KR20140140797A - 이소플라본 배당체를 아글리콘 형태로 전환하는 바실러스 서브틸리스 cbn 균주 및 상기 균주를 포함하는 생균제 - Google Patents

이소플라본 배당체를 아글리콘 형태로 전환하는 바실러스 서브틸리스 cbn 균주 및 상기 균주를 포함하는 생균제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물체, 특히 칡뿌리 또는 칡즙박 내에 다량 존재하는 배당체 형태의 이소플라본을 아글리콘 형태의 이소플라본으로 전환할 수 있는 신규한 바실러스 서브틸리스 CBN 균주, 상기 균주를 포함하는 생균제, 및 상기 균주를 이용하여 아글리콘 이소플라본을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 균주를 이용하면 인체에 거부감 없고 경제적인 방법으로 배당체 형태의 이소플라본을 생체내 흡수율이 높은 아글리콘 형태의 이소플라본으로 전환시킬 수 있으며, 상기 균주를 포함하는 생균제는 성호르몬결합단백질(SHBG) 증가, 혈액 내 콜레스테롤 증가 억제, 골격계 질환예방, 항염 및 항산화 효능을 나타내고, 가축에 급여할 경우 산란계의 산란율 향상, 모돈의 발정재귀 단축과 같은 효과로 인해 가축 생산성 향상에 기여할 수 있다.

Description

이소플라본 배당체를 아글리콘 형태로 전환하는 바실러스 서브틸리스 CBN 균주 및 상기 균주를 포함하는 생균제{BACILLUS SUBTILIS CBN STRAIN CONVERTING ISOFLAVONE GLYCOSIDE TO AGLYCONE AND DIRECT-FED MICROORGANISMS COMPRISING THE SAME}
본 발명은 식물체 내에 다량 존재하는 배당체 형태의 이소플라본을 아글리콘 형태로 전환하는 신규한 바실러스 서브틸리스 균주, 상기 균주를 포함하는 생균제, 및 상기 균주를 이용하여 칡뿌리 또는 칡즙박으로부터 아글리콘 이소플라본을 제조하는 방법에 관한 것이다.
이소플라본은 여성 호르몬인 에스트로겐(Estrogen)과 유사한 작용기작을 가지고 있어 식물성 여성호르몬(파이토에스트로겐, Phytoestrogen)이라 불리며, 골다공증의 예방작용, 유방암과 전립선암 등에 대한 항암작용, 콜레스테롤 저하작용 및 항산화 작용 등 다양한 생리활성 기능이 있는 것으로 보고되어 있다. 특히, 에스트로겐 수용체-β에 작용제(agonist)로 작용하여 골용해를 저해하고 골밀도를 증진시키며, 에스트로겐 수용체-α가 우세한 유방과 자궁에서는 길항제(antagonist)로서 작용하여 유방암, 자궁내막암과 같은 에스트로겐성 부작용을 나타내지 않는 것으로 알려져 있다. 또한, 간에서 대사되어 신장을 통해 체외로 배출되므로 신체에 중독현상이 없어 안전한 호르몬 대체요법의 대안으로 사용될 수 있으리라 기대되고 있다.
이소플라본은 자연 상태에서는 대부분이 이소플라본 배당체의 형태로 존재하는데, 배당체 형태의 이소플라본은 위산에 의해 분해되지 않아 체내에서 그대로 흡수되지 않고, 대장 내에 존재하는 미생물이 분비하는 효소에 의해 가수분해된 후에 흡수되기 때문에 흡수율이 낮다. 반면, 발효나 효소반응에 의해 당이 제거된 아글리콘 형태의 이소플라본은 체내에서 미생물에 의한 부가적인 변환없이 위와 소장에서 직접 흡수될 뿐만 아니라 그 흡수속도가 현저히 빠르므로, 이소플라본 배당체를 아글리콘 형태로 전환시키려는 연구가 광범위하게 진행되고 있다.
이소플라본 배당체를 아글리콘 형태로 전환시키는 방법에는 크게 2가지가 있다. 첫 번째 방법은 산을 이용하여 이소플라본을 가수분해하는 방법인데, 이는 공정 후 발생되는 폐수 처리, 부가적인 정제공정, 산성용액의 잔류 위험 등의 단점이 있다. 두 번째 방법은 β-글루코시다제를 이용한 효소 가수분해방법으로 아글리콘 형태의 이소플라본과 글루코시드를 결합시키고 있는 구조를 파괴하는 방법이다. 이 방법은 성공률은 높지만, 고비용으로 인해 산업적으로 적용하기 어렵다. 최근에는 β-글루코시다제를 생성하는 미생물을 이용하여 아글리콘 형태의 이소플라본을 생산하는 방법에 많은 연구가 진행되고 있다.
예컨대, 대한민국특허 공개번호 제2002-007553호는 이소플라본 배당체 용액을 흡착된 수지에 가하여 베타-글루코시다제를 분비하는 미생물을 컬럼에 적용시켜 이소플라본 배당체를 아글리콘으로 전환시키는 방법을 개시하고 있고, 대한민국특허 공개번호 제2002-032078호는 바실러스 서브틸리스 균주를 이용하여 대두 배아를 발효시켜 아세톤 및 에탄올로 추출한 후 흡착수지에 흡착시켜 분리하여 대두 배아로부터 발효를 통한 고순도 이소플라본 아글리콘의 생산방법을 개시하고 있다. 또한, 대한민국특허 공개번호 제2001-027341호는 아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주 또는 트리코더마(Trichoderma)속 균주를 이용한 이소플라본의 아글리콘의 제조 방법을 개시하고 있다.
