KR101418788B1 - 당전이 효소를 이용한 케르세틴 배당체의 제조방법 - Google Patents

당전이 효소를 이용한 케르세틴 배당체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당전이 효소를 이용한 케르세틴(quercetin) 배당체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E(UDP-glycosyltransferase E) 및 UDP-글루코오스 재생산 시스템을 이용하여 케르세틴에서 케르세틴-3-글리코사이드(quercetin-3-glycoside)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법으로 생산된 케르세틴-3-글리코사이드는 케르세틴보다 3 내지 10배가량 생체에서 흡수도가 높고 케르세틴의 항산화, 항염증 및 기억력 증강 등의 효과가 동일하기 때문에 식품, 의약품 및 화장용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

당전이 효소를 이용한 케르세틴 배당체의 제조방법{Method for Preparing Quercetin Glycoside Using Glycosyltransferase}
본 발명은 당전이 효소를 이용한 케르세틴(quercetin) 배당체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E(UDP-glycosyltransferase E) 및 UDP-글루코오스 재생산 시스템을 이용하여 케르세틴에서 케르세틴-3-글리코사이드(quercetin-3-glycoside)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
식물 유래의 여러 가지 파이토케미칼(phytochemical) 중에서, 플라보노이드(flavonoid)는 식품에 널리 분포하는 노란색 계통의 색소로, 페닐기 2개가 C3 사슬에 매개하여 C6-C3-C6형 탄소 골격구조로 되어 있으며, 이것이 여러 당류와 에테르 결합을 통해 배당체(glycoside)의 형태로 존재하는 경우가 많다. 플라보노이드는 항균, 항암, 항바이러스, 항알레르기 및 항염증 활성이 있고, 의약분야에서는 새로운 플라보노이드 물질이 추출됨에 따라 치료대상 질환이 다양해져서 간질환, 당뇨병, 류마티스관절염, 각종 암, 진통, 바이러스성 질환, 알레르기성 질환, 동맥경화 등 혈관계 질환, 심근 관련 질환, 스트레스 및 우울증 등에 약리활성이 있다는 것이 알려지면서 물질의 개발 및 활용에 관한 관심이 커지고 있다.
케르세틴은 항산화, 항염증 및 기억력 증강의 효과가 있는 것으로 알려져 있는 플라보노이드로서, 사과, 살구, 포도 및 베리류와 같은 과일 또는 브로커리, 상추, 토마토 및 양파와 같은 야채에 있는 것으로 알려져 있다. 케르세틴은 다른 플라보노이드처럼 항산화 효과가 있어 활성산소를 제거하고 세포 내 글루타티온의 양을 적절하게 유지시키며, 면역체계를 유지시키고 히스타민의 방출과 염증반응을 조절하는 항염증 및 항 알레르기 효과 및 동맥경화를 막고 혈압을 감소시키는 효과가 알려져 있으며, 케르세틴의 배당체는 장내의 포도당 흡수를 저해하는 효과가 있는 것으로 알려져 케르세틴에 대한 연구가 다양하게 진행되고 있다 (Jeremy Appleton, ND et al ., Natural Medicine Journal, 2(1):1, 2010).
케르세틴은 플라보노이드계 화합물들처럼 열에 대한 불안정성, 산화 조건에 대한 불안정성 및 물에 대한 불용성 등의 문제점이 있으나, 케르세틴의 배당체는 이러한 문제가 감소하고 생물학적 이용성이 증가는 것으로 알려져 있으며, 식물체 내에서도 비배당체 형태보다는 글루코오스(glucose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galactose) 및 아라비노오스(arabinose) 등 여러 종류의 단일 또는 다수의 당과 결합된 배당체의 형태로 존재한다. 특히 케르세틴-3-글리코사이드는 케르세틴보다 일반적으로 3배 내지 10배까지 생물학적 이용성이 증가하는 것으로 알려져 있으며(Hollman P.C. et al ., in man Free Radic Res ., 31(6):569, 1999; Margreet R. Olthof et al ., J. Nutr ., 130:12001203, 2000), 항종양 활성이 다른 소재보다 뛰어남이 확인되었다. 또한 케르세틴-3-글리코사이드는 피부노화를 방지하고 주름을 개선할 수 있는 것으로 알려져 있어 기능성 화장품의 소재로도 활용이 가능하다. 따라서 케르세틴으로부터 케르세틴-3-글리코사이드로의 제조공정의 개발이 요구되고 있다.
한편, 케르세틴의 배당화에 사용되는 당전이 효소는 당공여체로 주로 UDP-글루코오스 및 수크로오스(sucrose)를 사용하며, UDP-글루코오스를 당 공여체로 하여 당전이에 이용하는 방법(Soo In Ryu et al ., Biochemical and Biophysical Research Communications ., 329;429, 2005; Robert P. Gibson et al ., Chemistry & Biology , 9;1337, 2002; Anne M. Mulichak et al ., Structure , 9;547, 2001) 및 당전이 효소를 이용한 당전이 화합물 유도체의 제조방법이 공지되어 있고(한국등록특허 제0800506호; 한국등록특허 제0347789호; 한국등록특허 제0716797호; 한국등록특허 제0228885호; 한국등록특허 제0782086호; 한국등록특허 제0317021호; 한국공개특허 제2010-0001907; Jae Hyung Ko et al ., FEMS Microbiol Lett ., 258:263, 2006; Pace M. et al ., Journal of chromatography . A, 69:331, 1995), 당공여체로 사용하는 UDP-글루코오스를 재생산하여 사용하는 시스템에 대한 연구가 이루어지고 있으나(NAKAJIMA Nobuyoshi et al ., Biosci . biotechnol ., biochemistry ., 63(5):934, 1999; Dong Q. et al ., Carbohydr Res. 345(11):1622, 2010), 상기 선행기술은 기질의 전환율이 낮고, 당전이 효소가 불안정하며 케르세틴의 3-OH에 정확하게 글리코실레이션(glycosylation)을 하지 못하는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 기질 전환율이 높고, 안정한 당전이 효소를 개발하고자 예의 노력한 결과, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E 및 UDP-글루코오스 재생산 시스템을 이용하면 높은 전환율로 케르세틴에서 케르세틴-3-글리코사이드를 생산하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E 및 UDP-글루코오스 재생산 시스템을 이용한 케르세틴 배당체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase) 존재하에 말토덱스트린(maltodextrin)과 포스페이트(phosphate)를 반응시켜 글루코오스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate)를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 글루코오스-1-포스페이트를 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈(glucose-1-phosphate thymidylyltrasferase) 존재하에 UTP와 반응시켜 UDP-글루코오스(glucose)를 제조하되, 상기반응에 의해서 생성되는 피로포스페이트(pyrophosphate; PPi)를 인오가닉 피로포스파테이즈(inorganic pyrophosphatase) 존재하에 두 분자의 포스페이트로 가수분해시킨 다음, 생성된 포스페이트를 (a) 단계에 투입하는 단계; 및 (c) 상기 제조된 UDP-글루코오스를 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E(UDP-glycosyltransferase E) 존재하에 케르세틴과 반응시켜 케르세틴-3-글리코사이드(quercetin-3-glycoside)를 제조하되, 상기 반응에서 생성되는 UDP를 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 존재하에 아세틸포스페이트(acetylphosphate)와 반응시켜 UTP를 생성한 다음, 생성된 UTP를 (b)단계에 투입하는 단계를 포함하는 케르세틴 배당체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법으로 생산된 케르세틴-3-글리코사이드는 케르세틴보다 3 내지 10배가량 생체에서 흡수도가 높고 케르세틴의 항산화, 항염증 및 기억력 증강 등의 효과가 동일하기 때문에 식품, 의약품 및 화장용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 케르세틴(a)과 케르세틴-3-글리코사이드(b)의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 케르세틴의 배당체 제조방법에 관한 전체 반응 도식을 나타낸 것이다.
