CN105779404A - 一种蔗糖磷酸化酶的突变体t155s及其应用 - Google Patents

一种蔗糖磷酸化酶的突变体t155s及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶学技术领域，具体涉及一种蔗糖磷酸化酶的突变体T155S及其应用。一种蔗糖磷酸化酶的突变体T155S，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的蔗糖磷酸化酶突变体T155S是通过将Bspase的155位的苏氨酸Thr，T突变成丝氨酸Ser，S改造得到的。本发明提供的蔗糖磷酸化酶突变体T155S在转糖苷功能方面增加了对D‑甘露糖的转糖苷活性。

Description

一种蔗糖磷酸化酶的突变体T155S及其应用
技术领域
本发明属于酶学技术领域，具体涉及一种蔗糖磷酸化酶的突变体T155S及其应用。
背景技术
蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase，EC2.4.1.7)催化蔗糖和磷酸生成D-果糖和α-葡萄糖-1-磷酸，该反应是可逆反应。蔗糖磷酸化酶属于糖基水解酶家族13，同样也属于α-淀粉酶家族。
首次报道的蔗糖磷酸化酶来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)ATCC 12291(Kagan BO,Latker SN,Zfasman EM.Phosphorolysis of saccharoseby cultures of Leuconostoc mesenteroides.1942，Biokhimiya，7:93-108.)，也是目前报道产蔗糖磷酸化酶最高的菌株。研究产蔗糖磷酸化酶的菌株主要有嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)(Doudoroff Michael.Studies on thephosphorolysis of sucrose.1943，Journal of Biological Chemistry，151(2):351-361.)、肠膜明串珠菌(Kawasaki Haruhiko,Nakamura Narutoshi,Ohmori Masaaki,et al.Screening for bacteria producing sucrose phosphorylaseand characterization of the enzymes.1996，Bioscience,biotechnology,andbiochemistry，60(2):319-321.)、变异链球菌(Streptococcus mutans)(RussellRR,Mukasa H,Shimamura A,et al.Streptococcus mutans gtfa gene specifiessucrose phosphorylase.1988，Infection and immunity，56(10):2763-2765.)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)DSM20083(van den Broek L.A.,van Boxtel E.L.,Kievit R.P.,et al.Physico-chemical and transglucosylationproperties of recombinant sucrose phosphorylase from Bifidobacteriumadolescentis DSM20083.2004，Appl Microbiol Biotechnol，65(2):219-227.)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(Kullin B.,Abratt V.R.,Reid S.J.Afunctional analysis of the Bifidobacterium longum csca and scrp genes in sucroseutilization.2006，Applied Microbiology and Biotechnology，72(5):975-981.)以及一些基因工程菌(Lee Jin-Ha,Yoon Seung-Heon,Nam Seung-Hee,et al.Molecular cloning of a gene encoding the sucrose phosphorylase fromLeuconostoc mesenteroides B-1149and the expression in Escherichia coli.2006，Enzyme and Microbial Technology，39(4):612-620.)。
蔗糖磷酸化酶催化的反应有三类：磷酸解和合成、水解、转糖苷反应(AertsD.,Verhaeghe T.F.,Roman B.I.,et al.Transglucosylation potential of six sucrosephosphorylases toward different classes of acceptors.2011，Carbohydr Res，346(13):1860-1867.)。蔗糖磷酸化酶引人注目的地方是它的特殊的转糖苷活性。蔗糖磷酸化酶以蔗糖、G1P(α-D-glucose-1-phosphate)、G1F(α-glucopyranosyl Fluoride)作为葡萄糖基的有效供体，相反的，蔗糖磷酸化酶的受体范围很广泛，例如多羟基、含酚、苄基以及羧基的物质。在转糖苷反应过程中，葡萄糖-酶中间化合物可以被水拦截，导致水解反应取代底物的转糖苷反应。Nidetzky研究团队发现供体底物和受体底物的浓度共同显著的影响水解速率和转糖苷效率。
