CN110358749A

CN110358749A - 对槲皮素具有糖基化的蔗糖磷酸化酶突变体q345f

Info

Publication number: CN110358749A
Application number: CN201910696548.7A
Authority: CN
Inventors: 庞浩; 杜丽琴; 何贺贺; 林宇; 黄日波; 汤宏赤
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2019-10-22
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: CN110358749B

Abstract

本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶的突变体Q345F，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F是由编码Bspase的第345位氨基酸由谷氨酰胺突变为苯丙氨酸得到的，通过引入共轭π‑π键获得了对槲皮素具有转糖苷活性，突变体Q345F具有用时短且转化效率高的良好特性。

Description

对槲皮素具有糖基化的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F

技术领域

本发明涉及酶分子改造技术领域，特别涉及一种对槲皮素具有糖基化的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F。

背景技术

蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase，EC 2.4.1.7)属于糖基水解酶13家族，具有较为优良和独特的转糖苷催化性质，可以提高产物热稳定性、水溶性、光敏感性及改善药代动力学特性等(Aerts D.,Verhaeghe T.F.,Roman B.I.,et al.Transglucosylationpotential of six sucrose phosphorylases toward different classes ofacceptors.2011，Carbohydr Res，346(13):1860-1867.)，进而可以更高效的利用在食品及医药等领域。

黄酮类化合物存在于大多数的植物中，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎和抗病毒活性(Chan-Woo L,Yongjoo N,Nok-Hyun P,et al.Amentoflavone inhibits UVB-inducedmatrix metalloproteinase-1expression through the modulation of AP-1componentsin normal human fibroblasts[J].Applied Biochemistry&Biotechnology,2012,166(5):1137-1147.)，并且具有一定的杀虫和抑制心脑血管疾病等作用(Arjun T,Eun-RhanW,Chi E Y,et al.Biflavonoids are superior to monoflavonoids in inhibitingamyloid-βtoxicity and fibrillogenesis via accumulation of nontoxic oligomer-like structures[J].Biochemistry,2011,50(13):2445.)。尽管其药理作用显著，但其较低的水溶解性限制了在医疗方向的进一步应用。槲皮素(quercetin)是一类重要的黄酮类化合物，具有黄酮类普遍具有的高效生物利用价值，尤其是抗肿瘤和抗癌活性。然而从结构上看，槲皮素具有分子堆砌较紧密的平面结构，因此水溶性和脂溶性都较差，这就极大地限制了它在临床治疗上的应用。为了改善槲皮素的物理化学性质并提高其生物活性，人们对其进行了结构改造来增强其水溶性或脂溶性并改善其生物利用度，以期开发出活性更高、更具有临床应用价值的药物。

目前从槲皮素获得槲皮素衍生物的常用的方法有化学修饰法和生物转化法(CaoH,Chen X,Jassbi AR,et al.Microbial biotransformation of bioactive flavonoids[J].Biotechnology Advances,2015,33(1):214-223.)。其中化学修饰方法较多，如CN107382947A的申请是将芦丁与溴化苄反应之后利用酸水解脱糖得到7,3′,4′-三苄氧基槲皮素，将产物与1,5-二溴戊烷反应制得2-(3,4-二羟基苯基)-3-(5-溴戊氧基)-5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，再将所得产物与二乙胺反应得到2-(3，4-二羟基苯基)-3-(5-N，N-二乙胺戊氧基)-5，7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，即槲皮素衍生物。申请CN106632198A用槲皮素与甲醛和氨制得槲皮素的Mannich碱，然后将产物与芳基环氧乙烷反应制得芳基乙醇胺槲皮素衍生物。申请CN106674180A首先用槲皮素与甲醛和氨制得槲皮素的Mannich碱，再与2-噁唑烷(硫)酮、SOCl₂反应，再对槲皮素的酚羟基进行保护，用NaNO₂氧化，脱保护基制得槲皮素的衍生物。以上均是使用化学修饰获得槲皮素非糖苷类衍生物的，化学修饰方法可控性较强，在大体系的工业制备上具有优势。但同时也具有反应步骤繁琐、中间产物较多、所用试剂的消耗量大且不可回收的特点。

