KR20040071953A - 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 신규한 미생물 및 이를함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈당강하 및 항바이러스 활성을 갖는 1-데옥시노지리마이신(1-Deoxynojirimycin)을 생산하는 신규한 미생물 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 본 미생물은 α-글리코시다제(α-glycosidase)를 유의성있게 저해하고, 1-데옥시노지리마이신을 생산하여 당뇨병 질환의 예방 치료에 유용한 의약품, 사료첨가제 및 건강 기능 식품을 제공할 수 있다.

Description

1-데옥시노지리마이신을 생산하는 신규한 미생물 및 이를 함유하는 조성물{Novel microorganism producing 1-deoxynojirimycin and its composition containing the same}

본 발명은 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 신규한 미생물 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항바이러스 및 혈당강하 활성을 갖는 1-데옥시노지리마이신 및 이를 생산하는 신규한 미생물인 바실러스 서브틸리스 모리(Bacillus subtilisMORI)를 유효 성분으로 함유하는 조성물 및 이의 제제에 관한 것이다.

많은 종류의 식물과 미생물로부터 분리되고 있는 알칼로이드(alkaloid) 물질들은 대부분 당 구조내에 수 개의 수산기(OH)를 포함하며, 또 당 분자의 산소가 질소로 치환되어 있는 구조적 특징을 나타낸다. 현재까지 약 100여 종류가 넘는 알칼로이드가 알려져 있으며, 이들은 구조적으로 피페리딘(piperidines), 피롤리딘(pyrrolidines), 인돌리지딘 (Indolizidines), 피롤리지딘 (pyrrolizidines), 노트로판(nortropanes)의 다섯 계열로 나눌 수 있다(Asano,et al.,Tetrahedron, 11, pp1645~1680, 2000).

이중, 피페리딘 계열은 6탄당의 구조를 가진 1-데옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 이하 DNJ)이 대표적인 물질로서, 이 물질은 처음에는 L-소르보푸라노즈(sorbofuranose)로부터 합성(Paulsenet al.,Chem Ber.,100, p802, 1967) 또는 노지리마이신의 환원(Inouyeet al.,Tetrahydron,24, pp2125~2144, 1968) 등과 같은 화학적인 방법에 의해 얻어졌으며, 이밖에 바실러스(Schmidtet al.,Naturwissenshaften,66, pp584~584, 1979), 스트렙토마이세스(Inouyeet al.,J. Antibiot. Ser. A,19, pp288~292, 1966 : Ishidaet al.,J. Antibiot. Ser A,20, pp66~71, 1967 : Murano and Miyata,Agric Biol. Chem.44, pp219~221, 1980) 등과 같은 미생물을 비롯하여 최근에는 뽕나무(Morus albaL.) 또는 누에(Bombyx moriL.)(Asanoet al.,J. Agric. Food Chem.49, pp4208~4213, 2001)로부터 분리되었음이 확인되었다. 1-데옥시노지리마이신은 포유동물의 소장에 존재하는 알파-글루코시다아제(α-glycosidase) 및 소장에서 혈액으로 포도당 유입에 대한 탁월한 저해능을 갖음으로서, 오래전부터 식후 고혈당증을 유발하는 인슐린 비의존형 당뇨병의 치료제로 주목을 받아왔다(Yagiet al.,Nippon Nogeikagaku Kaishi,50, pp571~572, 1976). 피페리딘 계열의 알칼로이드는 이밖에도 1-데옥시만노지리마이신(deoxymannojirimycin), 파고민(fagomine), 3-에피-파고민(3-epi-fagomine) 등이 알려져 있다.

5탄당의 구조를 가진 피롤리딘 계열은 토끼의 소장 슈크라아제(sucrase)나 말타아제(maltase)에 대한 저해 활성이 1-데옥시노지리마이신에 비해 낮으나, 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)나 글루코아밀라아제(glucoamylase)에 대해서는 우수한 것으로 보고되고 있다(Yosikuninet al.,Agric. Biol. Chem.,52, pp121~128, 1988). 인돌리지딘(indolizidine) 계열은 하나의 5탄당 구조와 하나의6탄당 구조를 갖는 알칼로이드류 화합물로서, 스와인소닌(swainsonine) 및 카스타노스퍼민(castanospermine)이 그 대표적인 물질이다. 피롤리지딘(pyrrolizidines) 계열은 두 개의 5탄당 구조를 갖는 알칼로이드 화합물로서, 대표적인 물질은 아우스트라린(australine)이며, 노트로판(nortropanes) 계열은 카리스테진(calystegin)이 발견되면서 새롭게 형성된 알칼로이드 계열이다.

상기와 같은 알칼로이드 물질들은 우리 몸의 당대사와 당단백질의 생성에 중요한 역할을 하는 글루코시다아제에 대한 저해기능을 보유함으로써 이 물질의 산업적 응용이 기대되고 있으며, 현재 가장 활발한 산업적 응용으로는 소장에서의 글루코시다아제를 저해하여 단당류의 소장흡수를 억제하는 당뇨병 치료제가 있다. 당뇨병 환자들은 현재 전 세계적으로 증가 추세에 있으며, 우리나라의 경우도 1980년대 말부터 식생활의 변화와 함께 당뇨병, 비만증, 고혈당증 환자가 꾸준히 증가하고 있다. 당뇨병 중에서도 인슐린 비의존형(non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM, Type Ⅱ diabetes) 환자가 95% 이상을 차지하는데, 이 질병에 대한 치료제로써 1970년대 이후부터 1-데옥시노지리마이신와 같은 경구용 당뇨병 치료제가 개발되고 있다(Yagiet al.,Nippon Negeikagaku Kaishi,50, pp571~572, 1976 : Schmidtet al.,Naturwissenshaften, 66, pp584~585, 1979). 또한, 알칼로이드 물질이 항바이러스, 항암 및 암전이 등에 효과가 밝혀지고 있으며, 이를 이용한 다양한 의약품들이 임상실험을 통해서 의약품으로 판매되고 실정이다.

