CN102796676A - 一株单形拟杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株单形拟杆菌(Bacteroides uniformis Strain-I)及其脱葡萄糖糖基的水解反应活性。本发明提供的单形拟杆菌可水解葡萄糖苷类化学成分而产生相应的苷元，可应用于活性苷元的制备。本发明为从葡萄糖苷类成分、含葡萄糖苷类成分生药及含葡萄糖苷类成分的粗提物中生物转化有活性的苷元类物质提供了一种高效、环保、成本低廉的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一株单形拟杆菌及其应用。
背景技术
胃肠道是细菌的“大仓库”，共生着500～1000种1000万亿个细菌(1×1014)，总重量超过1.5公斤。胃肠道是口服药物的必经通道，肠道菌可以产生多种药物代谢酶，这些代谢酶可以催化药物进行水解反应、氧化还原反应、异构化反应、酯解反应和聚合反应等。其中，水解反应是肠内进行的主要生物转化反应，是由肠内细菌具有的β-葡萄糖苷酶、β-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶和硫酸酯酶等催化完成的。
本发明提供的单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)，分离自人体肠道菌，被证明具有脱葡萄糖糖基的水解反应活性，能够转化亚麻子粕生成苷元开环异落叶松树酯酚(secoisolariciresinol，SECO)。亚麻子粕富含开环异落叶树脂酚二葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside，SDG)。SECO可以经人体肠道菌可继续转化生成肠二醇(enterdiol，END)和肠内酯(enterolactone，ENL)。END和ENL为国际公认的活性最强的植物雌激素类成分，具有植物雌激素样生物学活性和抑制肿瘤、抗氧化、预防和治疗心血管疾病等多方面药理活性，对防治更年期综合征、骨质疏松、心血管疾病、血脂升高、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等症，具有良好的药用价值。
本发明提供的单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)对其他天然产物，如异黄酮苷(大豆苷、染料木苷、黄豆苷)、黄酮苷(异槲皮苷、朝霍苷D)、苯丙素苷(松柏苷)、香豆素苷(瑞香苷七叶苷)、木脂素苷(牛蒡子苷、连翘苷、松脂醇二葡萄糖苷)、蒽醌苷(番泻苷)和环烯醚帖苷(京尼平苷和桃叶珊瑚苷)等化合物也具有脱葡萄糖糖基的转化活性。
发明内容
本发明的目的是提供一株单形拟杆菌及其脱葡萄糖糖基活性的应用。
本发明提供的单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)，分离自中国人的人体肠道内容物，菌株名称为Strain-I，已于2011年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号)，保藏号为CGMCC No.4897。
本发明保护单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)Strain-I CGMCC No.4897在水解葡萄糖苷类化学成分而转化产生相应次级苷或苷元中的应用。
本发明还保护单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)Strain-I CGMCC No.4897对含有葡萄糖苷类成分的生药的生物转化而获取相应次级苷或苷元中的应用。
所述发酵单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)Strain-I CGMCC No.4897所用的培养基可为在无碳源培养基中加入底物得到的培养基；所述底物为亚麻子、海藻、芝麻子粕、黑麦麸、油菜籽粕、小麦麸、大麦麸、玉米麸、燕麦麸和牛蒡子中的至少一种。
所述无碳源培养基可为如下培养基：pH 7-8；每升含有NaCl 2-4g，NH4Cl 0.5-1.5g，KH2PO4 2-3g，K2HPO4 1-2.5g，其余为水。所述无碳源培养基具体可为如下培养基：pH7.5；每升含有NaCl 3g，NH4Cl 1g，KH2PO4 2.6g，K2HPO4 1.85g，其余为水。