相比于化学修饰方法，微生物转化法是利用微生物资源对黄酮类化合物的修饰办法，是一种是对底物进行结构特异性修饰的高效率的酶促反应。具有选择性强、高重复利用率等特点，能显著改善槲皮素的理化性质，进而获得水溶性和去自由基等能力得到改善的槲皮素类衍生物，可以为医学上对槲皮素的药理学研究提供相关材料和研究基础。目前对槲皮素的生物修饰方法相对较少，其中申请号为201110343655.5的申请是利用来自地衣芽孢杆菌的α-转移葡萄糖苷酶，以蔗糖为糖苷供体对槲皮素进行糖基化作用，其产量0.148g/L，转化率14.81％，转化率及其产量相对较低。申请CN109234337A是构建了来源于洋葱的糖基转移酶或者其突变体的基因与蔗糖合酶的双酶重组质粒，获得了槲皮素-3,4′二葡萄糖糖苷的合成方法。申请CN109266708A介绍了一种采用葡萄柚中的糖苷转移酶以价格昂贵的UDP-葡糖糖或UDP-N乙酰-D葡萄糖为糖苷供体对槲皮素进行糖基化作用的方法。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

为了扩宽蔗糖磷酸化酶的转糖苷能力，本发明提供一种对槲皮素具有糖基化的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F，从而克服现有技术中对槲皮素进行糖基化作用效果不佳的缺点，本申请技术方案是将蔗糖富集土壤宏基因组中的蔗糖磷酸化酶Bspase的345位谷氨酰胺Q突变成苯丙氨酸F而得到的。蔗糖磷酸化酶突变体Q345F和突变前的Bspase相比，获得了对槲皮素的转糖苷反应活性。对进一步研究槲皮素吸收和利用方式具有重要的价值和意义，并且在短时间达到较高的转化率为工业生产槲皮素糖苷衍生物提供了潜力。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种对槲皮素具有糖基化的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F，由506个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种宿主细胞，它是包含如上所述的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F的原核细胞或真核细胞。

进一步的，所述的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F在槲皮素葡萄糖基化方面的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的蔗糖磷酸化酶突变体是通过将Bspase的345位的谷氨酰胺Q突变成苯丙氨酸F改造得到的，通过引入共轭π-π键获得了对槲皮素具有转糖苷活性；蔗糖磷酸化酶突变体Q345F和突变前的Bspase相比，获得了对槲皮素的转糖苷反应活性，对于槲皮素具有85.3％的转化率；进一步的，本发明提供的蔗糖磷酸化酶突变体在转糖苷功能方面增加了对槲皮素的转糖苷活性，所获得的槲皮素糖苷衍生物水溶性高于槲皮素。

附图说明

图1是本发明蔗糖磷酸化酶突变体Q345F的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE图。

图2是本发明蔗糖磷酸化酶突变体Q345F相对于突变前对槲皮素的转糖苷产物HPLC分析图；其中A为突变酶Q345F实验组，B为野生酶Bspase实验组。

图3是反应时间对于本发明蔗糖磷酸化酶突变体Q345F转化槲皮素效率的影响。

图4是槲皮素和所得槲皮素糖苷的溶解度比较；其中A为槲皮素，B为槲皮素糖苷。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系XL10-Gold购自Stratagene公司；大肠杆菌(Escherichia coli)株系XL1-blue、载体pUC19购自大连TaKaRa公司；表达载体pSE380购自Stratagene公司；购自TaKaRa的限制性内切酶、DpnⅠ酶等试剂；购自Qiagen公司的镍亲和层析蛋白质组氨酸纯化介质；蔗糖和槲皮素购自上海生工公司。

实施例1

(1)蔗糖磷酸化酶基因Bspase的克隆

广西武鸣糖厂采集的土壤样本构建了一个宏基因组文库，从宏基因文库中筛选到一个具有蔗糖磷酸化酶活性的阳性亚克隆子pUC-SP。送交华大基因公司进行DNA测序，测序的序列进行Blastp比对分析，发现其中一个ORF与来自Bifidobacterium animalissubsp.lactis AD011(乳双歧杆菌AD011)的蔗糖磷酸化酶基因的同源性最高，两者的一致性＝1521/1521(100％)，将这个ORF命名为Bspase。

设计上游引物Bspase-1(包含一个EcoR I酶切位点和六个组氨酸标签)和下游引物Bspase-2(包含一个Hind III酶切位点)，以亚克隆子pUC-SP为模板，通过聚合酶链式反应PCR扩增蔗糖磷酸化酶基因Bspase，用限制性内切酶EcoR I和Hind III酶切蔗糖磷酸化酶Bspase后，插入到经EcoR I和Hind III酶切的表达载体pSE380进行连接，获得的重组质粒命名为pSE-Bspase。

