质量比为1:(5～50)。

27.根据权利要求25所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述重结晶试剂选自甲酸甲酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、冰醋酸、水、苯、正庚烷、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丙醇、乙醚、二氯甲烷、异丙醚、石油醚、二异丙醚、乙基丁基醚、丙酮、丁酮、正己烷和正庚烷中的至少一种。

28.根据权利要求25所述的利用从微生物发酵液中提取维生素K2的设备从微生物发酵液中提取维生素K2的方法，其特征在于，所述降温结晶过程的降温速率控制在5～15℃/h，终温控制在0～25℃。

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