다른 기술로는, 식물재료로부터 단백질 및 이소플라본 분리 및 회수하는 방법으로, 단백질 추출물을 제조하고 극성이온교환과 접촉시켜 추출물내 이소플라본을 이온교환수지와 결합시켜 분리하는 기술이 공개되어 있고(대한민국특허 공개번호 제2002-103921호), 흡착수지컬럼 또는 흡착성 수지를 이용하여 이소플라본을 회수하는 기술이 개시되어 있다(대한민국특허 공개번호 제2001-091098호, 제2001-016220호 및 제2001-089863호). 그러나, 상기 방법들 모두 주로 수지를 이용하여 이소플라본을 분리하는 것으로서, 바실러스 서브틸리스 균주를 이용한 발효과정이나 발효물을 이용하고 있지 않다.
한편, 식물체 중 칡(Puerariae thubergiana Bentham)은 항산화 물질을 함유하는 다년생 덩굴성 목본으로서, 건조한 뿌리인 갈근은 약용 및 식용으로 이용된다. 또한 칡에는 푸에라린(puerarin), 푸에라린자일로사이드(puerarinxyloside), 다이드제인(daidzein), 다이드진(daidzin), 제니스테인(genistein) 및 제니스틴(genistin) 등의 이소플라본계 성분이 함유되어 있는데, 특히 칡뿌리에 이소플라본 배당체인 푸에라린, 다이드진 등이 상당량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(김소정 외, 한국식품영양과학회지, p16-21, 2004).
또한, 칡뿌리에는 건조 중량 당 950 mg/kg의 다이드제인이 함유되어 있는데 (Kaufman PB, et al., Journal of Alternative and Complementary Medicine, 3:7-12, 1997), 이는 대두의 다이드제인 함량이 130~610 mg/kg인데 비하여 월등히 높은 함량이다. 또한, 칡뿌리에는 대두에서는 거의 발견되지 않는 푸에라린의 함량이 높아(김소정 외, 한국식품영양과학회지, p16-21, 2004), 그 이용 가치가 광범위하다. 또한, 석류는 다이드제인 함량이 22~35 mg/kg이나, 이는 칡이나 대두에 비해선 다소 낮은 편이다(대한민국 특허공개번호 제2004-0096114호). 그러나, 칡에 포함되는 이소플라본의 다양한 이용에 관한 연구는 대두 이소플라본에 비해선 아직 미흡한 실정이다.
최근 칡 내에 포함된 이소플라본의 높은 함량과 효능이 알려지면서, 갱년기 질환, 여성의 생리관련 질병, 골다공증, 고혈압, 당뇨 등의 예방과 치료를 위하여 칡즙을 복용하는 사람이 급증하고 있다. 하지만 칡즙을 짜내고 남은 칡의 부산물, 즉 칡즙박에는 칡즙으로 용출되고도 상당히 많은 함량의 이소플라본이 남아 있음에도 불구하고 현재까지는 단순히 폐기물로 버려지거나 또는 농가에 퇴비로 쓰이고 있는 실정이다.
앞서 언급한 바와 같이, 이소플라본을 분리하기 위한 대부분의 공개된 기술들은 주로 콩배아 또는 콩을 이용한 알콜 추출 및 산가수분해법 또는 이온교환수지법으로서, 바실러스 서브틸리스 균주를 이용하여 칡뿌리에 존재하는 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘 형태로 만들거나 그 발효물을 응용하여 사료첨가용 생균제제로 제조한 연구 결과는 없다.
이에 본 발명자들은 식물체, 그 중 칡뿌리 또는 칡즙박을 효과적으로 발효시켜 이소플라본 배당체를 효율적으로 이소플라본 아글리콘으로 전환할 수 있는 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 분리 및 개발하였으며, 상기 균주를 이용한 발효과정을 통해 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 대량 전환하고, 이소플라본 아글리콘과 전환에 이용된 상기 발효 균주를 포함하는 생균제를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
[특허문헌 1] 대한민국 특허 공개번호 제2002-007553호
[특허문헌 2] 대한민국 특허 공개번호 제2002-032078호
[특허문헌 3] 대한민국 특허 공개번호 제2001-027341호
[특허문헌 4] 대한민국 특허 공개번호 제2002-103921호
[특허문헌 5] 대한민국 특허 공개번호 제2001-091098호
[특허문헌 6] 대한민국 특허 공개번호 제2001-016220호
[특허문헌 7] 대한민국 특허 공개번호 제2001-089863호
[특허문헌 8] 대한민국 특허 공개번호 제2004-0096114호
[비특허문헌 1] 김소정 외, 한국식품영양과학회지, p16-21, 2004
[비특허문헌 2] Kaufman PB, et al., Journal of Alternative and Complementary Medicine, 3:7-12, 1997
따라서, 본 발명의 목적은 배당체 형태의 이소플라본을 아글리콘 형태의 이소플라본으로 전환하는 신규한 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주, 이의 균체, 배양액 또는 발효물을 포함하는 생균제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 아글리콘 이소플라본을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CBN 균주(기탁번호 KACC91782P)를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 바실러스 서브틸리스 CBN 균주(기탁번호 KACC91782P), 이의 균체, 배양액 또는 발효물을 포함하는 생균제를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 바실러스 서브틸리스 CBN 균주(기탁번호 KACC91782P), 이의 균체, 배양액 또는 발효물을 이용하여 칡뿌리 또는 칡즙박으로부터 아글리콘 이소플라본을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주는 β-글루코시다제 등을 비롯한 효소 생산성이 우수하고, 칡뿌리 또는 칡즙박 내 이소플라본 배당체를 아글리콘 형태로 전환시키는 효율이 높고, 내산성 및 내담즙성이 뛰어나다. 따라서, 상기 균주를 이용하여 칡뿌리 또는 칡즙박과 발효시킴으로써 아글리콘 형태의 이소플라본을 다량 생산할 수 있으며, 이렇게 제조된 생균제를 가축에 급여할 경우 산란계의 산란율 향상, 모돈의 발정재귀 단축과 같은 효과로 인해 가축 생산성 향상에 기여할 수 있다.