Bspase-1：5′-CACGAATTCATGCACCACCACCACCACCACAAGAACAAAGTTCAGCTGATCACC-3′

Bspase-2：5′-CACAAGCTTTCAGCTCGCCTGCATGACG-3′

(2)蔗糖磷酸化酶突变体Q345F的获得

蔗糖磷酸化酶突变体Q345F的获得是将基因Bspase编码的蛋白质序列中345位的谷氨酰胺突变成苯丙氨酸来进行改造的，以步骤(1)中构建的pSE-Bspase为模板，用上游引物Q345F1和下游引物Q345F2进行反向PCR反应。

Q345F1：5′-ctctacTTTgtgaactccacatattat-3′

Q345F2：5′-gttcacAAAgtagaggtcgaggttcga-3′

PCR条件为：98℃预变性2分钟；98℃变性10秒；62℃复性15秒；72℃延伸6分钟；30个循环后，72℃保温10分钟。PCR产物用1μL DpnⅠ在37℃作用1小时消解模板，氯化钙化学法转入E.coli XL10-Gold感受态细胞，转化产物克隆送至上海生物工程有限公司进行DNA测序分析。

(3)蔗糖磷酸化酶突变体Q345F的表达和纯化

表达：将含有突变质粒Q345F的重组大肠杆菌XL1-blue菌株接种到500mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养，待OD₆₀₀为0.4时，加入IPTG使其终浓度为0.5mmol/L，20℃诱导22小时。

纯化：将上述诱导22小时后所得6000转离心10分钟，收集菌体，用8mL裂解缓冲液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0)重悬菌体，加入1mL浓度为50mg/mL溶菌酶，冰上静止15分钟。超声波破胞16分钟。4℃、12000转离心20分钟取上清液即为粗酶液。按每4mL粗酶液加入1mL 50％的镍亲和层析填充料，在4℃用200转摇60分钟，然后用1mL冲洗缓冲液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0)洗去杂蛋白，重复4次。最后用洗脱缓冲液(50mmol/LNaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH8.0)洗脱目的蛋白质，重复7次。收集第一次洗脱的蛋白质溶液，通过30kDa的超滤膜脱盐处理，再进行变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。

结果如图1所示，在45-66kDa之间发现有一条明显的目的蛋白质条带，本发明的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F纯化物的分子量为56kDa。

实施例2

突变酶Q345F对槲皮素的转糖苷活性和产物分析：

在pH7.0条件下，以750mM蔗糖作为糖基供体，以0.5％的槲皮素作为糖基受体，并且以10％的二甲基亚砜(DMSO)为水不溶物槲皮素及反应体系的共同溶剂，加入实施例1所得蔗糖磷酸化酶突变体Q345F纯化物，于37℃反应24h。煮沸终止反应，冷却至室温后12000rpm离心30min取上清，进行HPLC分析产物。以未改造之前的野生酶即Bspase作为对照，检测突变体是否具有糖基化槲皮素的能力。

槲皮素转糖苷产物的HPLC检测条件：仪器：安捷伦1260系列液相色谱仪、紫外检测器，流动相：A：水；B：甲醇；C：乙腈，梯度洗脱：A:B:C＝62:12:26(0-7min)；A:B:C＝15:35:50(7-9min)；A:B:C＝15:35:50(9-15min)；A:B:C＝62:12:26(15-17min)；A:B:C＝62:12:26(17-20min)，色谱柱：C18柱，进样量：5μL，流速：1mL/min，柱温：35℃，检测波长：280nm。

结果如图2所示：野生酶Bspase对槲皮素无转糖苷活性，而突变酶Q345F获得了对槲皮素具有糖基化活性，有三种糖基化产物。

实施例3

反应和检测方法同实施例1，加实施例1所得蔗糖磷酸化酶突变体Q345F纯化物量为200μg/mL，反应时间隔点取样(0min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、20h、32h)，煮沸终止反应，用50％乙腈稀释反应液，0.2μm有机系滤膜过滤后，进行HPLC分析。反应时间对转化率影响如图3所示。

