CN111547718A - 复合型活性炭及其在纯化他克莫司中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物制备技术领域，公开了一种复合型活性炭及其在纯化他克莫司中的应用。本发明通过采用发酵液过滤、烘干、浸提、萃取、洗涤、复合型活性炭脱色除杂，结晶的纯化方法，解决了现有他克莫司纯化方法中纯化收率低、耗时长、洗脱溶剂用量大、污染高、不利于工业化大生产的问题。本发明中提供的方法规模化生产操作简单，溶媒耗用量少，生产周期短，得到的他克莫司粗品纯度高，为白色或类白色粉未，重量含量在85%以上，HPLC归一含量在90%以上。

Description

复合型活性炭及其在纯化他克莫司中的应用

技术领域

本发明涉及一种医药制备技术领域，具体涉及一种复合型活性炭及其制备和在纯化他克莫司中的应用。

背景技术

他克莫司是一种新型强效的大环内酯类免疫抑制剂，1991 年日本开发的名为普乐可复(Prograf) 他克莫司胶囊剂和注射剂正式上市，用于原发性肝移植和肾移植的排斥反应治疗，后又被批准用于骨髓移植。目前他克莫司制剂已在中国、日本、美国等80 多个国家上市，广泛应用于肝脏、胰腺、肾脏、心脏和肺等实体器官移植后的抗排异治疗。1999 年他克莫司软膏投放日本市场，用于治疗成人的特应性皮炎。

他克莫司是从链霉菌属（streptomyces tsukubaensis）中分离出的发酵产物，发酵过程同时也产生了多个他克莫司类似物，包括二氢他克莫司和子囊霉素等杂质；这些杂质和他克莫司结构极为相似，物理化学性质相近，通过常规的纯化技术难于获得较高纯度的原料药，从而难以满足市场需要。现有关于他克莫司分离纯化的文献中虽然均揭露了用吸附树脂或改性硅胶或高速逆流色谱技术来精制他克莫司，但存在着纯化收率低、工业化成本高的问题。

由于他克莫司结构复杂，手性基团比较多，而且其发酵液中有很多异构体和类似物，如二氢他克莫司、子囊霉素等，这些物质的存在使得他克莫司采用常规的分离纯化方法无法完全分离而达到相应的纯度。

中国发明专利CN85109492，公开了一种通过大孔吸附树脂HP20，硅胶，活性炭来制备FK506粗品的方法：a.浸提：用有机溶剂来浸泡发酵液过滤得到的菌丝体，过滤得浸提液，b.吸附和解吸：浸提液中投入树脂HP20吸附，有机溶剂和水的混合溶剂洗脱，收集液浓缩，c.萃取：浓缩液中加入乙酯等疏水性溶剂萃取，萃取液浓缩，d.硅胶层析：萃取浓缩液通过硅胶柱，用乙酯正己烷混合液洗脱，收集洗脱液浓缩得粗品。

美国发明专利US2012065393 (A1)，公开了一种制备FK506粗品的方法：a.浸提：用醇，酮，酯类有机溶剂来浸泡发酵液过滤得到的菌丝体，过滤得浸提液，b.反萃取：浸提液中加入卤代烷类来反萃，萃取液浓缩，c.柱层析：萃取浓缩液稀释后过硅胶柱或氧化铝柱除掉色素和油脂，d.结晶：收集洗脱液浓缩至一定体积加入去离子水，搅拌降温结晶，e.过滤的湿晶，用烷烃洗涤，烘干得粗品，粗品纯度在92～95%之间，收率在70～75%之间。

中国发明专利CN200580043951.6，公开了一种提纯大环内酯的方法，其中大环内酯样品树脂吸附后用有机溶剂洗脱,有机溶剂选自THF、乙腈、正丙醇、异丙醇、乙醇和丙酮,收集洗脱液的中间级分,收集提纯的大环内酯，结晶采用乙酸乙酯，环己烷和水的三相系统。