현재, 1-데옥시노지리마이신를 생산하는 방법으로는 뽕나무(Morus alba L.) 등의 식물에서 추출하는 방법(Yagiet al.,Nippon Negeikagaku Kaishi,50,pp571~572, 1976 : Matsumuraet al.,Jpn. Patent kokoku,59, p27338, 1984 : Evanset al.,Phytochemistry,24, pp1953~1955, 1985 ; Kiteet al.,Biochem. Syst. Ecol.,19, pp441~445, 1991 : Yamadaet al.,Shoyakugaku Easshi,47, pp47~55, 1993), 바실러스(Frommeret al., Ger. Patent Often, 265863[C. A., 91, 18359]) 또는 스트렙토마이세스(Murao and Miyata,Agric. Biol. Chem.,44, pp291-221, 1980 : Ezureet al.,Agric. Biol Chem.,19, pp2159~2165, 1985 : Hardicket al.,Tetrahedron,30, pp6285~6296, 1992) 등의 미생물을 이용한 발효에 의한 생산, D-포도당을 전구체로 이용한 화학적인 합성에 의한 생산(Paulsenet al., Chem. Ber., 100, 802, 1967), 글루코실아민을 이용한 합성 및 효소를 이용한 합성(Wonget al., Tetrahydron Lett., 32, 4867~4870, 1991) 등이 알려져 있다. 식물체에서 추출하는 방법은 현재까지 가장 활발하게 연구가 진행되어 왔으며, 현재까지 알려진 대부분의 알칼로이드가 식물에서 추출되었다(Watsonet al.,Phytochemistry,56, pp265~295, 2001). 하지만 식물에서 추출하는 방법을 산업적으로 이용하는 것은 낮은 1-데옥시노지리마이신의 함량, 비슷한 구조의 노지리마이신과 데옥시만노노지리마이신 물질중에서 복잡한 정제과정 등의 문제점 및 화학적으로 1-데옥시노지리마이신 합성법 또한 단계가 복잡하고 많은 양의 화학물이 필요하기 때문에 경제성이 떨어진다.

현재 경제적으로 가장 주목을 받는 방법으로는 미생물 발효를 이용한 생산으로서, 산업상 발효기술을 이용하여 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 미생물로 알려진 것으로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리큐파시엔스(Bacillus amyloliquifaciens), 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa)(Schmidtet al.,Naturwissenschaften,66, pp584~585, 1979), 바실러스 서브틸리스 바 니거(Bacillus subtilis var niger)(Hardicket al.,Biochem.,49, pp6707~6717, 1993), 스트렙토마이세스 라벤둘레(Streptomyces lavendulae)(Inouyeet al.,J. Antibiot. Ser. A,19, pp288~292, 1966 ;Tetrahedron,24, pp2125~2144, 1968 : Ishidaet al.,J. Antibiot. Ser A,20, pp66-71, 1967 : Murao and Miyata,Agric. Biol. Chem.,44, pp219-221, 1980 : Ezureet al.,Agric. Biol. Chem.,49, pp1119~1125, 1985), 스트렙토마이세스 서브루틸리스(Streptomyces subrutilis)(Hardicket al.,Terahedron,48, pp6285~6296, 1992) 등이 있다. 상기의 방법은 생산비 절감, 정제과정의 단축 등 경제적인 측면에서 효율적인 방법으로 주목받고 있으나, 아직까지 알칼로이드에 대한 미생물의 연구가 다른 것에 비해서 미비한 것은 배양액에 대한 탐색과정에서 극성이 높은 알칼로이드에 대한 탐색이 쉽지 않다는 것이다(Watsonet al.,Phytochemistry,56, pp265~295, 2001).

이에 본 발명에서는 1-데옥시노지리마이신을 효율적으로 생산하여 산업적인 의약품 및 건강 기능 식품으로 응용이 가능한 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 모리(Bacillus subtilisMORI)를 분리 및 동정하고, 상기 미생물을 이용한 사료첨가제, 식품을 포함하여 정제된 원료의약품으로 정제함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 미생물인 바실러스 서브틸리스 모리(Bacilus subtilisMORI) 및 이에 의해 생산된 혈당강하 활성 및 항바이러스 효능을 갖는 1-데옥시노지리마이신을 함유하는 약학조성물, 건강기능식품 및 사료첨가제를 제공하는 것이다.

도 1 은 돼지 소장으로부터 분리한 효소원 시료의 α-글루코시다아제(α-glucosidase) 지모그램이며,

도 2 는 효소원 시료의 말토즈, 설탕, 셀로비오즈 및 유당과의 반응도이며,

도 3 은 선발된 균주들의 말타아제 저해 시험도이며,

도 4 는 바실러스 서브틸리스 모리(Bacillus subtilisMORI) 균주 배양액에서의 1-데옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin) 생산도이며,

도 5 는 바실러스 서브틸리스 MORI 균주의 기체 크로마토그래피(Gas Chromatography)도이며,

도 6 은 바실러스 서브틸리스 MORI 균주의 총 지방산 조성 분석도이며,

도 7 은 바실러스 서브틸리스 MORI 균주의 퀴논(quinone) 분석도이며,

도 8 은 바실러스 서브틸리스 MORI 균주의 덴드로그램(Dendrogram)이며,

도 9 는 바실러스 서브틸리스 MORI 균주의 전자현미경 관찰도이며,

도 10 은 바실러스 서브틸리스 MORI 균주에 의해 생산된 1-데옥시노지리마이신 및 기타 알칼로이드의 이온교환수지를 이용한 자외선 분석도이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 혈당강하 및 항바이러스 활성을 갖는 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 모리(Bacillus subtilisMORI)(기탁기관: 한국미생물보존센터, 기탁일: 2002년 12월 02일, 수탁번호: KCCM-10450)를 제공한다.

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 모리(Bacillus subtilisMORI)는 돼지 소장의 α-글루코시다아제(α-glucosidase)로부터 분리 및 동정한 바실러스 속의 신규한 균주이다.

바실러스 서브틸리스 MORI의 분리 방법, 균학적 성질 및 용도는 하기와 같으며, 이하 상세하게 설명한다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스 MORI는 돼지 소장으로부터 α-글루코시다아제를 분리한 후, 이 효소의 활성을 억제하는 미생물을 분리하고; 말타제 및 α-글루코시다아제 저해 활성을 나타내는 균주를 최종 선발하였으며; 선발된 우수한 활성의 미생물 균주를 16s rDNA 분석으로 동정한 결과 바실러스 서브틸리스와 98% 이상 동질성을 나타내어, 상기 미생물을 바실러스 서브틸리스 모리(Bacillus subtilisMORI)로 명명하고 한국미생물센터(KCCM)에 2002년 12월 02일자로 기탁하였다.