도 1은 바실러스 서브틸리스 CBN 균주의 서열 상동성 분석 결과이다.
도 2는 바실러스 서브틸리스 CBN 균주의 당이용성 측정 결과이다.
도 3은 선별 균주들의 β-글루코시다제 활성을 비교하기 위해 실시한 아가 확산법의 결과 사진이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 칡즙박에 투여하여 발효시켰을 때, 발효시간에 따른 균주의 생장성 및 칡즙박 내 아글리콘 형태의 이소플라본 함량 변화를 나타낸 결과 사진이다.
본 발명은 칡뿌리 또는 칡즙박에 포함된 배당체 형태의 이소플라본을 아글리콘 형태의 이소플라본으로 전환할 수 있는 신규한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CBN 균주(기탁번호 KACC91782P)를 제공한다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주는 서열번호: 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 가지며, β-글루코시다제 등을 비롯한 효소 생산성, 내산성 및 내담즙성이 우수하다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주는 기존 바실러스 서브틸리스 표준 균주와 글리코겐(GLY), 메틸-D-글루코시드(MDG), 글루코네이트(GNT) 등의 당이용능에서 차이가 있어 신균주로 판단하였으며(도 2), 본 발명자들은 이 신균주를 바실러스 서브틸리스 CBN 균주로 명명하여 농업유전자원센터에 2013년 1월 23일자로 기탁번호 제 KACC91782P로 기탁하였다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 CBN 균주는 트립틱 소이 액체배지(Tryptic soy broth; TSB), 루브리아-버타니 배지(Lubria-Bertani agar; LB 배지), 베네트 한천배지(Bennett agar plate), 영양 한천 배지(nutrient agar) 등 세균 생장을 위한 세균 배양용 배지에서 잘 생장한다. 또한, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주는 25℃ 내지 65℃의 온도, 바람직하게는, 30℃ 내지 37℃의 온도에서 잘 생장하며, 약 37℃가 생장 최적 온도이다. 또한 pH 6.5 내지 pH 7.5의 배지에서 비교적 잘 생장하며, pH 6.8에서 가장 잘 생장한다.
또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 CBN 균주(기탁번호 KACC91782P), 이의 균체, 배양액 또는 발효물을 포함하는 생균제를 제공한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 생균제는 바실러스 서브틸리스 CBN 균주 또는 이의 배양액을 칡뿌리 또는 칡즙박에 투여하여 발효시킨 발효물을 포함할 수 있으며, 추가로 생균제의 제조에 통상적으로 사용되는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 생균제는 사료 첨가제로 이용될 수 있다.
본 발명에서 칡즙박은 통상의 칡즙 제조 시, 가늘게 분쇄한 칡을 물에 넣고 가열한 후 칡즙을 짜고 남은 찌꺼기를 지칭하며, 40 내지 50℃에서 열풍 건조시켜 수분함량이 중량을 기준으로 5% 내지 20중량%, 바람직하게는 약 10중량% 이하의 수분을 포함하는 것을 사용할 수 있다. 칡즙박은 사용 전 분쇄과정을 거쳐 입자크기 5mm 이하인 것을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 발효 혹은 혼합과정 시 칡즙박의 섬유소 성분에 의해 혼합도가 낮아지는 것을 방지하기 위함이다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스 CBN 균주(기탁번호 KACC91782P), 이의 균체, 배양액 또는 발효물을 이용하여 칡뿌리 또는 칡즙박으로부터 아글리콘 이소플라본을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 칡뿌리 또는 칡즙박과 함께 발효시킴으로써 칡뿌리 또는 칡즙박 내에 포함된 배당체 형태의 이소플라본을 아글리콘 형태로 전환시킬 수 있다. 상기 방법은 1) 바실러스 서브틸리스 CBN 균주(기탁번호 KACC91782P)를 25 내지 65℃에서 18 내지 30시간 동안 종균 배양하는 단계; 및 2) 칡뿌리 또는 칡즙박에 부형제를 혼합한 후, 여기에 상기 단계 1)에서 제조한 배양액을 첨가한 후 25 내지 65℃에서 36 내지 72시간 동안 발효시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 따른 공정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
1) 종균 배양 공정
본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 25 내지 65℃, 바람직하게는 30 내지 37℃에서 18 내지 30시간 동안 전배양하여 종균으로 제조하는 공정으로, 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 세균 배양용 배지, 예를 들어 TSB(카제인 췌장분해산물 10g/L, 효모 추출물 5g/L 및 NaCl 10g/L) 배지에서 37℃에서 24시간 동안 호기적으로 전배양한다.