从图3可以看出，最大转化效率为85.3％，在约8h突变酶对槲皮素具有转化效率即接近最大。

实施例4

槲皮素糖苷衍生物和槲皮素的溶解度比较

在HPLC进样瓶中，pH7.0条件下，以750mM蔗糖作为糖基供体，以0.5％的槲皮素作为糖基受体，并且以10％的DMSO作为水不溶物槲皮素及反应体系的共同溶剂，加入200μg/mL实施例1所得蔗糖磷酸化酶突变体Q345F纯化物，于37℃反应8h，结果如图4。

对照组(A：槲皮素与200μg/mL纯化的野生酶Bspase的反应液)浊度较大，表明槲皮素溶解度较小，并且野生酶Bspase对槲皮素没有转糖苷功能。经突变酶反应生成糖基化产物后(B：槲皮素糖苷)浊度变小，可以清晰地显出后侧黑色线条，表明生成的产物槲皮素糖苷的溶解度要大于槲皮素。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西科学院

<120> 对槲皮素具有糖基化的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F

<130> 中誉威圣

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 506

<212> PRT

<213> 土壤未培养微生物(对槲皮素具有糖基化的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F)

<400> 1

Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp

1 5 10 15

Gly Asn Leu Ala Ser Met Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Phe Asp Gly

20 25 30

Val Tyr Glu Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly

35 40 45

Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Lys Val Asp Ala Arg

50 55 60

Leu Gly Asp Trp Asp Asp Ile Ala Glu Leu Ala Lys Thr His Asp Ile

65 70 75 80

Met Val Asp Ala Ile Val Asn His Met Ser Trp Gln Ser Lys Gln Phe

85 90 95

Gln Asp Val Leu Ala Asn Gly Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe

100 105 110

Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asp Gly Ala Thr Glu Glu Glu Leu

115 120 125

Ala Gly Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Ser

130 135 140

Phe Ala Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Val Thr Phe Thr Pro Gln Gln

145 150 155 160

Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Ala Lys Gly Trp Glu Tyr Leu Met Ser

165 170 175

Ile Phe Asp Gln Met Ser Lys Ser His Val Lys Tyr Ile Arg Leu Asp

180 185 190

Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Ala Gly Thr Ser Cys Phe Met Thr

195 200 205

Pro Lys Thr Phe Glu Leu Ile Ser Arg Leu Arg Glu Glu Gly Ala Lys

210 215 220

Arg Gly Leu Glu Ile Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln

225 230 235 240

Val Glu Ile Ala Ala Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro

245 250 255

Pro Leu Leu Leu His Ser Leu Phe Thr Gly Lys Val Asp Ala Leu Ala

260 265 270

His Trp Thr Glu Ile Arg Pro Asn Asn Ala Val Thr Val Leu Asp Thr

275 280 285

His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Leu Asp Arg

290 295 300

Ser Leu Lys Gly Leu Val Pro Asp Ala Asp Val Asp Asn Met Val Glu

305 310 315 320

Thr Ile Ala Lys Asn Thr His Gly Glu Ser Lys Ala Ala Thr Gly Ala

325 330 335

Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Phe Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser

340 345 350

Ala Leu Gly Cys Asn Asp Gln His Tyr Ile Ala Ala Arg Ala Val Gln

355 360 365

Phe Phe Leu Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala

370 375 380

Gly Glu Asn Asp Met Glu Leu Leu Lys Arg Thr Asn Val Gly Arg Asp

385 390 395 400

Ile Asn Arg His Tyr Tyr Thr Thr Ser Glu Ile Asp Lys Asn Leu Glu

405 410 415

Arg Pro Val Val Lys Ala Leu Asn Ala Leu Ala Arg Phe Arg Asn Glu

420 425 430

Leu Pro Ala Phe Asp Gly Asp Phe Ser Tyr Ser Val Gly Asp Asp Glu

435 440 445

Ser Ile Ala Phe Ser Trp Asn Gly Phe Gly Ser Ser Ala Thr Leu Thr

450 455 460

Phe Thr Pro Ser Lys Gly Met Gly Val Glu Asn Pro Gln Ser Val Ala

465 470 475 480

Thr Leu Val Trp Thr Asp Ser Thr Gly Glu His Arg Thr Asp Asp Leu

485 490 495

Ile Ala Asn Pro Pro Val Met Gln Ala Ser

500 505

Claims

1.一种对槲皮素具有糖基化活性的蔗糖磷酸化酶突变体Q345，其特征在于：所述蔗糖磷酸化酶突变体Q345由506个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞是包含权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F的原核细胞或真核细胞。

3.如权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体Q345F在槲皮素葡萄糖基化方面的应用。