균주 특성은 다음과 같다.

와이엠(YM) 한천평판 배지(0.3% 효모추출물, 0.3% 말트추출물, 0.5% 펩톤, 1.0% 포도당, 1.8% 한천)에서 37℃, 48시간 배양했을 때 활성을 나타낸 균의 형태로서, 세포의 형상은 벨벳형태이며, 그람양성 간균으로, 운동성은 약간 있으며, 포자 형성능이 있다. 동일한 조건의 배지에서 균의 형태로서 나타난 집락의 형태는 직경 5.0 내지 15.5 mm 크기의 벨벳형태의 집락을 이루고, 색조는 흰색에서 연한 갈색을 띤다. 생리학적 성질로는 20 내지 60℃, 바람직하게는 30 내지 55℃ 이하의 생육 온도, pH 3.0 내지 11.0, 바람직하게는 4.5 내지 10의 생육 pH 조건에서 성장하며, 산소의 영향은 통성 혐기성이고, 당 이용성에 있어서 L-아라비노스, D-만노스, 솔비톨, N-아세틸글루코사민, 이큘린, 말토즈, 사카로스, 글리코겐, 리보스, 아미그달린, 살리신, 트레할로스, D-라피노스, D-프럭토오스, 만니톨, α-메틸-D-글루코시드, 알부틴, 셀로비오스, 인라인, 아미돈, β-젠티오비오스에 양성이며, 각종 효소에 대한 활성에 있어서, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제 및 말타아제에는 활성이 있으며, β-갈락토시다아제에 활성이 없다.

또한, 상기 미생물의 세포구성 지방산을 분석한 결과, 이소(iso-) 및 안테이소기(anteiso-) 구조가 많이 함유되어 있으며, 퀴논 화합물의 주된 구조는 메나퀴논-7을 갖고 있는 것으로 확인되었다.

상기 미생물을 증식시킨 후 이의 배양액을 HPLC(high performance liquid chromatography)로 분석한 결과, 바실러스 서브틸리스 MORI의 배양액에 1g/ℓ의 1-데옥시노지리마이신이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.

상기에서 확인한 바와 같이, 본 발명에서 분리 및 동정한 바실러스 서브틸리스 MORI는 혈당 강하 및 항바이러스 활성을 갖는 1-데옥시노지리마이신을 고농도로 생산하므로 사료, 건강 기능 식품 및 의약품 제재로 사용할 수 있다.

본 발명은 신규한 바실러스 서비틸리스 MORI에 의해 생산되는 1-데옥시노지리마이신을 유효성분으로 포함하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 혈당강하용 약학 조성물을 제공한다.

상기의 1-데옥시노지리마이신은 바실러스 서브틸리스 MORI를 배양한 후, 균체를 제거하고 반복적으로 이온 교환 수지를 통과하여 90%, 바람직하게는 98% 이상 순수하게 정제한 1-데옥시노지리마이신을 포함한다.

본 발명의 혈당강하용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.5 ~ 50% 중량으로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈,수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 MORI 또는 이에 의해 생산된 1-데옥시노지리마이신을 유효 성분으로 함유하는 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 첨가제는 상기 바실러스 서브틸리스 MORI를 배양하여 얻은 균체와 배양액을 부형제와 혼합하거나, 분사 건조 또는 동결 건조로 사료첨가제와 식품으로 제조될 수 있다.

이와 같이 제조된 첨가제나 식품은 1-데옥시노지리마이신을 0.5 내지 5g/ℓ, 바람직하게는 2 내지 4g/ℓ를 함유하며, 상기 첨가제는 사료에 0.1 내지 2 중량%의 양으로 사용될 수 있다. 사료의 형태나 종류의 상관없이 발효 사료, 사일레지 사료, 가루형 사료, 펠렛형 사료 모두에 적용될 수 있다.

본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 MORI 또는 이에 의해 생산된 1-데옥시노지리마이신을 유효성분으로 하고, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강 기능 식품을 제공한다.

상기의 사료첨가제와 동일하게, 1-데옥시노지리마이신을 0.5 내지 5g/ℓ, 바람직하게는 2 내지 4g/ℓ를 함유하며, 상기 바실러스 서브틸리스 MORI를 대두에 발효시켜 그 자체 또는 건조물을 식품으로 사용할 수 있다.

본 발명의 균주 및 화합물들을 포함하는 조성물은 당뇨병 질환의 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 1-데옥시노지리마이신을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 균주 또는 화합물은 당뇨병 질환의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토즈, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1. 돼지 소장으로부터 효소원 분리

도살 직후의 돼지소장내의 이물질을 세제를 이용하여 수돗물로 세척한 후, 미모융막을 조심스럽게 긁어내 0.1M 인산완충용액(pH 6.8)에 현탁시키고, 원심분리(10,000 rpm ×20분)한 다음 상등액을 취하였다. 이 상등액에 80% 황산암모늄을 첨가하여 단백질을 침전시키고 20분 동안 10,000rpm으로 원심분리하여 얻은 침전물을 투석막(M.W. 12,000)을 이용하여 4℃에서 12시간 동안 투석한 다음 동결건조하여 효소원으로 사용하였다.

실험예 1. 효소원의 단백질 분석

실시예 1에서 얻은 효소원의 단백질 함량을 알아보기 위해, 하기와 같은 분석 실험을 수행하였다.

희석한 시료 1㎖에 브래드포드(Bradford, Sigma-Aldrich사, 미국) 시약 9㎖를 넣어서 상온에서 15분간 반응시킨 후 흡광광도계(UV-1202, Shimadzu사, 일본)를 이용하여 595nm에서 흡광도를 측정하여 시료의 단백질 함량을 측정하였으며, 이때 송아지 혈청 알부민(100㎍/㎖)을 표준 시료로 사용하였다.

이 결과 조효소 시료 중의 단백질의 함량은 30㎍/㎎으로 30%의 단백질을 함유하고 있는 것으로 나타났다.