中国发明专利 CN200910146385，公开了一种将链霉菌发酵液用板框压滤得到菌体,用有机溶剂多次室温浸提菌体,得到浸提液,将浸提液浓缩后进行大孔树脂和硅胶柱层析,柱层析所得他克莫司用混合溶剂进行浓缩结晶,他克莫司的纯度达96.5%。

以上纯化方法均采用正相或反相柱层析的方法来获得粗品，需用特殊的设备、消耗大量的有机溶剂，产生大量的废水，废液、废弃填料如硅胶等，其中洗脱溶剂如正己烷、卤代烷等对人体毒性大，工艺耗时长，操作复杂且不安全。

中国发明专利CN200480008682.5，公开了一种大环内酯物质的结晶与纯化方法，用极性溶剂如乙酸异丁酯、乙酸乙酯萃取，所得萃取液加入水或甲醇～水～正己烷体系洗涤、浓缩后获得油状物浓缩物，然后与极性溶剂、烃溶剂及其含碱的水溶液混合，重结晶，获得大环内脂如他克莫司的粗品，但是获得粗品的纯度低，最高纯度为85.03%；该方法虽然没有用到柱层析纯化，但需要进一步纯化才能达到药品标准的要求。

因此，本领域急需一种操作简单、生产周期短、纯度和收率高、洗脱溶剂用量少、绿色环保、利于工业化大生产的粗品纯化方法。

发明内容

本发明的目的就是为了克服现有技术中纯化分离他克莫司发酵液杂质多，分离难度大，现有纯化方法复杂、耗时长、纯度和收率低的不足，提供了一种复合型活性炭及其在纯化他克莫司中的应用，解决了现有纯化方法中纯化收率低、耗时长、洗脱溶剂用量大、污染高、不利于工业化大生产的问题。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种复合型活性炭，所述复合型活性炭的比表面积为800～1000 m²/g，孔径为2.0～8.0 nm ，孔的容积为0.5～1.0cm³/g。

该复合型活性炭比表面积大小即能满足很好的脱色效果，又能兼顾顺畅的过滤速度，若比表面积太大，相应的复合型活性炭颗粒太小，在过滤时容易堵塞，不利于工业化大生产；比表面太小，脱色除杂效果就弱；该孔径范围能较好兼顾脱色和除掉干扰结晶杂质的作用，若孔径小于 2nm，主要应用于气相吸附或液相中的小分子吸附，对大分子吸附较弱；若孔径大于8.0 nm，大分子吸附效果较好，但小分子吸附效果减弱，无法起到脱色除杂效果。

本发明还提供了一种复合型活性炭的制备方法，包括如下步骤：

1）木屑的筛选和干燥

筛选出粒径为6～40目的木屑，将木屑在120～150℃的热空气进行气流干燥，干燥后木屑含水率为15～20%；所述热空气流速为6～10米/秒，优选8米/秒。

2）配制浓度为65～75%的碱性水溶液。

3）捏和

将步骤1）中干燥后木屑与步骤2）中碱性水溶液搅拌条件下捏和；所述木屑的重量与碱性水溶液的重量比为0.8～1.2：1，优选1:1。

该捏和工序是为了将木屑与碱性水溶液，借助捏和机中一对之字形搅拌桨不停搅拌，反复揉压，使它们混合均匀，加速碱性水溶液向木屑内部渗透。

4）木屑炭化和活化

将步骤3）中捏和后的木屑在氮气保护下炭化0.5～1.5 h，优选1.0 h，炭化温度为250～300℃，优选280℃；接着将木屑在700～900℃，优选800℃活化，活化时间2.0h。