2) 발효 공정
단계 2)에서는 칡뿌리 또는 칡즙박과 상기 단계 1)에서 제조한 균주 배양액을 발효시키는 공정으로서, 총 중량을 기준으로 칡뿌리 또는 칡즙박이 10 내지 50중량%, 및 부형제가 20 내지 50중량%로 혼합되고, 상기 단계 1)에서 제조한 배양액은 1 내지 5중량%가 첨가되는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 총 중량을 기준으로 칡뿌리 또는 칡즙박 10 내지 50중량%, 바람직하게는 10 내지 40중량%(예를 들면 20중량%)를 부형제 20 내지 50중량%(예를 들면 20중량%)와 혼합한 후, 여기에 상기 단계 1)에서 제조한 바실러스 서브틸리스 CBN 균주, 이의 균체 또는 배양액을 총 중량을 기준으로 1 내지 5중량%(예를 들어 약 2중량%)의 농도로 첨가하여 발효시킨다. 이때, 고체발효 시 수분 활성을 위해 총 중량 기준으로 20 내지 60중량%, 바람직하게는 30 내지 40중량%(예를 들면 35중량%)의 수분을 추가로 함께 첨가하여 발효시키는 것이 바람직하다.
상기 발효는 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 칡뿌리 또는 칡즙박에 첨가하여 생육하는 조건, 구체적으로 25℃ 내지 65℃(예를 들면 37℃)에서, 36 내지 72시간, 바람직하게는 40 내지 60시간(예를 들면 60시간) 동안 발효시키는 것이 바람직하다. 만일 발효시간이 36시간 미만이면 이소플라본 아글리콘을 충분하게 증가시키지 못하고, 72시간을 초과하면 이소플라본 아글리콘의 생성량이 크게 증가하지 않아 효율적이지 못하기 때문이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 칡즙박 20중량%를 부형제 45중량%와 혼합하고, 멸균 증류수로 수분을 35중량% 첨가한 후, 여기에 바실러스 서브틸리스 CBN 균주 2중량%를 접종하여 37℃에서 발효시키면, 60시간이 경과된 시점에서 이소플라본 아글리콘 생산효율이 가장 높게 나타난다(실시예 6 참고).
상기 부형제는 곡분, 말분, 포도당 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 수분 첨가를 위해 사용될 수 있는 용매는 멸균 증류수, 비멸균 증류수, 일반 수돗물 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 발효 전과 후의 이소플라본 함량을 비교해 본 결과, 배당체 형태의 이소플라본인 다이드진 및 제니스틴은 각각 34.6% 및 60.7% 감소되었고, 아글리콘 형태의 이소플라본인 다이드제인 및 제니스테인은 각각 194% 및 225% 증가되는 양상을 나타내어, 본 발명의 방법은 아글리콘 이소플라본 전환 효율이 우수함을 알 수 있다.
상기의 방법에 따라 제조된 발효물은 이후 건조 공정을 거쳐 생균 및 아글리콘 이소플라본을 다량 포함하는 생균제로 제조될 수 있다.
건조 공정은, 상기 단계 2)에서 수득한 발효물의 수분을 건조시켜 발효 균주 생균수와 발효물을 안정적으로 유지시키는 것이 필수적이다. 이를 위해 상기 칡뿌리 또는 칡즙박과 바실러스 서브틸리스 CBN 균주의 발효물을 50℃ 내지 70℃, 바람직하게는 약 60℃에서 6시간 내지 12시간, 바람직하게는 8시간 동안 온풍건조시킬 수 있다. 만일 50℃ 이하로 건조시킬 경우에는 건조시간이 길어져 CBN 균주의 활성이 감소할 가능성이 높으며, 70℃ 이상으로 건조시킬 경우에는 아글리콘 이소플라본의 활성이 고온에 의해 불활될 수 있다.
본 발명에 따른 생균제는 바실러스 서브틸리스 CBN 생균, 이의 균체, 배양액 또는 발효물을 1.0×1012 내지 2.0×1012 CFU/kg, 예를 들어 1.2×1012 CFU/kg을 포함하고, 아글리콘 이소플라본을 생균제 총 중량을 기준으로 0.05 내지 0.2중량%, 바람직하게는 0.1 내지 0.2중량%(예를 들어 0.1중량%)를 포함한다(제조예 1 참고).
상기 생균제는 사료 첨가제로서 사용될 수 있으며, 사료 총 중량의 1.0 내지 2.0중량%의 양으로 사료에 첨가하여 급여 제공함으로써 가축의 질병 발생을 억제시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법은, 종래 아글리콘 형태로 전환하기 위하여 주로 사용하였던 산 처리방법과 달리 처리 후 인체에 거부감이 없고, 식물성 여성호르몬으로 알려진 이소플라본이 갖는 성호르몬결합단백질(SHBG) 증가, 혈액 내 콜레스테롤 증가 억제, 골격계 질환예방, 항염 및 항산화 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 포함한 생균제를 가축에 급여할 경우 모돈의 생산성 향상을 도모할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 바실러스 서브틸리스 CBN 균주의 분리 및 동정
경남 남거창 소재의 칡 생산지 및 칡즙박 폐기장소로부터 칡즙을 짜내고 남은 부산물 시료 50 여점을 채취하였다. 채취한 칡 시료에 멸균 증류수를 첨가하고 희석하여 하기 표 1에 기재된 조성을 포함하는 에스쿨린(esculin) 배지를 이용하여 에스쿨레틴(esculetin) 방법으로 균주를 선별하였다. 에스쿨린은 미생물이 생성하는 β-글루코시다제에 의해 에스쿨레틴과 글루코스로 분해되며, 분해된 에스쿨레틴은 철이온과 반응하여 진한 갈색 환을 형성하므로 본 발명에서는 에스쿨린 배지에서 갈색 환을 형성하는 균주 7종을 1차 선별하였다.