도 3은 바실러스 리체포르미스 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 정제도를 나타낸 것이다.
도 4는 재조합 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E를 이용한 케르세틴의 당전이 반응을 나타낸 그래프이다.
도 5는 재조합 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 생화학적 특성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 말토텍스트린 포스포릴레이즈(malP), 글루코오스-1-포스페이트 피미딜리트랜스퍼레이즈(galU), 인오가닉 피로포스파테이즈(ppa) 및 아세테이트 키나아제(ackA)의 정제도를 나타낸 것이다.
도 7은 표준물질 UDP-글루코오스(a) 및 UDP-글루코오스 재생산 시스템에서 생산된 UDP-글루코오스(b)의 HPLC 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 UDP-글루코오스 재생산 시스템에서 각각의 효소들의 최적반응을 나타낸 그래프이다.
도 9는 UDP-글루코오스 재생산 시스템을 이용한 케르세틴의 당전이 반응을 나타낸 그래프이다.
도 10은 아세틸포스페이트와 UTP농도에 다른 케르세틴-3-글리코사이드 생성 반응의 상대적인 활성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 UDP-글루코오스 재생산 시스템을 이용하여 대량의 케르세틴을 반응시킨 후 시간에 따른 기질과 반응산물의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 UDP-글루코오스 재생산 시스템을 이용하여 대량의 케르세틴의 반응 전(a), 반응 후(b), 정제 후(c) 배당화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 정제한 케르세틴-3-글리코사이드의 NMR결과를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase) 존재하에 말토덱스트린(maltodextrin)과 포스페이트(phosphate)를 반응시켜 글루코오스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate)를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 글루코오스-1-포스페이트를 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈(glucose-1-phosphate thymidylyltrasferase) 존재하에 UTP와 반응시켜 UDP-글루코오스(glucose)를 제조하되, 상기반응에 의해서 생성되는 피로포스페이트(pyrophosphate; PPi)를 인오가닉 피로포스파테이즈(inorganic pyrophosphatase) 존재하에 두 분자의 포스페이트로 가수분해시킨 다음, 생성된 포스페이트를 (a) 단계에 투입하는 단계; 및 (c) 상기 제조된 UDP-글루코오스를 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E(UDP-glycosyltransferase E) 존재하에 케르세틴과 반응시켜 케르세틴-3-글리코사이드(quercetin-3-glycoside)를 제조하되, 상기 반응에서 생성되는 UDP를 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 존재하에 아세틸포스페이트(acetylphosphate)와 반응시켜 UTP를 생성한 다음, 생성된 UTP를 (b)단계에 투입하는 단계를 포함하는 케르세틴 배당체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E(UDP-glycosyltransferase E)는 서열번호 1의 염기서열에 의해 코딩되는 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 바실러스 리체니포르미스 균주가 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E를 발현하는 것을 확인하고, 대장균(Escherichia coli)에 형질전환체를 구축하여 발현된 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E를 정제였으며, 정제된 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 정제단계에 따른 활성 및 회수율을 확인한 결과, UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E는 88%의 수율로 8.5배의 정제도를 보이는 것을 확인하였다 (도 3 및 표 2).
상기에서 생산된 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 특성을 알아보기 위해 케르세틴과 반응시킨 결과, 케르세틴의 3-OH에 작용하여 케르세틴-3-글리코사이드를 생산하는 것을 확인하였으며(도 4), 케르세틴과의 최적반응조건을 알아보기 위해 반응온도, pH 및 온도와 pH에 대한 안정성을 조사하였다. 그 결과, UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E는 40℃ 및 pH 7.5에서 최대 활성을 보였으며, pH 7.0~8.0에서 비교적 안정된 것을 확인하였다. 또한, 열에 대한 안정성을 알아보기 위해 40~80℃의 범위에서 10℃ 간격으로 시간에 따른 잔존 활성을 측정한 결과 40℃에서 3시간 반응 후에도 50% 이상의 활성이 남아있는 것을 확인하였고, 그보다 높은 온도에서는 30분 이상 반응 후 활성이 사라지는 것을 확인하였다 (도 5).