실험예 2. α-글루코시다제 확인 실험

상기 실시예 1에서 얻어진 효소원으로부터의 α-글루코시다제를 검출하기 위하여, 전기영동에 의한 하기와 같은 실험을 수행하였다.

전기영동은 네이티브 페이지(Native-PAGE)법을 사용하였으며(Davis B.,Ann. New York Acad. Sci. pp121~404, 1964), 7.5% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하였다. 시료는 10㎎/㎖의 농도가 되도록 인산완충용액(pH 6.8)으로 조정하고, 조제된 시료 20㎕를 40% 설탕, 0.001% 브로모페놀블루에 충분히 혼화한 후 적하하였다. 전기영동은 트리스-글리신 완충액(pH 8.3)으로 4℃에서 30㎃의 정전류로 90분간 통전하였으며, 영동이 끝난 후 겔을 양분하여 한쪽은 쿠마지 브릴란트 블루(Coomassie Brilliant Blue, Bio-Rad사, 미국) R-250 염색으로 단백질을 검출하고, 나머지 한쪽은 0.1M 인산완충용액(pH 6.8)에 녹인 2.3mM 4-메틸움벨리퍼릴-알파-D-포도당(4-Methylumbelliferyl-α-D-glucose, Sigma-Aldrich사, 미국)을 기질로 하여 37℃에서 1시간동안 효소반응시킨 후, 자외선 분석기(Ultraviolet transilluminator, TL-33E, UVP Inc., 미국)를 이용하여 α-글루코시다아제를 확인하였다.

전기영동을 실행한 후 쿠마지 브릴란트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R-250 염색과 효소 염색법을 병행하여 시행한 결과, 같은 판상에 일치하는 단백질을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

실험예 3. 이당분해효소 확인 실험

상기 실시예 1에서 얻어진 효소원으로부터의 이당분해효소를 검출하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

0.1M 인산 완충용액(pH 6.8)에 녹인 시료(1㎎/㎖) 100㎕와 각각 10mM의 말토즈, 설탕, 셀로비오즈, 유당 각각 400㎕씩을 37α에서 45분간 효소반응 시킨 후, 90℃에서 5분간 열처리하여 반응을 정지시켰다. 각 반응액을 TLC 판(Merck사, Silica gel F254)에 10㎕씩 적하하여 혼합용매(부탄올:프로판올:초산:물 =5:3:3:1.5)에서 전개하였으며, 이 때 포도당을 표준당으로 함께 전개하였다. 전개가 끝난 TLC 판은 60℃의 오븐에서 건조한 후 아릴린-디페닐아민 시약(2㎖ 아릴린, 100㎖ 메탄올, 2g 디페닐아민, 10㎖ 85% 인산)을 분사하고, 104℃에서 30분간 발색하여 포도당의 생성여부를 조사하였다.

실험 결과, 말토즈와 조효소액을 반응시킨 시료에서는 포도당이 진하게 나타났지만, 설탕과 반응시킨 시료에서는 약하게 관찰되었으며 셀로비오즈, 유당과 반응시킨 시료에서는 포도당이 나타나지 않았다. 이에 따라 조효소 시료 내에 단백질 중에 α-글루코시다아제가 함유되어 있으며, 이중 말타아제의 역가가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

실험예 4. 효소원의 α-글루코시다아제 역가 측정

효소원이 α-글루코시다아제의 역가를 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

효소원 시료를 0.1M 인산완충용액(pH 6.8)에 녹인 후 미리 조제한 연속 희석액에 기질로 12mMp-니트로페닐-α-D-글루코피라노시드(p-nitrophenyl-α-D-glucopyronoside, Sigma-Aldrich사, 미국)를 가하여 37℃에서 45분간 반응시킨 후, 200mM 탄산나트륨을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이 효소 반응액을 405nm에서 측정하여 생성된p-니트로페놀량을 측정하고, 1분 동안 1μM의 농도로 생성된p-니트로페놀량을 1 유니트의 효소 역가로 산정하였다.

실험 결과, 단백질 1㎎ 당 7.7 유니트의 α-글루코시다아제 활성을 갖음을 확인하였다.

실험예 5. α-글루코시다아제 저해제 생산균주의 선발

α-글루코시다아제를 저해하는 균주를 선발하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

균주들은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 28 균주와 곡류에서 분리한 바실러스 속(Bacillus sp.) 200 균주들을 사용하였으며, 비교 실험을 위하여 표준 α-글루코시다아제 생산 균주로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilisKCCM 11314), 바실러스 아밀로리큐파시엔스(Bacillus amyloliquefaciensKCCM 40764), 스트렙토마이세스 서브루틸리스(Streptomyces subrutilisKCCM 40337), 스트렙토마이세스 라벤둘레(Streptomyces lavendulaeKCCM 32799, KCCM 12294, KCCM 12293), 스트렙토마이세스 노지리엔시스(Streptomyces nojiriensisKCCM 12307)를 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받아 사용하였다.

상기 균주들을 1% 포도당, 0.5% 대두분, 0.3% 효모추출물이 함유된 액상배지에서 37℃, 150rpm의 조건으로 5일간 진탕배양하였으며, 배양이 끝난 배양액은 100℃에서 5분간 열처리한 후 원심분리(7,000rpm ×20분)하고 얻어진 상등액을 α-글루코시다아제의 탐색을 위한 시료로 사용하였다.

돼지 소장으로부터 분리한 효소추출액을 완충액에 ㎖당 1㎎ 농도로 용해시킨 후 이 용액 100㎕와 10mM 말토즈 400㎕과 균 배양액 200㎕를 가하여 37℃에서 45분간 반응시키고 90℃에서 5분간 열처리하여 반응을 정지시켰다. 이 반응액을 TLC 판에 10㎕씩 적하하여 혼합용매(부탄올:프로판올:초산:물=5:3:3:1.5)를 통해 전개한 후, 아릴닌-디페닐아민 시약에 의해 발색되는 포도당의 생성여부에 따라 포도당 생성 저해 균주를 선별하였다.

실험 결과, 말토즈에서 포도당 생성을 억제하는 14개의 균주를 선발하였다.