β-글루코시다제를 분비하는 균주 분리를 위한 에스쿨린 배지의 조성
조성 단위 (g/L)
트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar) 40
에스쿨린 하이드레이트 1
구연산 암모늄철(III), 갈색 0.5
분리된 균주들의 β-글루코시다제 활성을 비교하기 위하여, 아가 확산(agar diffusion) 방법을 이용하였다. 상기에서 분리된 7종의 균주를 아가(agar)가 제외된 에스쿨린 액체배지를 이용하여 30℃에서 24시간 동안 전배양하였다. 멸균된 페이퍼 디스크(paper disc, 0.7mm)를 준비하여 에스쿨린 아가에 올린 다음, 1개의 페이퍼 디스크마다 하나의 전배양된 균주 배양액 10㎕를 투여하였다. 배양은 30℃에서 48시간 동안 진행하였으며, 페이퍼 디스크 주변으로 생성된 할로(halo)의 지름을 측정하여 균주의 β-글루코시다제 활성을 비교하였다. 배양이 완료된 에스쿨린 아가의 할로를 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.
한편, 선별된 균주들의 β-글루코시다제 활성은 Kohchi 법(Kohchi et al., Agricultural and Biological Chemistry, 49, 779-784,1985)에 따라 측정하였다. 0.05 M 인산나트륨 버퍼(pH 5.5)에 녹인 5mM ρ-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드(pNPG) 1mL와 배양 상등액 1ml를 혼합한 후, 50℃에서 10분간 반응시켰다. 여기에 0.5 M Na2CO3 1 mL를 가하여 반응을 정지시킨 후, 분광 광도계를 이용하여 400 nm에서 발색 정도를 측정하였다. 이때 표준 곡선은 4-니트로페닐을 사용하였으며, 효소활성은 1분 동안 상등액 1mL가 pNPG를 분해하는 정도를 나타낸다. 선별된 균주들의 β-글루코시다제 활성을 수치화한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
균주 β-글루코시다제 활성 (unit) 균주 β-글루코시다제 활성 (unit)
1 8.5 5 3.6
2 9.8 6 2.8
3 8.6 7 4.4
4 5.3
상기 표 2 및 도 3에 나타난 것처럼, 7종의 선별된 균주들은 2.8 내지 9.8 unit의 β-글루코시다제 활성을 보였으며, 선별 균주 중 2번으로 표기된 균주의 활성이 가장 높은 것으로 나타났다.
이에, 가장 높은 β-글루코시다제 활성을 나타내는 2번 균주를 본 발명의 균주로 선별하고, 이의 형태학적 및 생화학적 특성을 확인한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
형태 및 생화학적 특징 반 응
콜로니 형태 (Colony Shape) 불규칙적
콜로니 색 (Colony color) 크림색
세포형태 (Shape) 간균(rod)
그람 염색 (Gram staining) 그람 양성
운동성 (Motility) 양성
호기조건 통성 호기성
포자 형성능 (Endospore) 양성
포자 형태 (Spore shape) 타원형
Catalase 테스트 (Catalase test) 양성
한편, 상기 선별된 균주를 버지의 매뉴얼(Bergey's manual of determinative bacteriology)에 따라 바실러스(Bacillus)속 균주로 1차 동정하였다. 이의 16S rRNA 유전자 염기서열은 서열번호: 1과 같았으며, 이로부터 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 유사한 신균주임을 알 수 있었다(도 1 참고).
또한, 상기 균주의 당이용성을 API 50 CHB 키트(Biomerieux®, France)를 이용하여 분석한 결과를 하기 표 4 및 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 것처럼, 기존 바실러스 서브틸리스 표준 균주에 비해 글리코겐(GLY) 90%, 메틸-D-글루코시드(MDG) 83%, 글루코네이트(GNT) 7% 차이가 나타나는 것으로 확인되었다.
스트립(Strip) 0-19
튜브/기질		 +/- 스트립 20-39
튜브/기질		 +/- 스트립 40-49
튜브/기질		 +/-
0 대조군 - 20 α-메틸-D-만노시드(Mannoside) - 40 D-투라노스(TURanose) +
1 글리세롤 - 21 α-메틸-D-글루코시드 - 41 D-리로스(LYXose) -
2 에리트리톨(ERYthritol) - 22 N-아세틸-글루코사민 - 42 D-타가토스(TAGatose) -
3 D-아라비노즈(Arabinose) - 23 아미그달린(AMYgdalin) - 43 D-푸코스(FUCose) -
4 L-아라비노즈 + 24 알부틴(ARButin) + 44 L-푸코스 -
5 리보스(RIBose) + 25 에스쿨린(Esculin) + 45 D-알비톨(ArabitoL) -
6 D-자일로스(XYLose) - 26 살리신(SALicin) + 46 L-알비톨 -
7 L-자일로스 - 27 셀로비오스(CELlobiose) + 47 글루코네이트(GlucoNaTe) +
8 아도니톨(ADOnitol) - 28 말토스(MALtose) + 48 2-케토-글루코네이트 -
9 β-메틸-D-자일로스 - 29 락토스(LACtose) - 49 5-케토-글루코네이트 -
10 갈락토스(GALactose) - 30 멜리비오스(MELibiose) -
11 글루코스(GLUcose) + 31 수크로스(Sucrose) +
12 프럭토스(FRUctose) + 32 트레할로스(TREhalose) +
13 만노스(MANose) + 33 이눌린(INUlin) -
14 스로보스(SroBose) - 34 멜리지토스(MeLeZitose) -
15 람노스(RHAmnose) - 35 라프피노스(RAFfinose) -
16 둘시톨(DULcitol) - 36 전분 +
17 이노시톨(INOsitol) + 37 글리코겐(GLYcoGen) +
18 만니톨(MANitol) + 38 자일리톨(XyLiTol) -
19 솔비톨(SORbitol) + 39 젠티오비오스(GENtiobiose) -
본 발명자들은, 상기 균주를 바실러스 서브틸리스 CBN 균주로 명명하여 농업유전자원센터에 2013년 1월 23일자로 기탁번호 제 KACC91782P로 기탁하였다.