본 발명에 있어서, 말토덱스트린 포스포릴레이즈, 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈, 인오가닉 피로포스파테이즈 및 아세테이트 키나아제는 대장균(Escherichia coli K-12) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, UDP-글루코오스 재생산 시스템을 이용하여 케르세틴에서 케르세틴-3-글리코사이드를 제조하기 위해, UDP-글루코오스 재생산 시스템에 적용하는데 필요한 효소인 말토덱스트린 포스포릴레이즈(malP), 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈(galU), 인오가닉 피로포스파테이즈(ppa) 및 아세테이트 키나아제(ackA)는 대장균(E. coli)에 형질전환체를 구축하여 정제하였으며(도 6), 정제된 효소의 정제단계에 따른 활성 및 회수율을 확인하였다. 그 결과, 말토덱스트린 포스포릴레이즈, 글루코오스-1-포스페이즈 티미딜리트랜스퍼레이즈, 인오가닉 피로포스파테이즈 및 아세테이트 키나아제는 각각 13.56%(표 4), 40.10%(표 5), 50.87%(표 6) 및 48.05%(표 7)의 수율로 회수된 것을 확인하였다. .
상기의 정제된 말토덱스트린 포스포릴레이즈, 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈, 인오가닉 피로포스파테이즈 및 아세테이트 키나아제에 의해 UDP-글루코오즈의 재생산이 이루어지는지 확인하기 위해 말토덱스트린과 UTP를 효소들과 반응시켜 UDP-글루코오스의 생산을 확인한 결과, 99.9%의 수율로 UDP-글루코오스가 생산되는 것을 확인하였다 (도 7).
본 발명의 일 실시예에서, UDP-글루코오스 재생산 시스템의 효율적인 반응을 위하여 각각의 효소들의 최적 반응 유닛을 확인한 결과, 말토덱스트린 포스포릴레이즈 80mU, 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈 100mU, 인오가닉 피로포스파테이즈 50mU 및 아세테이트 키나아제 50mU에서 효소의 최적 반응 유닛을 보이는 것을 확인하였으며(도 8), UDP-글루코오스 재생산 시스템 상기의 조건으로 하여 케르세틴에서 케르세틴-3-글리코사이드의 생산을 확인할 수 있었다 (도 9).
본 발명의 다른 실시예에서, UDP-글루코오스 재생산 시스템의 보다 효율적인 반응을 위하여 아세틸포스페이트와 UTP의 최적 농도를 구한 결과, 아세틸포스페이트의 최적 반응농도는 2mM로 확인하였으며, UTP는 계속해서 재생산되므로 0.5mM만 첨가하여도 UDP-글루코오스 재생산 시스템의 순환반응에는 문제가 없는 것을 확인하였다 (도 10).
본 발명의 다른 실시예에서, UDP-글루코오스를 재생산하여 케르세틴에서 케르세틴-3-글리코사이드를 제조하기 위해 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 최적 활성을 나타내는 조건에서 UDP-글루코오스 재생산 시스템을 이용하여 케르세틴을 케르세틴-3-글리코사이드로 전환시킨 결과, 3시간 반응시켰을 때 케르세틴이 99.9%의 수율로 케르세틴-3-글리코사이드로 전환되는 것을 확인하였으며(도 11), 생산된 케르세틴-3-글리코사이드를 60% 수율로 정제하여(도 12C), 케르세틴-3-글리코사이드의 표준물질과 비교한 결과, 본 발명의 제조방법으로 생산된 케르세틴-3-글리코사이드는 표준물질과 일치하는 것을 확인할 수 있었다 (도 13).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예1 : 바실러스 리체니포르미스 ( Bacillus licheniformis ) 균주 유래의 UDP-글 리코실트랜스퍼레 이즈 E( UDP - glycosyltransferase E) 형질전환체 구축 및 발현
1-1 : 바실러스 리체니포르미스 균주 유래의 UDP - 글리코실트랜스퍼레이즈 E의 정제
바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis DSM 13 , ATCC No.14580) 균주가 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E를 발현한다는 것을 확인하고, UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E 유전자(EMBL CDS No. AAU39773.1, 서열번호 1)를 PCR로 증폭하여 pET302 벡터의 XhoI-BamHI 부위에 클로닝하여 pET302/BL-E 재조합 플라스미드를 구축하고, 재조합 플라스미드를 대장균(Escherichia coli , BL21)에 도입하여 형질전환체를 구축하였다. 형질전환체를 100㎍/㎖ 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 액체배지에서 37℃에서 1시간 30분 동안 진탕 배양한 후, 600nm에서 흡광도 값이 0.5가 되었을 때 0.5mM IPTG를 첨가하여 효소의 과발현을 유도하여 20℃에서 16시간 동안 180rpm으로 진탕 배양하였다. 배양체를 원심분리하여 침전된 균체를 회수하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척하였다. 회수된 균체에 1mM PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride) 및 1x 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)이 첨가된 50mM Tris-HCl(pH 7.5)를 가하여 초음파로 파쇄한 후, 원심분리하여 회수한 상등액에서 효소를 정제하였다. 상등액을 Ni-NTA 아가로오즈(agarose) 담체에 통과시켜 크로마토그래피를 수행하였다. 효소의 용출시 250mM 이미다졸(imidazole), 300mM 염화나트륨(NaCl), 20mM Tris-Cl(pH 8.0)을 포함하는 용출액으로 효소활성 분획을 취하여 정제 여부를 SDS-PAGE로 확인하였으며(도 3), 정제된 효소는 Amicon Ultra-15(Millipore, 5K NMWL device, USA)로 농축하여 투석하였다.
UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 발현을 위해 제작된 플라스미드의 제조과정에 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열
Primer Oligonucleotide Sequences (5'- 3') restriction enzyme site
BL-E F (서열번호 2) TTCTCGAGATGATCATGAAAAATATTCTAATCGTCAA XhoI
BL-E R (서열번호 3) GCGGATCCTTAGTAGCGGCTTTCTGTTATG BamHI
1-2 : 바실러스 리체니포르미스 균주 유래의 UDP - 글리코실트랜스퍼레이즈 E의 활성 측정
정제된 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 표준반응액은 100mM Tris-HCl (pH 8.8), 1mM UDP-글루코오스, 0.2mM 4-메칠움벨리페론(methylumbelliferone), 1mM 염화마그네슘(MgCl2) 및 적절히 희석된 효소 용액 5㎕를 넣고 총 1㎖이 되도록 한 후 30℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후 100℃에서 5분 동안 열을 가하여 비활성이 되게 한 후, 반응 산물인 4-메칠움벨리페리글리코피라노사이드(methylumbelliferylglucopyranoside)는 ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6x150 5㎛, Agilent) 컬럼이 장착된 HPLC를 사용하여 분석하였다. 이동상으로는 0.01%(v/v) TFA(A 버퍼)와 아세토나이트릴(acetonitrile, B 버퍼)을 사용하였다. 유속은 1㎖/min으로 0~5분 동안은 0% B버퍼, 5~10분 동안은 30% B버퍼, 10~15분 동안은 60% B버퍼, 15~20분 동안은 100% B버퍼 및 20~25분 동안은 0% B 버퍼의 조건에서 분석하였으며 320nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 유닛(U)은 단위시간 당(1min) 당 공여체의 1μmol 당 수용체에 전이하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.