转糖苷反应能够显著地影响化合物的性质，一个葡萄糖基可以提高分子的溶解性、稳定性、风味和药物代谢动力学行为，或者简单地概括为对物质的生物学活性是至关重要的(Aerts D.,Verhaeghe T.F.,Roman B.I.,et al.Transglucosylation potential of six sucrose phosphorylases toward different classesof acceptors.2011，Carbohydr Res，346(13):1860-1867.)。例如在糖类和糖醇类的应用上，糖类的转糖苷产物可作为食品添加剂和化妆品材料，目前研究热点是可作为益生元的低聚糖类，目前研究表明合成的低聚糖有1-α-D-葡萄糖-L-半乳糖、1-α-D-葡萄糖-D-鼠李糖、1-α-D-葡萄糖-D-木糖等。糖醇类的转糖苷产物具有抑制牙菌斑形成以及可以替代的甜味剂的潜力。另外蔗糖磷酸化酶催化合成某些不稳定性物质的衍生物，提高其稳定性，例如抗坏血酸、儿茶素等物质，抗坏血酸的转糖苷产物抗坏血酸葡糖苷可应用于美白产品。以及对某些物质进行修饰和改性，譬如乙酸、咖啡酸、对苯二酚等物质。
在甘露糖葡萄糖基化方面，孔繁和朱玉亮在发明专利ZL00100842.0中是使用苯甲酰化的甘露糖及葡萄糖的烷基原酯酸为原料在路易斯酸催化下的化学制备方法获得1→2连接的、具有1,2反式糖苷键的甘露糖及葡萄糖双糖。
以蔗糖磷酸化酶为名称查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现6项发明专利。其中，关于蔗糖磷酸化酶的人工突变的专利有2项，1项中的蔗糖磷酸化酶突变体的酶活获得了提高，1项中的蔗糖磷酸化酶突变体缺失了逆途径；关于构建表达蔗糖磷酸化酶基因生物的专利有2项，1项是表达蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌，1项是在植物中蔗糖磷酸化酶的表达；关于蔗糖磷酸化酶的回收方法的专利有1相；关于蔗糖磷酸化酶耐热化的方法的专利有1项。
以蔗糖磷酸化酶为检索要素查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现29项发明专利，这29项包括了上面以蔗糖磷酸化酶为名称进行检索的6项发明专利。另外23项专利中有7项是关于蔗糖磷酸化酶在诊断/测定试剂盒中的运用；有8项是关于以蔗糖为原料利用蔗糖磷酸化酶生产α-熊果苷、S-α-D葡萄糖苷-L-半胱氨酸、琥珀酸和其他化学品、直链糊精、生产碳基目的产物、葡聚糖、海藻糖和由酶合成的直链淀粉得到的生物可降解制品这8类化学品；有1项是以蔗糖为原料利用蔗糖磷酸化酶生产葡聚糖的英文版专利；有4项是关于蔗糖磷酸化酶在植物中的应用；有1项是关于α-葡聚糖磷酸化酶耐热化的方法；有1项是关于蔗糖磷酸化酶的制造方法；有1项是利用在编码调节因子ArcA和IclR的基因中突变的微生物用于合成作为可拉酸途径一部分的任何化合物(例如GDP-岩藻糖、GDP-甘露糖和可拉酸)，和/或还可用于(从作为前体的GDP-岩藻糖开始)合成岩藻糖基化的寡糖或用于(从作为前体的GDP-甘露糖开始)合成甘露糖基化的寡糖。
发明内容
为了扩宽蔗糖磷酸化酶的转糖苷能力，本发明提供了一种蔗糖磷酸化酶的突变体T155S，它是通过将蔗糖磷酸化酶Bspase的155位的苏氨酸突变成色氨酸而得到的。蔗糖磷酸化酶突变体T155S和突变前Bspase相比，增加了对D-甘露糖的转糖苷反应活性。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种蔗糖磷酸化酶突变体T155S，由506个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种宿主细胞，它含有所述的蔗糖磷酸化酶突变体T155S的原核细胞或真核细胞。
另外，本发明还提供了所述的蔗糖磷酸化酶突变体T155S在甘露糖葡萄糖基化方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的蔗糖磷酸化酶突变体T155S是通过将Bspase的155位的苏氨酸Thr，T突变成丝氨酸Ser，S改造得到的。
(2)本发明提供的蔗糖磷酸化酶突变体T155S在转糖苷功能方面增加了对D-甘露糖的转糖苷活性。
附图说明
图1是本发明的蔗糖磷酸化酶的突变体T155S纯化物的SDS-PAGE图；
图2是本发明的蔗糖磷酸化酶Bspase对D-甘露糖的转糖苷产物HPLC分析图；
其中，A为D-甘露糖的标样，B为蔗糖磷酸化酶Bspase对D-甘露糖的转糖苷产物。
图3是本发明的蔗糖磷酸化酶突变体T155S对D-甘露糖的转糖苷产物HPLC分析图；
其中，A为D-甘露糖的标样，B为蔗糖磷酸化酶突变体T155S对D-甘露糖的转糖苷产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系XL10-gold购自Stratagene公司；大肠杆菌(Escherichia coli)株系XL1-blue、载体pUC19购自大连TaKaRa公司；表达载体pSE380购自Stratagene公司；购自TaKaRa的限制性内切酶、修饰酶等试剂；购自Invitrigen公司的镍亲和层析蛋白质组氨酸纯化介质；D-甘露糖购自BioBasic公司；葡萄糖-1-磷酸购自Sigma公司。
下面将通过实施例对本发明作详细描述，所提供的实施例是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。
(1)蔗糖磷酸化酶基因Bspase的克隆