실험예 6. HPLC를 통한 α-글루코시다아제 저해제 생산균주의 선발

HPLC 분석을 통한 말토즈 분해 억제능이 우수한 균주배양액의 1-데옥시노지리마이신 생산 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

HPLC 분석을 위해 배양액 10㎕에 9-플루레닐메틸 클로로포르메이트 (flurenylmethyl chloroformate, Fluka사, 스위스) 10㎕를 가해 20℃에서 20분간 반응시킨 후, 0.1M의 글리신을 넣어 반응을 정지시켰다. 이 반응액에 0.1% 초산을 950㎕ 첨가하여 1㎖로 맞춘 후, 0.2㎛ 주사여과로 여과한 후 10㎕씩 컬럼에 주입하였으며, 컬럼은 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18(4.60×250㎜ I.D., 5㎛), 용매는 아세토니트릴-0.1% 초산(1:1, v/v)에서 용출하였으며, 용출속도는 1㎖/분, 검출은 FL3000 형광검출기(excitation 254nm, emission 322nm, FL3000, Hewlett-Packard사, 미국), 분석 프로그램은 크롬퀘스트 TM(ChromQuestTM Version 2.51, ThermoQuest사, 미국)을 각각 사용하였다. 또한 표준시료 폴리히드록실레이티드 알칼로이드(polyhydroxylated alkaloids)로서, 호구리쿠(Hokuriku) 대학 아사노(Asano) 연구실이 머베리 알바(Muberry alba)에서 분리하여¹H 및¹³C-NMR 분석을 마친 2-0-α-D-갈락토피라노실-1-데옥시노지리7마이신(2-O-α-D-galactopyranosyl-1-deoxynojirimycin, 2α-Gal-DNJ), 1,4-디데옥시-1,4-이미노-D-아라비노톨 (1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol, DAB), 1,4-디데옥시-1,4-이미노-(2-0-β-D-글루코피라노실)-D-아라비노톨(1,4-dideoxy-1,4-imino-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-D-arabinitol, 2β-Glc-DAB), 파고민(fagomine),3-에피-파고민(3-epi-fagomine), 칼리스테긴 B2(calystegin B2) 및 N-메틸-1-데옥시노지리마이신(N-methyl- 1-deoxynojirimycin, N-Me-DNJ)을 사용하였다.

1-데옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin)을 생산하는 바실러스 아밀로퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens,KCCM 40764) 균주와 스트렙토마이세스 라벤둘래 아종 라벤둘래(Streptomyces lavendulae subsp.lavendulae,KCCM 12293) 균주를 표준 균주로, 분리 균주중 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.) 4개의 균주와 바실러스 종(Bacillus sp.) 10개의 균주를 HPLC로 분석한 결과, 저해능이 우수하고 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 MORI 균주를 최종적으로 선발하였다(도 3, 도 4 및 표 1 참조).

말타아제 저해활성 및 1-데옥시노지리마이신 생산

균 주	말타아제 저해	1-데옥시노지리마이신 생산
표준균주
KCCM 40764	++++	○
KCCM 12293	+++	○
스트렙토마이세스 속의 균
SS-0247	+++	×
SS-2922	+++	×
SS-3825	+++	×
SS-4299	+++	×
바실러스 속의 균
HG-17	++	×
HG-19	+++	×
HG-24	+++	×
HG-28	++	×
HG-42	+	×
HG-54	+	×
HG-58	++	×
HG-64	++	×
HG-91	++++	○
HG-131	++	×
+: 약한 저해, ++: 중간 저해, +++: 강한 저해, ++++: 매우 강한 저해○: 1-데옥시노지리마이신 생산, ×:1-데옥시노지리마이신 생산하지 않음

실험예 7. 당분석을 통한 균주 동정

선발된 균주를 당분석을 통해 동정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

동정하기 위하여, 50 CHB^®키트(BioMeriux사)를 사용하였으며, 균주를 YM 한천배지(Difco사, 미국)에서 37℃에서 2일간 배양한 후 콜로니를 5㎖의 희석액에 고농도로 현탁하여 다시 5㎖의 희석액에 맥팔랜드 탁도 2에 맞추어 현탁하고, 10㎖ CHL 배지(BioMerieux사, 프랑스)에 접종하여 최종적으로 McF 2 탁도에 맞추었다. 수분조절을 위하여 CH50 용기 내에 각 구역마다 5㎖씩 멸균수를 붓고, 접종된 배지를 CH50의 각 구멍의 아래눈금까지 배지를 삽입시킨 후, 미네랄 오일을 각 구멍의 눈금이 볼록해질 때까지 분주하여 37℃에서 배양하면서 반응여부를 +, -로 기록하여 API(Biomeriux) 분석프로그램을 이용하여 동정하였다(표 2 참조).

MORI 균의 당 이용성 분석 결과, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 각각 99% 및 95%의 유사성을 보였으며, 이로서 MORI 균이 바실러스 종(Bacillussp.) 균주임을 확인할 수 있었다.

기질	이용성	기질	이용성	기질	이용성
글리세롤	-	에리트리톨	-	D-아라비노스	-
L-아라비노스	+	리보스	+	D-자일로스	-
L-자일로스	-	아코나이트	-	β-메틸-자일로시드	-
갈락토스	-	D-글루코오스	+	D-플럭토스	+
D-만노스	+	L-솔보스	-	람노스	-
둘시톨	-	이노시톨	-	만니톨	+
솔비톨	+	α-메틸-D-만노시드	-	α-메틸-D-글루코시드	+
N-아세틸글루코사민	+	아미그달린	+	알부틴	+
이큘린	+	살리신	+	셀로비오스	+
말토즈	+	락토오스	-	멜리비오스	-
사카로스	+	트레할로스	+	인라인	+
멜레지토스	-	D-라피노스	+	아미돈	+
글리코겐	+	자일리톨	-	β-젠티오비오스	+
D-투라노스	-	D-릭소스	-	D-타가토스	-
D-푸코스	-	L-푸코스	-	D-아라비톨	-
L-아라비톨	-	글루코네이트	-	2-세토글루코네이트	-
5-세토글루코네이트	-	대조군	-
+: 생산, -: 비생산상기의 데이터는 99% 이상 바실러스 속과 동일성을 보여준다.