그 결과, 바실러스 리체니포르미스 유래의 재조합 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E는 88%의 수율로 8.5배의 정제도를 얻을 수 있었으며(표 2), 재조합 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 키네틱 파라미터를 결정하기 위해 당 공여체로는 UDP-글루코오스, 당 수용체로는 4-메칠움벨리페론(methylumbelliferone)을 사용하여 라인웨버-버크도면(Lineweaver-Burk plot) 방법을 사용하여 정하였다. UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 4-메칠움벨리페론(methylumbelliferone)에 대한 최대 가수분해속도(Vmax)와 미카엘리스(Michaelis) 상수(Km)는 각각 20 mmol/min과 4 mM로 확인되었다.
바실러스 리체니포르미스 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 정제단계에 따른 활성 및 회수율
Total vol. (㎖) Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (U/mg) Purification
(Fold)		 Yield (%)
Crude extract 3 25.68 23.737 0.924 1.0 100
Ni-NTA affinity chromatography 0.7 2.67 20.958 7.858 8.501 88.29
실시예2 : 바실러스 리체니포르미스 ( Bacillus licheniformis ) 균주 유래의 UDP-글 리코실트랜스퍼레 이즈 E( UDP - glycosyltransferase E)의 특성 조사
바실러스 리체니포르미스 유래 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E의 케르세틴과의 반응조건은 100mM Tris-HCl(pH 8.8), 0.15mM 케르세틴, 1mM UDP-글루코오스, 1mM 염화나트륨(MgCl2) 및 과발현 후 파쇄한 효소액 10㎍을 혼합하여 총 1㎖이 되도록 하였다. 반응 후 분석은 ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6x150 5um, Agilent) 컬럼이 장착된 HPLC를 사용하고, 이동상으로는 0.01%(v/v) TFA(A버퍼)와 아세토나이트릴(acetonitrile, B버퍼)을 사용하였다. 유속은 1㎖/min으로 0~5분 동안은 0% B버퍼, 5~10분 동안은 30% B버퍼, 10~15분 동안은 50% B버퍼, 15~20분 동안은 70% B버퍼, 20~25분 동안은 100% B 버퍼 및 25~30분 동안은 0% B버퍼 조건에서 분석하였으며 370nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 정제된 재조합 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E는 케르세틴을 수용체로 당전이 반응되는 경우 3-OH에 작용하여 케르세틴-3-글리코사이드를 생산하는 것을 확인하였다 (도 4).
UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E와 케르세틴과의 최적반응조건을 알아보기 위해 반응온도, pH 및 온도와 pH에 대한 안정성을 조사하였다. 최적 반응온도를 알아보기 위해 과발현 후 파쇄한 효소를 사용하여 4~80℃에서 10℃ 간격으로 상대적인 활성을 측정하였으며, 40℃가 최적 반응온도인 것을 확인하였다 (도 5A).
재조합 효소의 최적 pH를 조사하기 위해 100mM 시트레이트-수산화나트륨(citrate-NaOH) 버퍼(pH 3.0~6.0), 100mM 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼(pH 6.0~8.5), 100mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5~10.0), 100mM 글라이신-수산화나트륨(glycine-NaOH) 버퍼(pH 10.0~11.0)의 완충용액을 사용하였다. 각 완충용액에서 반응시킨 후 상대적인 활성을 조사한 결과 100mM 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼(pH 7.5)에서 최대 활성을 나타내었으며, pH 7.0~8.0에서 비교적 안정된 것으로 확인하였다 (도 5B).
열에 대한 안정성을 조사하기 위하여 40~80℃ 범위에서 10℃ 간격으로 시간에 따른 잔존 활성을 측정한 결과 40℃에서 3시간 방치 후에도 50% 이상의 활성이 남아있는 것을 확인하였고, 그보다 높은 온도에서는 30분 이상 방치 후 활성이 거의 사라지는 것을 확인하였다 (도 5C).
또한, pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여 과발현 후 파쇄한 효소액을 각 pH에서 1시간 방치 후 다시 인산나트륨 버퍼를 이용해 pH 7.5가 되도록 한 후 케르세틴과 반응시켰을 때 pH 7.5에서 잔존 활성이 높게 남는 것을 확인하였다 (도 5D).
실시예3 : UDP -글루코오스 재생산 시스템 구축
경제적인 공정을 위하여 UDP-글루코오스를 재생산하는 시스템을 적용하는데 필요한 효소들은 대장균(Escherichia coli K-12, MG1655)로부터 PCR을 이용하여 증폭한 후 발현 벡터에 클로닝하였다. 그리하여 말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase, EcoGene Accession NO. EG10560, 서열번호 4)의 활성을 가진 pET41a/malP, 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈(glucose-1-phosphate thymidylyltrasferase, EcoGene Accession NO. EG11319, 서열번호 5) 활성을 가진 pET302/galU, 인오가닉피로포스파테이즈(inorganic pyrophosphatase, EcoGene Accession NO. EG10755, 서열번호 6) 활성을 가진 pET302/ppa 및 아세테이트 키나아제(acetate kinase, EcoGene Accession NO. EG10027, 서열번호 7) 활성을 가진 pET302/ackA 재조합 플라스미드를 각각 구축하였다 (표 3). 이 플라스미드들을 대장균(Escherichia coli , BL21)에 도입하여 형질전환체를 구축하였다. 항생제가 첨가된 LB 액체배지에서 37℃에서 1시간 30분 동안 진탕 배양하였고, 600nm에서 흡광도 값이 0.5가 되었을 때 0.5mM IPTG를 첨가하여 효소의 과발현을 유도하여 20℃에서 16시간 동안 180rpm으로 진탕 배양하였다. 배양체를 원심분리하여 침전된 균체를 회수하고 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척하였다. 회수된 균체에 1mM PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride) 및 1x 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail) 이 첨가된 50mM Tris-HCl(pH 7.5)를 가하여 초음파로 파쇄한 뒤, 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 효소 상등액의 발현 유무를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다 (도 6).