실시예 2: 바실러스 서브틸러스 CBN 균주의 효소 생산능
본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주의 효소 생산능을 측정하여 기존에 알려진 바실러스 서브틸리스종과 비교하였다.
구체적으로 TSB 배지(카제인 췌장분해산물 10g/L, 효모 추출물 5g/L 및 NaCl 10g/L)에 CBN 균주 및 비교군으로서 바실러스 서브틸리스 ATCC 6633, ATCC 33068, ATCC 9372 및 KCTC 1331을 각각 1%씩 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 각각의 바실러스 균종 배양액을 원심분리(3000rpm, 10분)한 후 상등액을 여과(0.45μm 필터)하였다. 효소 활성 측정을 위해, 펩톤 5g/L, 효모 3g/L 및 NaCl 5g/L를 첨가하여 제조한 효소 활성 측정용 평판 배지(BD Difco co., USA)에 멸균된 페이퍼 디스크(반지름 5mm)를 올리고 그 위에 여과된 각각의 바실러스 배양액을 20μl씩 접종하는 방식으로 아밀라아제(Amylase), 프로테아제(Protease), 리파아제(Lipase), 자일라나제 (Xylanase), 셀룰라제(Cellulase) 및 피타아제(Phytase)의 효소 활성을 측정하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
시 료 +++ (95% 이상); ++ (65% 이상); + (30% 미만); - (음성)
아밀라아제 프로테아제 리파아제 셀룰라아제 자일라나제 피타아제
호기 바실러스 서브틸리스
CBN		 +++ +++ ++ ++ +++ +++
바실러스 서브틸리스
ATCC 6633		 +++ +++ - ++ +++ +++
바실러스 서브틸리스
ATCC 33068		 + + - + + ++
바실러스 서브틸리스
ATCC 9372		 + + - ++ + +
바실러스 서브틸리스
KCTC 1331		 + + + ++ +++ +++
시 료 +++ (95% 이상); ++ (65% 이상); + (30% 미만); - (음성)
아밀라아제
 프로테아제 리파아제 셀룰라아제 자일라나제 피타아제
혐기 바실러스 서브틸리스
CBN		 + +++ - +++ +++ +++
바실러스 서브틸리스
ATCC 6633		 + +++ - ++ ++ +++
바실러스 서브틸리스
ATCC 33068		 + + - + + ++
바실러스 서브틸리스
ATCC 9372		 + + - + + +
바실러스 서브틸리스
KCTC 1331		 ++ + - +++ +++ ++
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주는 호기적으로 배양하였을 경우 기존의 균주에 비해 아밀라아제, 프로테아제, 자일라나제 및 피타아제 등의 효소활성이 매우 우수한 것으로 확인되었으며 셀룰라아제는 거의 유사한 수준으로 확인되었다. 특히 다른 균주에 비해 리파아제 활성이 높은 것으로 나타났다. 또한 혐기적으로 배양하였을 경우에도, 다른 균주에 비해 효소활성이 높은 것으로 나타났다.
실시예 3: 바실러스 서브틸리스 CBN 균주의 내산성 및 내담즙성
상기 실시예 1에서 선발된 바실러스 서브틸리스 CBN 균주의 내산성 및 내담즙성을 확인하였다. 내산성 시험의 경우 바실러스 서브틸리스 CBN 균주의 배양액을 TSB에 1% 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 수득한 배양액을 10% H2SO4를 이용하여 pH 2로 조절하여 2시간 동안 처리하였다. 그 후 초기 생균수 대비 pH 2 처리 후 생균수의 비율로 나타내었고, 내담즙성 시험의 경우 바실러스 서브틸리스 CBN 균주에 1.0% 담즙(bile)을 첨가한 후 생장여부를 확인하였다. 또한, 비교군으로서 바실러스 서브틸리스 ATCC 6633, ATCC 33068, ATCC 9372 및 KCTC 1331도 동일한 조건으로 처리하여 비교한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
No. 시료 내담즙성 내산성
1 바실러스 서브틸리스 CBN >1.0% 95%
2 바실러스 서브틸리스 ATCC 6633 >1.0% 78%
3 바실러스 서브틸리스 ATCC 33068 >1.0% 65%
4 바실러스 서브틸리스 ATCC 9372 >1.0% 25%
5 바실러스 서브틸리스 KCTC 1331 >1.0% 95%
상기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 내담즙성의 경우 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 비롯한 다른 기존의 바실러스 균종 모두 1.0% 담즙이 첨가되었을 때도 생육이 가능한 것을 확인하였다. 내산성의 경우 CBN 균주와 KCTC 1331 균주는 pH 2 처리를 한 후에도 생균수에 크게 변화가 없는 것으로 확인되었으나 다른 균종의 경우 특히 ATCC 9372는 산성 조건에 취약한 것으로 확인되었다. 상기 결과에서 확인하였듯이 본 발명의 CBN 균주는 내담즙성 및 내산성에서 다른 기존의 바실러스 균종에 비해 유사하거나 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 4: 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 이용한 칡즙박 발효에 따른 이소플라본 함량 변화
본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 칡즙박에 투여하여 발효시켰을 때, 칡즙박 내 배당체 및 아글리콘 형태의 이소플라본 함량 변화를 확인하기 위하여, 먼저 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 TSB(카제인 췌장분해산물 10g/L, 효모 추출물 5g/L 및 NaCl 10g/L)에 1%의 양으로 접종하여 37℃에서 24시간 동안 전배양하였다.