所述发酵单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)Strain-I CGMCC No.4897所用的培养基还可为在庖肉培养基中加入底物得到的培养基；所述底物为亚麻子、海藻、芝麻子粕、黑麦麸、油菜籽粕、小麦麸、大麦麸、玉米麸、燕麦麸和牛蒡子中的至少一种。
所述发酵单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)Strain-I CGMCC No.4897所用的培养基中，所述底物的浓度具体可为5-60mg/mL。
所述发酵单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)Strain-I CGMCC No.4897可在缺氧条件下进行。所述发酵单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)Strain-I CGMCC No.4897具体可在氧分压3.03975-10.1325kPa的条件下进行。
所述发酵单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)Strain-I CGMCC No.4897也可在有氧条件下进行。
本发明提供的单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)Strain-I CGMCC No.4897可用于生物转化葡萄糖苷类成分生产次基苷或苷元，而现有技术中，还未见利用单形拟杆菌进行水解反应的报道，本发明为从葡萄糖苷类成分或富含葡萄糖苷类成分生药中生产有活性的苷元类物质一种廉价、环保、高效的新方法，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为不同培养时间混合肠道菌转化亚麻子粕培养液的HPLC图。
图2为稀释菌液在厌氧平板上菌落生长情况。
图3为四种典型菌落转化亚麻子粕的培养液HPLC图。
图4为菌株Strain-I及相关菌株的系统进化树。
图5为不同培养时间Strain-I转化SDG的培养液HPLC色谱图。
图6为可作为底物的不同葡萄糖苷类分子结构式图。
图7为Strain-I亚麻子粕培养液(5mL)中SECO的量-时变化曲线。
图8为Strain-I亚麻子粕培养液(2L)中SECO的量-时变化曲线。
图9为不同培养时间Strain-I厌氧培养和有氧培养的培养液HPLC色谱图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例均设三次重复试验，定量结果取平均值。
以下实施例中所用的无碳源培养基的配制方法如下：
磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS，pH 7.4)制备方法：称取KH2PO426g和K2HPO418.5g溶于1升蒸馏水中，保存于4℃冰箱。
无碳源培养基的的配制方法：称取NaCl 3g、NH4Cl 1g、磷酸缓冲液100mL，混合，蒸馏水定容至1升；调pH为7.5。
实施例1、单形拟杆菌(Strain-I)的分离及鉴定
研究背景：亚麻子(flaxseed；Lini Semen)为亚麻科植物亚麻(Linum usitatissimum L.)的干燥成熟种子。性甘味平，归肺、肝、大肠经。具有润肠通便、养血祛风的功效，临床用于治疗肠燥便秘、皮肤干燥、瘙痒和脱发等症。现代药理学研究结果表明亚麻子具有抗肿瘤(乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、黑色素瘤)、抗氧化、降血糖、降血脂、预防动脉粥样硬化等活性。亚麻子含有丰富的油脂(α-linolenic acid含量为57％)，为重要的油料作物，脱脂后的植物残渣亚麻子粕中富含木脂素类成分，以SDG-3-羟基-3-甲基戊二酸低聚体的含量最高(达1％～4％)。在体内SDG可被人体肠道菌转化为SECO，并进一步转化产生END和ENL。
由于亚麻子中的SDG以低聚体形式存在，用常规化学方法提取SDG或SECO的工艺中将首先需要加入酸或碱水解，工业化生产将污染环境。因此，本研究尝试了采用肠道菌微生物转化的方法来代替传统的化学方法进行获取SECO的发酵工艺研究。
一、亚麻子粕中SDG的含量测定
1、实验方法