실험예 8. 총 지방산 조성 분석

균주의 총지방산 조성을 분석하기 위하여, 기체 크로마토그라피(GC, HP 6890)를 사용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

표준 지방산으로는 HP(Hewlett-Packard)사에서 제공하는 표준 지방산을 사용하였으며, 균주의 배양은 사보라우드(DIFCO사, 미국) 배지 50㎖를 사용하여 28℃에서 72시간동안 150rpm으로 배양한 후 유리솜 여과를 통하여 배양된 균체를 획득하였다. 획득한 균체를 시험관에 취한 후 사포닌화(Saponification)를 위하여 시약 1(표 3)을 1㎖ 가한 후 30분간 100℃에서 중탕하고 유수에 냉각하였으며, 메틸레이션(methylation)을 위하여 시약 2(표 3)를 2㎖ 가한 후 80℃에서 10분간 반응시키고 유수에 냉각하였다. 추출을 위하여 시약 3(표 3)을 1.25㎖ 가한 후 10분간상온에서 천천히 진탕한 후 상층액을 새로운 시험관으로 옮겼으며, 세척은 시약 4(표 3)를 3㎖ 가하여 5분간 천천히 진탕하였고, 층 분리를 위하여 포화 염화나트륨 용액 500㎕를 가하였다. 분리된 상등액을 취하여 분석용 시료로 사용하였으며, 이 시료는 GC를 사용하여 분석 후 균주 동정 프로그램인 셜록(Sherlock, MIDI사)을 통하여 분석하였다.

균체의 총 지방산은 세포 지질의 필수 구성성분으로 10 내지 24개 정도의 탄화수소로 이루어져 있고, 그들의 길이, 이중결합의 위치, 치환기 등에 따라 다양한 형태로 존재하기 때문에 미생물의 분류에 중요한 기준이 되고 있다. MORI 균의 세포내 지방산 구조를 확인한 결과, 주 지방산은 이소(iso-) 및 안테이소(anteiso)-가지형(branched) 구조가 많이 함유되어 있음을 알 수 있었다(도 5, 6 및 표 3 참조).

총지방산 조성분석의 시약조성

시 약	조 성
시약 1 (사포닌화)	45 g 수산화나트륨150 ㎖ 메탄올150 ㎖ 이온 제거된 증류수
시약 2 (메틸화)	325 ㎖ 6N 염산275 ㎖ 메탄올
시약 3 (추출)	200 ㎖ 헥산200 ㎖ 메틸-tert부틸 에테르
시약 4 (염기 세척)	10.8 g 수산화나트륨150 ㎖ 이온 제거된 증류수

실험예 9. 퀴논 분석

균주의 퀴논 분석을 하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

균체를 배양하고 원심분리(5,000rpm ×20분)하여 회수한 후, 50mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였으며, 수집된 균체는 추출용매 (클로로포름: 메탄올=2:1) 20㎖로 10분간 교반하여 여과후 농축과정을 3번 반복하였다. 농축된 시료는 핵산 2㎖과 물 2㎖로 용해하여, 핵산층을 분리하여 농축하는 과정을 3번 반복한 후, 최종 농축시료를 소량의 아세톤으로 용해하였다. 용해된 시료는 TLC(Merck사, Kiesel-gel 60 F254)에서 전개용매(헥산:디에틸에테르=85:15)로 전개하여 자외선 분석기(Ultraviolet transilluminator)로 전개부분을 확인하였으며, 이 전개 부분을 긁어내어 소량의 아세톤으로 용해하고 원심분리(5,000rpm ×10분)하여 상등액을 모으는 과정을 3번 반복하였다. 모은 상등액은 질소가스로 농축하여 HPLC 분석시료로 사용하였다. HPLC 분석조건으로 컬럼은 스페리솝(Spherisorb 5㎛ ODS2, Waters, 4.6 ×250㎜), 용매 조성은 우비퀴논분석에는 메탄올:이소프로필에테르(3:1), 메나퀴논 분석에는 메탄올:이소프로필 에테르(4:1)를 사용하였고, 용출 속도는 1㎖/분으로 하였으며, 검출은 자외선 검출기를 사용하였고, 우비퀴논은 275nm, 메나퀴논은 270nm에서 검출하였으다. 표준시료로는 우비퀴논 계열은 시그마사에서 구입하였고, 메나퀴논계열은 표준 균주를 배양하여 시료와 동일한 방법으로 추출하여 사용하였다.

실험 결과, 바실러스 속의 균은 이소 프레노이드 퀴논은 다른 그람양성 세균에도 존재하는 메나퀴논을 함유하였으며, MORI 균의 퀴논 화합물 주된 구조는 18분대에서 메나퀴논-7 구조를 갖는 것으로 확인되었다(도 7 참조).

실험예 10. 16s rDNA 염기 서열 분석

균주의 염기 서열 분석을 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

위자드 게놈믹 DNA 준비기구(Wizard Genomic DNA Prep Kit, Promega사, 미국)를 사용하여 지놈 DNA를 준비한 후, 다중체인 반응기(PCR, Minicycler, MJ Research사)를 변성 94℃/1분, 식힘 60℃/1분 30초, 증대 72℃/1분의 조건으로 수행하고, 프라이머는 27F(5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492r (5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT)를 사용하여 총 30회를 거친 다음 pGEM T 이지 벡터(pGEM T Easy Vector, Promega사)에 삽입하여 형질전환하였다. X-갈(X-gal)을 함유한 배지에 도말하여 흰색의 콜로니를 분리하고 플라스미드를 분리한 후, 자동화된 DNA 분석기(ABI3700, Applied Biosystems사)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 이 후 클러스탈 엑스 소프트웨어(Clustal X software, NCBI, 미국)를 사용하여 염기서열을 조합 및 검색(Advanced Blast search)을 통하여 진뱅크(Genebank)의 염기서열과 비교하였고, 덴드로그램(dendrogram)은 네이버 조이닝 분석(neighbor-joining analysis)에 의하여 작성하였다.

실험 결과, MORI 균은 바실러스 서브틸리스 균과 98% 이상의 동질성이 있는 신규 미생물임을 확인하여(염기서열 1 및 도 8 참조), 바실러스 서브틸리스 MORI로 명명하였다.

실험예 11. 전자현미경 관찰

주사전자현미경을 통해 균의 모양을 하기와 같이 관찰하였다.