UDP-글루코오스 재생산 시스템 구축에 사용되는 플라스미드 제조과정에 사용된 올리고 뉴클레오타이드 서열
Primer Oligonucleotide Sequences (5'- 3') restriction enzyme site
malP-F (서열번호 8) gcCCATGGgaATGTCACAACCTATT NcoI
malP-R (서열번호 9) gcGTCGACTTAGCGTTTTGCCTG SalI
galU-F (서열번호 10) gaGAATTCcATGGCTGCCATTAATAC EcoRI
galU-R (서열번호 11) cgGGATCCTTACTTCTTAATGCCCA BamHI
ppa-F (서열번호 12) gaGAATTCcATGAGCTTACTCAACG EcoRI
ppa-R (서열번호 13) gcGGATCCTTATTTATTCTTTGCGC BamHI
ackA-F (서열번호 14) gcGAATTCcATGTCGAGTAAGTTAG EcoRI
ackA-R (서열번호 15) aaGGATCCTCAGGCAGTCAGGC BamHI
정제한 대장균 유래 효소들의 각각의 활성을 알아보기 위해 다음과 같은 표준반응실험을 하여 정제도와 수율을 확인하였다.
(ⅰ) 말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase, malP) : 말토덱스트린 포스포릴레이즈의 활성은 말토덱스트린을 기질로 하여 반응시켜 생성된 UDP-글루코오스 양으로 나타낼 수 있다. 반응조건은 100mM 포스파테이트(phosphate, pH 7.5), 5% 말토덱스트린(maltodextrin), 5mM 염화나트륨(MgCl2), 5mM UTP, 0.25U galU, 1U ppa 및 1㎎의 malP을 넣어 최종 1㎖이 되도록 한 후 30℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 생성물인 UDP-글루코오스는 NH2 column (5um, 4.6x250mm, aglient)이 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였다. 이동상으로는 67mM Na2HPO4-KH2PO4(pH 5.3)를 1.5㎖/min의 속도로 흘려주면서 260nm에서 측정하였다. 효소의 유닛은 1분당 1μmol의 기질을 변화시키는데 필요한 효소의 양으로 정의한다.
대장균(Escherichia coli K-12, MG1655) 유래 말토덱스트린 포스포릴레이즈의 정제단계에 따른 활성 및 회수율
Total vol. (㎖) Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (U/mg) Purification
(Fold)		 Yield (%)
Crude extract 1 8.04 2.17 0.27 1.0 100
Ni-NTA affinity chromatography 0.1 0.64 0.29 0.46 1.70 13.56
(ⅱ) 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈(glucose-1-phosphate thymidylyltrasferase, galU) : 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈의 표준반응액은 50mM 포스페이트(phosphate, pH 7.5), 5mM 염화나트륨(MgCl2), 5mM 글루코오스-1-포스페이트, 2 mM UTP 및 1㎎의 galU을 넣어 최종 1㎖이 되도록 한 후 30℃에서 1분간 반응시켰다. 생성물인 UDP-글루코오스는 NH2 column이 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였다.
대장균(Escherichia coli K-12, MG1655) 유래 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈의 정제단계에 따른 활성 및 회수율
Total vol. (㎖) Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (U/mg) Purification
(Fold)		 Yield (%)
Crude extract 1 10.19 68.27 6.70 1.0 100
Ni-NTA affinity chromatography 0.1 2.80 27.38 9.77 1.46 40.10
(ⅲ) 인오가닉 피로포스파테이즈(inorganic pyrophosphatase, ppa) : 인오가 닉피로포스파테이즈의 표준반응액은 50mM Tris-HCl(pH ７.5), 5mM 염화나트륨(MgCl2), 10mM 피로인산나트륨(Na4P2O7) 및 1㎎의 ppa을 넣어 최종 1㎖이 되도록 한 후 30℃에서 1분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 반응액 중 20㎕를 500㎕의 phosphorus-determining reagent solution(17% H2SO4 : 2.5% Na2MoO4-(NH4)2SO4 : 10% L-ascortbic acid : H2O = 1:1:1:2)에 넣고 480㎕ H2O를 넣어 45℃에서 10분간 반응시켰다. 생성물은 660nm의 흡광도로 확인하였다.
대장균(Escherichia coli K-12, MG1655) 유래 인오가닉 피로포스파테이즈의 정제단계에 따른 활성 및 회수율
Total vol. (㎖) Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (U/mg) Purification
(Fold)		 Yield (%)
Crude extract 1 14.02 56.08 4.00 1.0 100
Ni-NTA affinity chromatography 0.1 4.91 28.53 5.81 1.45 50.87
(ⅳ) 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ackA) : 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10mM 염화나트륨(MgCl2), 10mM ATP, 800mM 아세트산칼륨(potassium acetate), 700mM 하이드록실아민(neutralized hydroxylamine) 및 1㎎의 ackA를 넣어 최종 1㎖이 되도록 한 후 30℃에서 5분간 반응시켰다. 반응종료 후에는 10% 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid) 1㎖과 1N 염화수소(HCl)에 녹인 1.25% 염화제3철(FeCl3) 1㎖을 넣어준 후 30℃에서 5분간 반응시킨다. 540nm의 흡광도에서 측정하였다.