한편, 건조된 칡즙박(수분함량 5%)을 입자크기 2mm로 분쇄하여 수득한 칡즙박 분말 20중량%와 부형제로 말분 45중량%를 혼합한 다음, 여기에 멸균된 증류수를 35중량% 첨가하였다. 이어, 상기에서 전배양된 바실러스 서브틸리스 배양액을 2중량% 투여하여 37℃에서 72시간 발효시켜 발효물을 제조하였다.
이소플라본의 추출은, 상기 건조물 1g에 60% 메탄올 39ml을 첨가하여 상온에서 2시간 동안 추출한 후 15,000 rpm에서 원심분리하여 얻어진 상등액을 회수하여 시린지 필터(syringe filter, pore size: 0.2μm)로 여과한 후 HPLC 분석 시료로 사용하였다. 이소플라본 함량은 하기 조건에 따라 에질런트(Agilnet)사의 HPLC를 이용하여 분석하였으며, 발효 전후의 이소플라본 함량 결과를 표 7에 나타내었다.
<HPLC 조건>
컬럼: ODS 계열의 YMC AM303(4.6 x 250mm);
이동상: 0.1% 아세트산 함유 아세토니트릴과 0.1% 아세트산 함유 2차 증류수를 30:70 비로 혼합한 용매;
유속: 1.0 mL/분;
주입량: 20㎕;
검출기: UV 검출기로 파장 (254nm), 감도 (0.32);
이소플라본의 표준물질은 미국 시그마사(Sigma Co, USA)의 제품.
이소플라본 배당체(μg/g) 아글리콘 이소플라본(μg/g)
푸에라린 다이드진 제니스틴 다이드제인 제니스테인
발효 전 6640.44 808.08 140.02 253.08 53.32
발효 후 6600.27 528.42 55.06 490.98 120.12
비교 -0.6% -34.6% -60.7% 194.0% 225.3%
상기 표 7에서 나타낸 것처럼, 칡즙박에 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 투여하여 발효하면, 발효 전에 비해 이소플라본 배당체(푸에라린, 다이드진 및 제니스틴)는 최소 0.6%, 최대 60.7%까지 감소하는 반면, 아글리콘 이소플라본인 다이드제인과 제니스테인은 194.0% 및 225.7%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 상기 결과를 통해, 바실러스 서브틸리스 CBN 균주는 아글리콘 이소플라본으로의 전환에 유리한 것을 확인하고, 발효조건 확립을 통해 최적의 이소플라본 전환조건을 확립하기로 하였다.
실시예 5: 칡즙박 농도에 따른 CBN 균주의 생장성 및 β-글루코시다제 활성 변화
본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN를 투여하여 발효할 때, 첨가되는 칡즙박의 농도에 따른 균주의 생장성 및 β-글루코시다제 활성의 변화를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4에서 칡즙박의 농도를 10 내지 50중량%로 변화시킨 것을 제외하고는 동일한 방식으로 발효를 수행하였다.
칡즙박 농도에 따른 β-글루코시다제 활성을 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방식으로 측정한 결과를 하기 표 8에 나타내었으며, 그에 따른 CBN 균주의 생장성도 함께 나타내었다.
칡즙박 첨가비율 (중량%) 생장성 및 효소활성
생균수 (CFU/g) β-글루코시다제 활성(unit)
10% 2.5 ×109 9.3
20% 2.7 ×109 10.4
30% 2.3 ×109 9.6
40% 2.6 ×109 8.1
50% 7.7 ×107 5.3
표 8에 나타난 바와 같이, 칡즙박의 함량이 10 내지 40중량%까지는 CBN 균주의 생장성은 거의 유사하였으나, 50중량% 첨가 시엔 감소되었다. 반면, β-글루코시다제 효소활성은 칡즙박 20중량% 첨가 시 가장 높았다. 이에 따라, 이후로 진행되는 CBN 균주의 고체발효 시 가장 적절한 칡즙박의 함량은 20중량%로 결정하였다.
실시예 6: 발효시간에 따른 칡즙박 내 β-글루코시다제 활성의 변화
본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN를 칡즙박에 투여하여 발효할 때, 발효시간에 따른 균주의 생장성 및 β-글루코시다제 활성의 변화를 확인하기 위하여, 발효시간을 하기 표 8에 기재된 경과시간으로 변화시킨 것을 제외하고는 상기 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방식으로 발효를 수행하였다.