전자현미경관찰을 위한 시료의 전 처리는 수세, 고정, 건조, 이온 코팅 등의 4단계로 실시하였다. 먼저 YM(Difco사) 한천 배지에서 2일간 배양한 콜로니를 백금니로 따서 멸균수를 이용하여 3회 세척하였으며, 25% 글루타알데히드 (glutaraldehyde) 5㎖을 넣어 12시간동안 4℃에서 고정하였다. 고정이 완료된 균체는 0.1M 인산완충액(pH 6.0)을 이용하여 3회 수세한 후, 균체만을 회수하여 커버 그라스에 얇게 편 후 동결건조기(Tokyo Kikakikai사, 일본)를 이용하여 3시간동안 건조시킨 후 금코팅하여 전자현미경으로 관찰하였다(도 9 참조).

실험예 12. 1-데옥시노지리마이신 및 폴리히드록실레이티드 알칼로이드 (Polyhydroxylated alkaloids)의 정제

바실러스 서브틸리스 MORI에서 생산된 1-데옥시노지리마이신 및 알칼로이드를 정제하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

50ℓ의 발효기에 2.5% 전분, 1% 옥수수액침, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 대두가루, 0.5% 인산칼륨, 0.1% 황산철(pH 7.5)의 조성으로 30ℓ의 배양액을 제조한 후, 멸균하여 종균 1ℓ를 접종하여 37℃에서 교반속도 230rpm, 통기량 0.3vvm으로 유지하면서 5일간 배양하였다. 배양 완료 후 회수된 배양액을 감압농축하고 원심분리(10,000rpm ×20분)하여 균체 및 단백질 성분을 제거한 다음, 이온교환 수지를 이용하여 정제를 실시하였다. 4 종류의 이온교환수지방법을 이용하여 바실러스 서브틸리스 MORI 배양액 내의 1-데옥시노지리마이신 및 알칼로이드 물질들을 분리하였다. 배양액 20ℓ를 앰버리스트(Amberlyst 15, 10×90㎝, H⁺형)에 흡착하여 0.5N 암모니아수로 용출 후 감압 농축하여 50g의 분획(1)을 얻었다. 이 분획(1) 30g을 앰버라이트(Amberlite CG-50, 4×70㎝, NH₃ ⁺형)에 흡착한 후, 증류수로 용출하였다. 새로운 분획을 분리한 결과 분획(2)을 얻고, 0.5N 암모니아수로 용출하여 1-데옥시노지리마이신이 89.6%의 순도로 분리되어 있었다.

또한, 분획(1) 20g를 도엑스(Dowex 1×2-100, 4×70㎝, OH^-형)에 흡착시키고 증류수로 용출한 다음, 앰버라이트(Amberlite CG-50, 2×70㎝, NH₃ ⁺형)에 흡착하고 증류수로 용출한 결과, 1-데옥시노지리마이신이 94%의 순도로 분리되었다.

1-데옥시노지리마이신이 함유되어 있는 분획들을 감압 농축한 시료 2.04g를 도엑스 수지를 이용하여 최종적으로 정제한 결과, 99% 이상의 1-데옥시노지리마이신 1.8g를 수득하였다(도 10 참조).

실험예 13. 효소 활성 테스트

바실러스 서브틸리스 MORI 균중의 배양액에서 분리 및 정제한 1-데옥시노지리마이신의 글루코시다아제 저해활성을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 효소 및 기질은 시그마(Sigma)사에서 구입하였고, 돼지 소장말타아제는 분리한 것을 사용하였다. α-글루코시다아제와 돼지 소장 말타아제는 12mM의p-니트로페닐-α-D-글루코피라노시드, β-글루코시다아제는 12mMp-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드, β-갈락토시다아제는 18mMp-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드를 각각 기질로 사용하여 각 효소의 최적 pH와 온도에서 저해제 농도별로 첨가하여 45분 동안 반응시킨 후, 200mM 탄산나트륨으로 반응을 정지시켰다. 생성된p-니트로페놀량은 405㎚에서 측정하여 1분 동안 1μM의p-니트로페놀을 생성하는 역가를 1 효소 단위로 정의하였으며, 효소의 역가가 50% 저해된 저해제의 농도를 EC₅₀으로 정의 하였다.

바실러스 서브틸리스 MORI 균주의 배양액에서 분리 및 정제한 1-데옥시노지리마이신에 대한 α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, β-갈락토시다아제 및 돼지소장 말타아제에 대한 저해 농도를 실험한 결과, α-글루코시다아제와 소장 말타아제에 대해 강한 저해 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(표 4 참조).

	α-글루코시다아제 (EC50)	β-글루코시다아제(EC50)	β-갈락토시다아제(EC50)	말타아제(EC50)
데옥시노지리마이신의 양	2×10-5M(3.26ppm)	2×10-3M(326ppm)	NI	2×10-6M(0.326ppm)

실험예 14. 독성 실험

1. 경구투여

ICR계 마우스와 스프라그 도올리(Sprague Dawley)를 각각 10마리씩 4군으로나누어 본 발명의 1-데옥시노지리마이신을 각각 500, 725, 1000 및 5000㎎/㎏의 용량으로 경구투여한 후, 2주간 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

2. 복강투여

ICR계 마우스(몸무게 25±5g)와 스프라그 도올리를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 1-데옥시노지리마이신을 각각 25, 250, 500 및 725 ㎎/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

실험 결과, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 MORI 및 그에 의해 생산된 1-데옥시노지리마이신은 급성독성이 거의 없으며, 안전하다는 것을 확인하였다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스 MORI 및 그에 생산되는 1-데옥시노지리마이신은 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

1. 산제의 제조

1-데옥시노지리마이신 100mg

옥수수전분 100mg

유 당 100mg

탈 크 10mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀 포에 충진하여 산제를 제조한다.

2. 정제의 제조

1-데옥시노지리마이신 100mg

옥수수전분 100mg

유 당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분들을 혼합한후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

3. 캡슐제의 제조

1-데옥시노지리마이신 100mg

유 당 50mg

스테아린산 마그네슘 1mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 타정하여 젤라틴 캡슐제에 충진하여 제조한다.

4. 액제의 제조

1-데옥시노지리마이신 100mg

이성화당 10g

서 당 10g

레몬향 적량

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라서 정제수에 각각의 성분을 가하고 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체를 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜서 액제를 제조한다.