대장균(Escherichia coli K-12, MG1655) 유래 아세테이트 키나아제의 정제단계에 따른 활성 및 회수율
Total vol. (㎖) Total protein (mg) Total activity (U) Specific activity (U/mg) Purification
(Fold)		 Yield (%)
Crude extract 1 12.35 1808.66 146.45 1.0 100
Ni-NTA affinity chromatography 0.1 3.89 869.61 223.55 1.53 48.05
말토텍스트린와 UTP를 발현한 효소들과 반응시켜 UDP-글루코오스가 생산하는지 확인하는 실험을 하였다. 실험방법은 5% 말토덱스트린, 2mM UTP, 1mM 염화마그네슘(MgCl2), 100mM 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼(pH 7.5)에 malP 효소액 10㎍, galU 50㎍, ppa 15㎍을 넣고 총 1㎖이 되도록 한 후 30℃에서 6시간 반응시켰다. 반응생성물의 분석은 NH2 column(5um, 4.6x250mm, aglient)을 이용하여 67mM Na2HPO4-KH2PO4(pH 5.3)를 30℃에서 1.5㎖/min의 속도로 흘려주고 260nm에서 측정한다. 그 결과 99.9%의 수율로 UDP-글루코오스를 얻을 수 있었다 (도 7).
실시예4 : UDP -글루코오스 재생산 시스템을 이용한 케르세틴의 당전이 반응
4-1 : UDP -글루코오스 재생산 시스템의 효소들의 최적반응 조건
UDP-글루코오스 재생산 시스템의 효율적인 작용을 위하여 각각의 효소들의 최적 반응 유닛(U)을 구하는 실험을 하였다. 실험방법은 5% 말토덱스트린, 2mM UTP, 1mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.2mM 케르세틴, 5mM 아세틸포스페이트, 100mM 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼(pH 7.5)에 malP, galU, ppa, ackA 및 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E 효소를 넣고 총 1㎖이 되도록 한 후 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이때 반응생성물 중 UDP-글루코오스는 NH2 column (5um, 4.6x250mm, aglient)으로, 케르세틴-3-글리코사이드는 ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6x150 5um, Agilent) 컬럼을 장착한 HPLC로 분석하였다. 그 결과, malP 80mU, galU 100mU, ppa 50mU 및 ackA 50mU으로 각각 효소의 최적 반응 유닛(U)을 확인하였다 (도 8).
구축한 UDP-글루코오스 재생산 시스템을 케르세틴 당전이 반응에 도입하였을 때 케르세틴-3-글리코사이드을 생성하는지 알아보았다. 반응조건은 5% 말토덱스트린, 2mM UTP, 1mM 염화마그네슘(MgCl2), 100mM 인산나트륨(sodium phosphate) buffer(pH 7.5), 0.2mM 케르세틴, 2mM 아세틸포스페이트에 malP 효소액 80μmol, galU 100μmol, ppa 50μmol, BL-E 50μmol 및 ackA 50μmol을 넣고 총 1㎖ 이 되도록 한 후 30℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응 후 분석은 ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6x150 5um, Agilent) 컬럼이 장착된 HPLC를 사용하고, 이동상으로는 0.01%(v/v) TFA(A 버퍼)와 아세토나이트릴(acetonitrile, B 버퍼)을 사용하였다. 유속은 1㎖/min으로 0~5분 동안은 0% B버퍼, 5~10분 동안은 30% B버퍼, 10~15분 동안은 50% B버퍼, 15~20분 동안은 70% B버퍼, 20~25분 동안은 100% B 버퍼, 25~30분 동안은 0% B 버퍼의 조건에서 분석하였으며 370nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 케르세틴-3-글리코사이드의 생산을 확인할 수 있었다 (도 9).
4-2 : UDP -글루코오스 재생산 시스템에서 아세틸포스페이트( acetylphosphate)와 UTP 의 최적 농도
UDP-글루코오스 재생산 시스템을 이용하여 케르세틴-3-글리코사이드을 생산하는데 보다 경제적인 반응을 위하여 아세틸포스페이트(acetylphosphate)와 UTP의 최적 농도를 구하는 실험을 하였다. 아세틸포스페이트의 경우 0~10mM 까지 농도를 달리하여 반응하였을 때, 2mM이 최적 반응 농도임을 확인하였으며, UTP의 경우 계속해서 재생산되므로 0.5mM만 넣어도 반응이 순환하는데 문제가 없는 것을 확인하였다 (도 10).
4-3 : UDP -글루코오스 재생산 시스템 최적 반응 조건을 이용한 케르세틴 반응
UDP-글루코오스 재생산 시스템의 최적 반응 조사에서 확인된 조건을 기반으로 하여 케르세틴에서 케르세틴-3-글리코사이드로의 전환율을 조사하였다. 최종 반응 조건은 5% 말토덱스트린, 0.5mM UTP, 1mM 염화마그네슘(MgCl2), 100mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.2mM 케르세틴, 2mM 아세틸포스페이트에 malP 80mU, galU 100mU, ppa 50mU, ackA 50mU 및 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E 효소 50mU 를 넣고 총 1㎖이 되도록 한 후 37℃에서 반응시켰다. 시간에 따른 케르세틴과 케르세틴-3-글리코사이드 농도를 조사한 결과, 3시간 반응시켰을 때 케르세틴이 99.9%의 수율로 케르세틴-3-글리코사이드로 전환되는 것을 확인하였다 (도 11).
실시예5 : UDP - 글리코실트랜스퍼레이즈 E( UDP - glycosyltransferase E)를 이용한 케르세틴 당전이 반응산물 정제 및 구조분석
UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E 를 통하여 합성한 반응결과물이 케르세틴-3-글리코사이드인지를 확인하기 위하여 반응 결과물을 정제하였다. 100mM 인산나트륨(sodium phosphate) pH 7.5, 0.15mM 케르세틴, 1mM UDP-글루코오스, 1mM 염화마그네슘(MgCl2) 및 과발현하여 파쇄한 효소액 5㎎을 혼합하여 총 500㎖이 되도록 한 후 30℃에서 3시간 동안 반응시킨 결과, 케르세틴이 99.9%의 수율로 케르세틴-3-글리코사이드로 전환되는 것을 확인하였다 (도 12B). 이렇게 얻은 반응액을 정제하기 위하여 동결건조시킨 후 메탄올을 첨가하여 녹는 물질만 회수한 후, 이이배퍼레이터(evaporator)를 이용하여 더 이상 침전물이 생기지 않을 때까지 메탄올을 휘발시키는 과정을 반복하여 약 60% 수율로 케르세틴-3-글리코사이드를 정제하였다 (도 12C).