칡즙박 농도에 따른 β-글루코시다제 활성을 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방식으로 측정한 결과를 하기 표 9에 나타내었으며, 그에 따른 CBN 균주의 생장성도 함께 나타내었다.
경과시간 생장성 (CFU/g) β-글루코시다제 활성 (unit)
0 4.2 × 105 0
12 3.8 × 105 4.3
24 1.7 × 108 10.8
36 2.9 × 109 15.5
48 3.7 × 109 17.6
60 2.2 × 109 9.2
72 2.8 × 109 4.5
84 2.5 × 108 4.1
96 3.1 × 107 2.5
표 9에 나타난 바와 같이, 발효 시간에 따른 β-글루코시다제 활성은 48시간 째에 가장 높았으며, 60시간 이후에는 급격히 감소하는 것으로 확인되었다. 다만 β-글루코시다제를 비롯한 다양한 효소의 경우, 미생물이 생장을 위한 전단계에서 영양분 흡수를 위해 분비하는 경우가 높은 것이 일반적이므로, 실제 아글리콘 이소플라본이 증가하는 시점은 다소 늦을 것으로 예상되었다.
실시예 7: 발효시간에 따른 이소플라본 함량 변화
칡즙박 내 이소플라본 배당체의 아글리콘 형태로 전환되는 효율이 가장 높은 발효시간을 확인하기 위하여, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CBN 균주의 종균 배양액을 투여한 시점을 0시간으로 하고, 12시간 간격으로 시료를 채취하여 생장성, 및 비배당체 이소플라본 함량을 측정하였다.
이소플라본의 추출 및 함량 분석은 상기 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방식으로 수행하였으며, 발효시간에 따른 이소플라본 배당체 및 아글리콘 이소플라본의 함량 변화를 하기 표 10와 도 4에 나타내었다.
경과시간 생장성 (CFU/g) 다이드제인 (μg/g) 제니스테인 (μg/g)
0 4.2 × 105 249.2 54.1
12 3.8 × 105 275.4 62.5
24 1.7 × 108 321.0 70.9
36 2.9 × 109 370.9 89.4
48 3.7 × 109 411.4 95.3
60 2.2 × 109 450.3 99.0
72 2.8 × 109 475.6 114.7
84 2.5 × 108 483.9 118.4
96 3.1 × 107 491.5 119.7
표 10에 나타난 바와 같이, CBN 균주의 생장성은 48시간이 가장 높으며, 아글리콘 이소플라본 생산량은 시간이 36시간 이후부터 급격히 증가하는 것으로 나타났다. 다만 60시간 이후엔 생산되는 증가율이 크게 높아지지 않으므로 대량 생산 시의 경제성을 고려하여 60시간에서 발효를 중지하는 것이 유리할 것으로 판단된다.
제조예 1: 생균제의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 바실러스 서브틸리스 CBN 균주를 상기 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방식으로 전배양하였다. 이어, 건조된 칡즙박(수분함량 5%)을 입자크기 2mm로 분쇄하여 수득한 칡즙박 분말 30중량% 및 부형제로 말분 35중량%를 혼합한 다음, 멸균 증류수를 35중량% 첨가하였다. 여기에 상기 전배양액 2중량%를 첨가하여 37℃에서 60시간 동안 발효시켰다. 상기에서 제조한 발효물을 60℃에서 8시간 동안 열풍 건조기를 이용하여 건조함으로써 생균제를 제조하였다.
이렇게 제조된 생균제는 아글리콘 이소플라본을 549 mg/kg을 포함하고, 균체의 수가 1.2×1012 CFU/kg이었다.
농업유전자원센터 KACC91782P 20130123
<110> Cheil Bio. Co., Ltd. <120> BACILLUS SUBTILIS CBN STRAIN CONVERTING ISOFLAVONE GLYCOSIDE TO AGLYCONE AND DIRECT-FED MICROORGANISM COMPRISING THE SAME <130> FPD201302-0056 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1009 <212> DNA <213> Bacillus subtilis CBN <400> 1 ggggggtacg gtggtcggca tattgggcgt aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga 60 tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga 120 agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag 180 tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa 240 caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt 300 tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa 360 gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 420 cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga 480 cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 540 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg 600 ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 660 catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa 720 accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc 780 gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt tgaatacgtt 840 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg 900 aggtaacctt ttaggagcca gccgccgaag gtgggacaga tgattgggtg attacagggg 960 ggggaaacaa aaatatataa aaaggccgcc gacccccccg tggtttttt 1009

Claims (5)

  1. 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) CBN 균주 (기탁번호 KACC91782P).
  2. 바실러스 서브틸리스 CBN 균주(기탁번호 KACC91782P), 이의 균체, 배양액 또는 발효물을 포함하는 생균제.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 생균제가 총 중량을 기준으로 0.05 내지 0.2중량%의 아글리콘 이소플라본을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생균제.
  4. 바실러스 서브틸리스 CBN 균주(기탁번호 KACC91782P), 이의 균체, 배양액 또는 발효물을 이용하여 칡뿌리 또는 칡즙박으로부터 아글리콘 이소플라본을 제조하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 방법이,
    1) 바실러스 서브틸리스 CBN 균주(기탁번호 KACC91782P)를 25 내지 65℃에서 18 내지 30시간 동안 종균 배양하는 단계; 및
    2) 칡뿌리 또는 칡즙박에 부형제를 혼합한 후, 여기에 상기 단계 1)에서 제조한 배양액을 첨가한 후 25 내지 65℃에서 36 내지 72시간 동안 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.


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