5）回收

将活化后木屑用40～50%的盐酸溶液洗涤，接着用90～100℃的热水清洗； 6）离心脱水、干燥至含水率4～6%，最后磨粉即为复合型活性炭。

作为优选，步骤1）中所述木屑干燥前含水率为40%；步骤2）中所述碱性

水溶液为氢氧化钠、氢氧化钾水溶液。

本发明还提供了一种复合型活性炭在纯化他克莫司中的应用。

本发明还提供了一种复合型活性炭用于纯化他克莫司的方法，包括如下步骤：

1）发酵液预处理：先将他克莫司发酵液过滤、浸提、萃取、洗涤后，获得含有他克莫司的有机相。

2）复合型活性炭除杂：将1）中的有机相加入复合型活性炭，搅拌、过滤、浓缩，得浓缩液。

3）结晶：将2）中的浓缩液用极性溶剂、抗溶剂和水结晶，获得他克莫司粗品。

作为优选，步骤1）中所述浸提是用中等极性的有机溶剂，更优选乙醇、异丙醇、丙酮，最优选乙醇。

所述萃取是用低级酯类溶剂溶解，优选乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸丁酯，更优选乙酸乙酯；再加入碱溶液，所述碱溶液优选NaOH，KOH，K₂CO₃，Na₂CO₃，氨水溶液；搅拌、分离，收集有机相。

作为优选，步骤2）中所述复合型活性炭与他克莫司重量比为0.5～5：1，优选1：2；室温搅拌1～2h。

作为优选，步骤3）中所述极性溶剂为乙酸乙酯、丙酮、乙醇，优选乙酸乙酯，所述抗溶剂为正己烷、正庚烷、石油醚、异丙醚，优选正庚烷；所述极性溶剂：抗溶剂：水的体积比为0.5～1.5：1～5：0.5～2。

作为优选，步骤3）中所述浓缩液先用极性溶剂溶解，再将所述抗溶剂和水分批加入极性溶剂中，继续搅拌1h，静置过夜。

本发明与现有技术相比，带来的意料不到的技术效果如下：

现有技术中萃取步骤通常在大孔吸附树脂处理之后，本发明中省掉树脂处理直接将浸提液萃取，通过碱溶液的处理，将大量色素，水溶性杂质及部分油脂除去，然后通过结晶的方式得到粗品。相对于公开专利中用大孔树脂和硅胶层析的纯化方法，本发明提供的纯化方法工艺简单、耗时短、洗脱溶剂用量大大减少、污染低，利于绿色生产，而且操作简单，有利于工业化大生产。

附图说明

图1是本发明实施例1复合型活性炭的扫描电镜照片；

图2是本发明实施例1复合型活性炭的孔径分布图；

图3是本发明实施例2获得他克莫司粗品的HPLC谱图。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。

本发明用到的仪器如下：

检测仪器及方法：

采用日本日立S～4800 型扫描电子显微镜对制备的复合型活性炭进行SEM 分析，操作电压为5.0kV，电流10μA，工作距离8 mm。样品在进行观察之前在真空下进行表面喷金处理，真空度10Pa，喷金时间60s。

高效液相色谱（HPLC）谱图数据采自于高效液相色谱仪：Agilent 1260 ；

色谱柱： C8柱（4.6 ×150mm, 5µm）；

流动相：溶液A：0.02mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至 3.5。

溶液B：乙腈；

紫外检测波长：210nm；

柱温：60℃；

流速：1.0ml/min；进样量：20ul。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

复合型活性炭的制备方法

1）木屑的筛选和干燥

将含水率为40%、已粉碎的木屑由斗式提升机送到振动筛筛选，获得粒径为6～40目的木屑，由鼓风机输送到旋风分离器，分离后的木屑落如贮仓中。

木屑由贮仓下面圆盘加料器定量连续地落入螺旋进料器，加入热风管，将木屑在120～150℃的热空气进行气流干燥，其中热空气流速为8米/秒；干燥后木屑含水率为18%。

2）配制成浓度为70%的氢氧化钾水溶液。

3）捏和

将步骤1）中干燥后木屑与步骤2）中氢氧化钾水溶液搅拌条件下捏和；所述木屑的重量与氢氧化钾水溶液的重量比为1:1。

4）木屑炭化和活化

将步骤3）中捏和后的木屑在氮气保护下炭化1.0 h，炭化温度为280℃；接着将木屑在800℃活化，活化时间2.0 h。

5）回收

将活化后木屑用45%的盐酸溶液洗涤，接着用95℃的热水清洗。 6）离心脱水、干燥至含水率4～6%，最后磨粉即为复合型活性炭。

图1 是本发明复合型活性炭的扫描电镜照片。由图可知，本发明复合型活性炭属于国际化学会分类的I类型，具有优异的吸附性能，较宽的孔径范围兼顾小分子和大分子物质杂质的去除。图2是本实施例复合型活性炭的孔径分布图。