최종적으로 Methanol-d 4(Sigma)에 녹인 케르세틴-3-글리코사이드의 구조분석을 위하여 NMR을 수행한 결과 표준물질로 사용한 케르세틴-3-글리코사이드와 일치하는 것을 확인하였다 (도 13).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> korea research institute of bioscience and biotechnology <120> Method for Preparing Quercetin Glycoside Using Glycosyltransferase <130> P12-B058 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1000 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis UDP-glycosyltransferase E <400> 1 atgatcatga aaaatattct aatcgtcaat tttccggcgg aaggtcatgt caatcctaca 60 ttagggatca ccaaagcatt tgctgacaga ggcgacaatg tgcactatct ttcaacagaa 120 aagtataaag acaggctgga gggcgtcgga gctaccgttc atttatacaa agatctggtg 180 agaaacgcgc atattgatcc gaattcaccg tccggccttc ttgaattttt aaaaattcat 240 ctcaaaacct cgctgtatat tctagacatt gtaaaagagc tgtccaaaag catttcgttc 300 gatgtcgtgt attatgacac attcggtgcg ggtgaattgg tcagggatta tttgaacatt 360 ccgggaatcg cttcgtcggc ttcatttctc ttcggacaag aacataagaa gattctgccg 420 ttgcatccgg attcaggcgc ggagctgcac ttggacaaag aatgtgagga cctgcttgcg 480 gaactgaaag aaaagtacgg cgtctcgcct aggcatacag gacagtttat gagcaatcag 540 gcggagctga ccgttgtgta tacaagccgg tattttcagc ctgacagcgg ccgttttggg 600 gatgatgtgc tgtttatcgg cccgcgtttt ccaaagcgcc tggacaagac cgattttccg 660 gtagaatcgt tgaagaatga gaaagtcatt tatatttcaa tgggaaccgt acttggcaaa 720 actgcggatt ttttcaatat gtgcattgat gcttttcgtg atttcgacgg caaggttgtc 780 atcgccgctg gcgaaaaatc ggactacgcg gaaattaaag aagtgccgga gcattttatc 840 atcgccccgt atgtgccgca attagaggtg cttaaagagg ccgatgtgtt catcacgcac 900 ggcggcatga acagcgtcaa tgaaggcatc cattaccgtg tcccgatggt tgtgcttccg 960 catgataaag atcagccgat gatcgcccag cgcttgaaag 1000 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-E forward <400> 2 ttctcgagat gatcatgaaa aatattctaa tcgtcaa 37 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-E reverse <400> 3 gcggatcctt agtagcggct ttctgttatg 30 <210> 4 <211> 2394 <212> DNA <213> Escherichia coli K-12 maltodextrin phosphorylase <400> 4 atgtcacaac ctatttttaa cgataagcaa tttcaggaag cgctttcacg tcagtggcag 60 cgttatggct taaattctgc ggctgaaatg actcctcgcc agtggtggct agcagtgagt 120 gaagcactgg ccgaaatgct gcgtgctcag ccattcgcca agccggtggc gaatcagcga 180 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ccaaccatac cctgatgcca gaagcgctgg aacgctggga tgtgaaactg 1080 gtgaaaggct tactgccgcg ccacatgcag attattaacg aaattaatac tcgctttaaa 1140 acgctggtag agaaaacctg gccgggcgat gaaaaagtgt gggccaaact ggcggtggtg 1200 cacgacaaac aagtgcatat ggcgaacctg tgtgtggttg gcggtttcgc ggtgaacggt 1260 gttgcggcgc tgcactcgga tctggtggtg aaagatctgt tcccggaata tcaccagcta 1320 tggccgaaca aattccataa cgtcaccaac ggtattaccc cacgtcgctg gatcaaacag 1380 tgcaacccgg cactggcggc tctgttggat aaatcactgc aaaaagagtg ggctaacgat 1440 ctcgatcagc tgatcaatct ggaaaaattc gctgatgatg cgaaattccg tcagcaatat 1500 cgcgagatca agcaggcgaa taaagtccgt ctggcggagt ttgtgaaagt tcgtaccggt 1560 attgagatca atccacaggc gattttcgat attcagatca aacgtttgca tgagtacaaa 1620 cgccagcacc tgaatctgct gcatattctg gcgttgtaca aagaaattcg tgaaaacccg 1680 caggctgatc gcgtaccgcg cgtcttcctc ttcggcgcga aagcggcacc gggctactac 1740 ctggcgaaga atattatctt tgcgatcaac aaagtggctg acgtgatcaa caacgatccg 1800 ctggttggcg ataagttgaa ggtggtgttc ctgccggatt attgcgtttc ggcggcggaa 1860 aaactgatcc cggcggcgga tatctccgaa caaatttcga ctgcaggtaa agaagcttcc 1920 ggtaccggca atatgaaact ggcgctcaat ggtgcgctta ctgtcggtac gctggatggg 1980 gcgaacgttg aaatcgccga gaaagtcggt gaagaaaata tctttatttt tggtcatacc 2040 gtggaacaag tgaaggcaat tctggccaaa ggctacgacc cggtgaaatg gcggaagaaa 2100 gataaggtgc tggacgcagt attgaaagag ctggaaagcg gtaaatacag cgacggcgat 2160 aagcatgcct tcgaccagat gctgcacagt atcggcaaac agggcggcga tccgtatctg 2220 gtgatggcgg atttcgcagc ctatgtagag gcacaaaagc aggtggatgt gctgtaccgc 2280 gaccaggagg cctggactcg cgcggcgatc ctcaataccg cccgctgcgg tatgtttagc 2340 tcggatcgct ctattcgcga ttatcaggct cgtatctggc aggcaaaacg ctaa 2394 <210> 5 <211> 909 <212> DNA <213> Escherichia coli K-12 glucose-1-phosphate thymidylyltrasferase <400> 5 atggctgcca ttaatacgaa agtcaaaaaa gccgttatcc ccgttgcggg attaggaacc 60 aggatgttgc cggcgacgaa agccatcccg aaagagatgc tgccacttgt cgataagcca 120 ttaattcaat acgtcgtgaa tgaatgtatt gcggctggca ttactgaaat tgtgctggtt 180 acacactcat ctaaaaactc tattgaaaac cactttgata ccagttttga 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tacgaaatcg acaaagagag cggcgcactg 120 ttcgttgacc gcttcatgtc caccgcgatg ttctatccat gcaactacgg ttacatcaac 180 cacaccctgt ctctggacgg tgacccggtt gacgtactgg tcccaactcc gtacccgctg 240 cagccgggtt ctgtgatccg ttgccgtccg gttggcgttc tgaaaatgac cgacgaagcc 300 