广西武鸣糖厂采集的土壤样本构建了一个宏基因组文库，从宏基因文库中筛选到一个具有蔗糖磷酸化酶活性的阳性亚克隆子pUC-SP。送交华大基因公司进行DNA测序，测序的序列进行Blastp比对分析，发现其中一个ORF与来自Bifidobacterium animalis subsp.lactis AD011(乳双歧杆菌AD011)的蔗糖磷酸化酶基因的同源性最高，两者的一致性＝1521/1521(100％)，将这个ORF基因命名为Bspase。
设计上游引物Bspase-1(包含一个EcoRI酶切位点和六个组氨酸标签)和下游引物Bspase-2(包含一个HindIII酶切位点)(见表1)，以亚克隆子pUC-SP为模板，通过聚合酶链式反应PCR扩增蔗糖磷酸化酶基因Bspase，用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切蔗糖磷酸化酶Bspase后，插入到经EcoRI和HindIII酶切的表达载体pSE380进行连接。获得的重组质粒命名为pSE-Bspase。
表1上游引物Bspase-1和下游引物Bspase-2的序列
(2)蔗糖磷酸化酶基因突变体基因T155S的获得
T155S基因是将基因Bspase的155位的苏氨酸突变成色氨酸来进行改造的。以步骤(1)中构建的pSE-Bspase为模板，用上游引物TS-1和下游引物TS-2(见表2)进行反向PCR反应。PCR条件为：98℃预变性2分钟；98℃变性10秒；62℃复性15秒；72℃延伸6分钟；30个循环后，72℃保温10分钟。PCR产物用1μL DpnⅠ在37℃作用1小时消解模板，氯化钙化学法转入E.coli XL10-Gold感受态细胞。转化产物克隆送交上海生物工程有限公司进行DNA测序分析确定正确的转化子。
表2上游引物TS-1和下游引物TS-2的序列
上游引物TS-1 5′-CGCTTGGTGTGGGTCAGCTTCACGCCGCAGCAG-3′
上游引物TS-2 5′-CTGCTGCGCCGTGAAGCTGACCCACACCAAGCG-3′
(3)蔗糖磷酸化酶突变体基因T155S的表达和纯化
将含有突变体T155S质粒的重组大肠杆菌XL1-blue菌株接种到500mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养，待OD600为0.4时，加入IPTG使其终浓度为0.5mmol/L，20℃诱导22小时。6000转离心10分钟，收集菌体，用8mL裂解缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0)重悬菌体，加入1mL浓度为50mg/mL溶菌酶，冰上静止15分钟。超声波破胞16分钟。4℃、12000转离心20分钟取上清即为粗酶液。按每4mL上清液加入1mL 50％的镍亲和层析填充料，在4℃用200转摇60分钟，然后用1mL冲洗缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0)洗去杂蛋白，重复4次。最后用洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白质，重复7次。收集第一次洗脱的蛋白质溶液，通过30kDa的超滤膜脱盐处理，再进行变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
结果如图1所示，在45-66kDa之间发现有一条明显的目的蛋白质条带，本发明的蔗糖磷酸化酶突变体T155S纯化物的分子量为56kDa。
(4)蔗糖磷酸化酶突变体T155S对D-甘露糖的转糖苷产物的HPLC分析
蔗糖磷酸化酶突变体T155S对D-甘露糖的转糖苷反应体系：以终浓度为15％葡萄糖-1-磷酸为供体底物，10μL蔗糖磷酸化酶突变体T155S纯化物和浓度为5％的D-甘露糖在45℃、pH 6.5条件下反应12小时，然后将反应物放置在沸水中10分钟终止反应，室温冷却，进行HPLC分析，检测其反应产物。
HPLC工作条件：安捷伦1260色谱仪；示差折光检测器；色谱柱：安捷伦氨基色谱柱(250×4.6mm)；流动相：乙腈：双蒸水＝68：32；流速1mL/min；进样量20μL；柱温：25℃。
突变前的蔗糖磷酸化酶Bspase也按照上述突变体的反应体系测定它对D-甘露糖的转糖苷功能。
HPLC工作条件：安捷伦1100色谱仪；示差折光检测器；色谱柱：AlltimaAminoz 5μm色谱柱(250×4.6mm)；流动相：乙腈：双蒸水＝75：25；流速1mL/min；进样量20μL；柱温：25℃。
将获得的突变后的T155S与突变前的Bspase对D-甘露糖的转糖苷产物HPLC结果进行比较分析。
结果如图2、图3所示，蔗糖磷酸化酶Bspase的转糖苷产物中没有新的反应产物出现，只有一个与D-甘露糖相同出峰时间的样品峰(出峰时间为8.273分钟)，而本发明的蔗糖磷酸化酶的突变体T155S对D-甘露糖转糖苷产物中有新的产物反应出现，除有一个D-甘露糖峰(6.466分钟)外还有新的样品峰(8.424分钟)，说明蔗糖磷酸化酶Bspase对D-甘露糖没有转糖苷反应活性，而本发明的蔗糖磷酸化酶的突变体T155S对D-甘露糖具有转糖苷反应活性。

Claims (3)

1.一种蔗糖磷酸化酶的突变体T155S，其特征在于：由506个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种宿主细胞，其特征在于：它含有权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体T155S的原核细胞或真核细胞。
3.权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体T155S在甘露糖葡萄糖基化方面的应用。
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