实施例2

取发酵液菌渣1000g,用7L乙醇浸提后，获得浓缩液约60g，用乙酸乙酯稀释到500ml,加入500ml 2% NaOH水溶液，50℃保温3小时后分层得乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中再加入1%NaOH水溶液500ml，搅拌均匀后静置过夜。

次日，分离得萃取液，加入12g按本实施例1制备得到的复合型活性炭，室温搅拌1h后过滤，适量乙酸乙酯淋洗，得滤液700ml。

浓缩滤液至约40g，加入30ml乙酸乙酯溶解，保温搅拌1h，在1h内分批加入40ml纯化水和160ml正己烷，继续搅拌1h，静置过夜。

过滤结晶液，分别用40ml正己烷和40ml纯水洗涤，50～70℃烘干得粗品10g(含FK506约9g），归一含量93%，见图3。从菌渣到结晶粗品的总收率约78%。

实施例3

1）取发酵液菌渣2500g,用20L丙酮浸提后，获得浓缩液约150g，用甲酸乙酯稀释到1800ml,加入600ml1% Na₂CO₃水溶液，50℃保温3小时后分层。

2）分层后，在甲酸乙酯相中再加入600ml 0.5% Na₂CO₃，搅拌均匀后静置过夜。

3）次日，分离得萃取液，加入40g按本实施例1制备得到的复合型活性炭，室温搅拌1h后过滤，适量甲酸乙酯淋洗，得滤液。

4）浓缩滤液至约100g，加入100ml丙酮溶解，室温搅拌1h，在0.5h内分批加入50ml纯化水和500ml正庚烷，继续搅拌1h，静置过夜。

5）过滤结晶液，分别用100ml正庚烷和100ml纯水洗涤，50～70℃烘干得粗品28g(含FK506 24g），归一含量92.3%，从菌渣到结晶粗品的总收率为80%。

实施例4

1）取发酵液菌渣2000g,用16L异丙醇浸提后，获得浓缩液约120g，用乙酸丁酯稀释到1200ml,加入600ml0.5% KOH水溶液，50℃保温3小时后分层。

2）分层后，在乙酸丁酯相中再加入600ml 0.5% KOH水溶液，搅拌均匀后静置过夜。

3）次日，分离得萃取液，加入约50g按本实施例1制备得到的复合型活性炭，室温搅拌2h后过滤，适量乙酸丁酯淋洗，得滤液。

4）浓缩滤液至约80g，加入50ml乙醇溶解，室温搅拌1h，在1.5h内分批加入200ml纯化水和300ml异丙醚，继续搅拌1h，静置过夜。

5）过滤结晶液，分别用80ml异丙醚和80ml纯水洗涤，50～70℃烘干得粗品22.5g(含FK506约 19.5g），归一含量91.8%，从菌渣到结晶粗品的总收率为80.5%。

实施例5

1）发酵液菌渣提取浓缩液50L，用乙醇稀释到500L,加入1.5% Na₂CO₃水溶液500L，50℃保温15分钟后静置过夜。

2）次日，分层后，在乙酸乙酯相中再加入0.5% Na₂CO₃水溶液500L，搅拌均匀后静置过夜。

3）第三天，分离得萃取液，加入约10kg按本实施例1制备得到的复合型活性炭，室温搅拌2h后过滤，100L乙酸乙酯淋洗，得滤液。

4）浓缩滤液至约30L，加入22.5L乙酸乙酯溶解，室温搅拌，在1h内分批加入30L纯化水和60L石油醚，继续搅拌1h，静置过夜。

5）过滤结晶液，分别用30L石油醚和30L纯水洗涤，50～70℃烘干得粗品9Kg(含FK506 7.8Kg），归一含量92.1%，从菌渣到结晶粗品的总收率78%。