ggtgaagatg cgaaactggt tgcggttccg cacagcaagc tgagcaaaga atacgatcac 360 attaaagacg ttaacgatct gcctgaactg ctgaaagcgc aaatcgctca cttcttcgag 420 cactacaaag acctcgaaaa aggcaagtgg gtgaaagttg aaggttggga aaacgcagaa 480 gccgctaaag ctgaaatcgt tgcctccttc gagcgcgcaa agaataaata a 531 <210> 7 <211> 1203 <212> DNA <213> Escherichia coli K-12 acetate kinase <400> 7 atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcactgaa atttgccatc 60 atcgatgcag taaatggtga agagtacctt tctggtttag ccgaatgttt ccacctgccc 120 gaagcacgta tcaaatggaa aatggacggc aataaacagg aagcggcttt aggtgcaggc 180 gccgctcaca gcgaagcgct caactttatc gttaatacta ttctggcaca aaaaccagaa 240 ctgtctgcgc agctgactgc tatcggtcac cgtatcgtac acggcggcga aaagtatacc 300 agctccgtag tgatcgatga gtctgttatt cagggtatca 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cctgactgcc 1200 tga 1203 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> malP-Forward <400> 8 gcccatggga atgtcacaac ctatt 25 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> malP-Reverse <400> 9 gcgtcgactt agcgttttgc ctg 23 <210> 10 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galU-Forward <400> 10 atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcactgaa atttgccatc 60 atcgatgcag taaatggtga agagtacctt tctggtttag ccgaatgttt ccacctgccc 120 gaagcacgta tcaaatggaa aatggacggc aataaacagg aagcggcttt aggtgcaggc 180 gccgctcaca gcgaagcgct caactttatc gttaatacta ttctggcaca aaaaccagaa 240 ctgtctgcgc agctgactgc tatcggtcac cgtatcgtac acggcggcga aaagtatacc 300 agctccgtag tgatcgatga gtctgttatt cagggtatca aagatgcagc ttcttttgca 360 ccgctgcaca acccggctca cctgatcggt atcgaagaag ctctgaaatc tttcccacag 420 ctgaaagaca aaaacgttgc tgtatttgac accgcgttcc accagactat gccggaagag 480 tcttacctct acgccctgcc ttacaacctg tacaaagagc acggcatccg tcgttacggc 540 gcgcacggca ccagccactt ctatgtaacc caggaagcgg caaaaatgct gaacaaaccg 600 gtagaagaac tgaacatcat cacctgccac ctgggcaacg gtggttccgt ttctgctatc 660 cgcaacggta aatgcgttga cacctctatg ggcctgaccc cgctggaagg tctggtcatg 720 ggtacccgtt ctggtgatat cgatccggcg atcatcttcc acctgcacga caccctgggc 780 atgagcgttg acgcaatcaa caaactgctg accaaagagt ctggcctgct gggtctgacc 840 gaagtgacca gcgactgccg ctatgttgaa gacaactacg cgacgaaaga agacgcgaag 900 cgcgcaatgg acgtttactg ccaccgcctg gcgaaataca tcggtgccta cactgcgctg 960 atggatggtc gtctggacgc tgttgtattc actggtggta tcggtgaaaa tgccgcaatg 1020 gttcgtgaac tgtctctggg caaactgggc gtgctgggct ttgaagttga tcatgaacgc 1080 aacctggctg cacgtttcgg caaatctggt ttcatcaaca aagaaggtac ccgtcctgcg 1140 gtggttatcc caaccaacga agaactggtt atcgcgcaag acgcgagccg cctgactgcc 1200 tga 1203 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galU-Reverse <400> 11 cgggatcctt acttcttaat gccca 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppa-Forward <400> 12 gagaattcca tgagcttact caacg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppa-Reverse <400> 13 gcggatcctt atttattctt tgcgc 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ackA-Forward <400> 14 gcgaattcca tgtcgagtaa gttag 25 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ackA-Reverse <400> 15 aaggatcctc aggcagtcag gc 22

Claims (4)

  1. 다음의 단계를 포함하는 케르세틴(quercetin) 배당체의 제조방법:
    (a) 말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase) 존재하에 말토덱스트린(maltodextrin)과 포스페이트(phosphate)를 반응시켜 글루코오스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate)를 제조하는 단계;
    (b) 상기 제조된 글루코오스-1-포스페이트를 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈(glucose-1-phosphate thymidylyltrasferase) 존재하에 UTP와 반응시켜 UDP-글루코오스(glucose)를 제조하되, 상기반응에 의해서 생성되는 피로포스페이트(pyrophosphate; PPi)를 인오가닉 피로포스파테이즈(inorganic pyrophosphatase) 존재하에 두 분자의 포스페이트로 가수분해시킨 다음, 생성된 포스페이트를 (a) 단계에 투입하는 단계; 및
    (c) 상기 제조된 UDP-글루코오스를 UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E(UDP-glycosyltransferase E) 존재하에 케르세틴과 반응시켜 케르세틴-3-글리코사이드(quercetin-3-glycoside)를 제조하되, 상기 반응에서 생성되는 UDP를 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 존재하에 아세틸포스페이트(acetylphosphate)와 반응시켜 UTP를 생성한 다음, 생성된 UTP를 (b)단계에 투입하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E(UDP-glycosyltransferase E)는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, UDP-글리코실트랜스퍼레이즈 E(UDP-glycosyltransferase E)는 서열번호 1의 염기서열에 의해 코딩되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase), 글루코오스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼레이즈(glucose-1-phosphate thymidylyltrasferase), 인오가닉피로포스파테이즈(inorganic pyrophosphatase) 및 아세테이트 키나아제(acetate kinase)는 대장균(Escherichia coli K-12) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
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