제제예 5. 건강 식품의 제조

1-데옥시노지리마이신 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁0.13 ㎎

비타민 B₂0.15 ㎎

비타민 B₆0.5 ㎎

비타민 B₁₂0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

1-데옥시노지리마이신 1000 ㎎

강활 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

제제예 7. 사료첨가제 제조 (1)

바실러스 서브틸리스 MORI 균을 1.5% 전분, 1.0% 포도당, 0.5% 대두가루, 0.3% 효모추출물이 함유된 액상배지에서 40℃, 150rpm의 조건으로 3 내지 7일간, 바람직하게는 5일간 배양하였다. 배양이 끝난 배양액은 다시 멸균 대두박과 혼합하여 40℃에서 2 내지 5일간, 바람직하게는 3일간 고체배양한 다음 45℃에서 열풍건조하였다.

제제예 8. 사료첨가제 제조 (2)

바실러스 서브틸리스 MORI 균을 1.5% 전분, 1.0% 포도당, 0.5% 대두가루, 0.3% 효모추출물이 함유된 액상배지에서 40℃, 150rpm의 조건으로 3 내지 7일간, 바람직하게는 5일간 배양하였다. 배양이 끝난 배양액을 투입온도 150℃, 배출온도 120℃의 조건에서 분사건조하여 1-데옥시노지리마이신이 유효성분으로 함유된 사료첨가제를 완성하였으며 상기 유효성분의 함량이 0.5 내지 7g/㎏ 이었다.

제제예 9. 1-데옥시노지리마이신 함유 식품 제조 (1)

바실러스 서브틸리스 MORI 균을 1.0% 포도당, 0.5% 대두가루, 0.3% 효모추출물이 함유된 액상배지에서 40℃, 150rpm의 조건으로 2 내지 4일간, 바람직하게는 3일간 배양한 후, 수분 50 내지 60%의 멸균대두에 5% 농도로 접종하여 40℃에서 5일간 고체배양하였다. 고체발효가 끝난 배양물을 그대로 분쇄하여 식품 또는 식품첨가제를 완성하였으며, 1-데옥시노지리마이신의 함량이 0.3 내지 4g/㎏이었다.

제제예 10. 1-데옥시노지리마이신 함유 식품 제조 (2)

바실러스 서브틸리스 MORI 균을 1.0% 포도당, 0.5% 대두가루, 0.3% 효모추출물이 함유된 액상배지에서 40℃, 150rpm의 조건으로 2 내지 4일간, 바람직하게는 3일간 배양한 후, 수분 50 내지 60%의 멸균대두에 5% 농도로 접종하여 40℃에서 5일간 고체배양하였다. 고체발효가 끝난 배양물을 45 내지 50℃에서 열풍건조한 다음 분쇄하여, 식품 또는 식품첨가제를 완성하였으며 1-데옥시노지리마이신의 함량이 0.3 내지 4g/㎏이었다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스 MORI 및 그에 의해 생산되는 1-데옥시노지리마이신을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 유용한 신 균주인 바실러스 서브틸리스 MORI는 α-글루코시다아제 및 말타아제를 유의성있게 저해하고, 그에 의해 생산되는 1-데옥시노지리마이신은 탁월한 혈당강하 및 항바이러스 활성을 가짐으로서, 혈당 관련 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용할 수 있으며, 건강 기능 식품 및 사료 조성물로서 유용하다.

<110> BIOTOPIA.CO., LTD. <120> Novel microorganism producing 1-deoxynojirimycin and its composition containing the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1493 <212> DNA <213> Bacillus subtilis MORI <400> 1 agaggtttga tcatggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag 60 cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta 120 acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga tgcttgtttg 180 aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg gacccgcggc 240 gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga 300 gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 360 ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 420 tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct 480 tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540 ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc 600 tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc 660 agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac 720 cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc 780 gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg 840 gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg 900 caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960 attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat cctagagata 1020 ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080 gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag 1140 ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat 1200 catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc 1260 gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa 1320 ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380 ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg 1440 tgaggtaacc ttttaggagc cagccgccga aggtgggaca gatgattggg gtg 1493

Claims (8)

1. 하기의 특성을 가지며, 혈당강하 및 항바이러스 활성을 나타내는 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 것을 특징으로 하는 신규의 바실러스 서브틸리스 모리(Bacillus subtilisMORI) (기탁기관: 한국미생물보존센터, 기탁일: 2002년 12월 02일, 수탁번호: KCCM-10450):

   1) 당이용성에 있어서, L-아라비노스, D-만노스, 솔비톨, N-아세틸글루코사민, 이큘린, 말토즈, 사카로스, 글리코겐, 리보스, 아미그달린, 살리신, 트레할로스, D-라피노스, D-프럭토오스, 만니톨, α-메틸-D-글루코시드, 알부틴, 셀로비오스, 인라인, 아미돈, β-젠티오비오스에 양성;

   2) α-글루코시다아제, β-글루코시다아제 및 말타아제에는 활성이 있으며, β-갈락토시다아에 활성이 없음.
2. 제 1항의 신규한 바실러스 서비틸리스 MORI에 의해 생산되는 1-데옥시노지리마이신을 유효성분으로 포함하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 혈당강하용 약학 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 1-데옥시노지리마이신은 바실러스 서브틸리스 MORI를 배양한 후, 균체를 제거하고 반복적으로 이온 교환 수지를 통과하여 90% 이상 순수하게 정제한 약학조성물.
4. 제 2항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.5 ~ 50 % 중량으로 포함하는 약학 조성물.
5. 제 1항의 신규한 바실러스 서브틸리스 MORI 또는 이에 의해 생산된 1-데옥시노지리마이신을 유효 성분으로 함유하는 사료 첨가제.
6. 제 5항에 있어서, 사료 총 중량에 대하여 상기 첨가제를 0.1 내지 2 %중량으로 포함하는 사료 첨가제.
7. 제 1항의 신규한 바실러스 서브틸리스 MORI 또는 이에 의해 생산된 1-데옥시노지리마이신을 유효성분으로 하고, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를포함하는 건강 기능 식품.
8. 제 7항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 음료 형태인 건강 기능 식품.