实施例6：不同复合型活性炭对他克莫司分离纯化的影响

对比例1、2分别采用浙江杭木工业有限公司活性炭分公司的8815活性炭、日本武田公司白鹭Z活性炭进行分离纯化，与本发明实施例2的区别仅在于活性炭类型不同，其他工艺均与本发明实施例2相同。具体获得他克莫司粗品的参数如下：

从上表知，本发明的复合型活性炭在纯化他克莫司时，该孔径范围能较好兼顾脱色和除掉干扰结晶杂质的作用，具有优异的吸附性能，能明显提高产品的重量含量和结晶收率，有利于工业化大生产。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种复合型活性炭，其特征在于，所述复合型活性炭的比表面积为800～1000 m²/g，孔径为2.0～8.0 nm ，孔的容积为0.5～1.0cm³/g。

2.如权利要求1所述复合型活性炭的制备方法，包括如下步骤：

1）木屑的筛选和干燥

筛选出粒径为6～40目的木屑，将木屑在120～150℃的热空气进行气流干燥，干燥后木屑含水率为15～20%；所述热空气流速为6～10米/秒，优选8米/秒；

2）配制浓度为65～75%的碱性水溶液；

3）捏和

将步骤1）中干燥后木屑与步骤2）中碱性水溶液搅拌条件下捏和；所述木屑的重量与碱性水溶液的重量比为0.8～1.2：1，优选1:1；

4）木屑炭化和活化

将步骤3）中捏和后的木屑在氮气保护下炭化0.5～1.5 h，优选1.0 h，炭化温度为250～300℃，优选280℃；接着将木屑在700～900℃，优选800℃活化，活化时间2.0h；

5）回收

将活化后木屑用40～50%的盐酸溶液洗涤，接着用90～100℃的热水清洗； 6）离心脱水、干燥至含水率4～6%，最后磨粉即为复合型活性炭。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述木屑干燥前

含水率为40%；步骤2）中所述碱性水溶液为氢氧化钠、氢氧化钾水溶液。

4.如权利要求1所述复合型活性炭在纯化他克莫司中的应用。

5.如权利要求1至3中任一项所述复合型活性炭用于纯化他克莫司的方法，包括如下步骤：

1）发酵液预处理：先将他克莫司发酵液过滤、浸提、萃取、洗涤后，获得含有他克莫司的有机相；

2）复合型活性炭除杂：将1）中的有机相加入复合型活性炭，搅拌、过滤、浓缩，得浓缩液；

3）结晶：将2）中的浓缩液用极性溶剂、抗溶剂和水结晶，获得他克莫司粗品。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1）中

所述浸提是用中等极性的有机溶剂，优选乙醇、异丙醇、丙酮，更优选乙醇；

所述萃取是用低级酯类溶剂溶解，优选乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸丁酯，更优选乙酸乙酯；再加入碱溶液，所述碱溶液优选NaOH，KOH，K₂CO₃，Na₂CO₃，氨水溶液；搅拌、分离，收集有机相。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碱溶液与有机相的体积比为1:1～3，优选1:1。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述复合型活性炭与他克莫司重量比为0.5～5：1，优选1：2；室温搅拌1～2h。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3）中所述极性溶剂为乙酸乙酯、丙酮、乙醇，优选乙酸乙酯，所述抗溶剂为正己烷、正庚烷、石油醚、异丙醚；所述极性溶剂：抗溶剂：水的体积比为0.5～1.5：1～5：0.5～2。

10.如权利要求5或9所述的方法，其特征在于，步骤3）中所述浓缩液先用极性溶剂溶解，再将所述抗溶剂和水分批加入极性溶剂中，继续搅拌1h，静置过夜。

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