精密称取1g亚麻子粕粉末，加入15mL50％乙醇溶液，超声提取30min(功率：400W，温度：40℃)，提取后3000r/min离心15min，取上清液。提取2次，合并两次的提取液，加入1ml 2mol/L NaOH溶液，使其NaOH的浓度为0.25mol/L，室温水解3h，然后用6mol/L的HCl调节pH，使pH值在4～6之间。将溶液加入50mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤后，进液相检测，进样量为20μL。平行测定三份。
2、实验结果：亚麻子粕中SDG的含量为6.7mg/g。
二、肠道菌混合菌种培养
1、培养方法
(1)增菌
配制5mL庖肉培养基(液体)，加入1mL液体石蜡，121℃高压灭菌30分钟。另取冻存的人体肠道菌样本0.5mL(该样本分离自中国人的人体肠道内容物)，接种于庖 肉培养基中，厌氧条件下37℃增菌24小时。
(2)接种
配制5mL无碳源培养基，加入亚麻子粕0.5g作为底物，用1ml液体石蜡覆盖，121℃高压灭菌30分钟。接种增菌后的菌液0.5mL于无碳源培养基中，37℃培养。
(3)样本检测
每隔24h取200μL培养液，加入400μL水饱和正丁醇萃取，5000rpm/min离心10分钟，取上清液320μL于离心管中，氮气吹干，加入200μL色谱甲醇，12500rpm/min离心3分钟，取上清液20μL，HPLC检测。检测结果显示：培养液在24h可转化产生SECO，随着培养的进行，发酵液中SECO的含量增加(检测至第8天)(图1)。
三、活性菌的筛选
1、肠道菌混合菌种分离单菌
采用稀释涂平板方法从肠道菌混合菌种中挑选单菌。具体方法如下：
(1)增菌
配制5mL庖肉培养基，加入1mL液体石蜡，121℃高压灭菌30分钟。另取肠道菌混合菌种菌液0.5mL，接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37℃增菌24小时。
(2)挑选单克隆菌落
吸取增菌后菌液10μL，加入90μL0.9％生理盐水10倍梯度稀释，得到101、102...106倍稀释菌液。吸取105、106倍稀释液各10μL，接种环均匀涂布到厌氧琼脂平板上，将平板置于厌氧罐中，37℃培养48h后观察。培养结果表明：接种106稀释菌液的厌氧琼脂平板上菌落生长较好，可分清单个菌落，菌落大小不一，表面观光滑，圆形，湿润，边缘整齐(图2)。根据形态可分为大、中、小、最小四种不同菌落，分别编号为：Strain-I、Strain-II、Strain-III、Strain-IV。挑取四种典型的菌落接种到庖肉培养基中，37℃增菌48h。吸取增菌液500μL接种到含亚麻子粕的无碳源培养基中，37℃培养72h，进行HPLC检测。可见Strain-I能转化产生SECO，而其它菌落未见任何转化产物，因此Strain-I即为SECO活性菌(图3)。
3、Strain-I菌的菌种鉴定
(1)形态鉴定
在37℃、氧分压3.03975-10.1325kPa的缺氧条件下，Strain-I在厌氧琼脂平板培养基上生长良好，呈浅黄色菌落，镜检为革兰阴性菌，无芽胞。
(2)生化鉴定
Strain-I可以发酵乳糖和麦芽糖，并产酸产气。
(3)16S rRNA测序分析
将Strain-I进行16S rRNA测序分析，与Strain-I相似度较高的肠道菌的系统进化 关系树如图4所示。与所测菌株Strain-I的16S rRNA基因匹配程度最高的为Bacteroides uniformis mat-344，与Strain-I匹配度100％；匹配程度为99％的有Bacteroides uniformis JCM 5828、Bacteroides uniformis 23-18、Bacteroides uniformis NB-14、Bacteroides umiformis NB-13。因此，Strain-I初步鉴定为Bacteroides uniformis。
实施例2、Strain-I对SDG的转化作用
一、实验方法
准确称取SDG 5.0mg加入25mL庖肉液体培养基中，121℃高压蒸汽灭菌30min。接入2mL Strain-I增菌液，37℃恒温培养。开始24h内每3小时取样检测，之后每6小时取样分析。平行进行三份实验。
二、实验结果
培养至12h时，培养液中检测到SDG脱去一分子葡萄糖的中间代谢产物S。在15h的时候，培养液中有SECO产生。随着培养的继续进行，培养液中SECO的量逐渐增加，在36h时，培养液中的SDG完全转化为SECO，同时中间代谢产物S也检测不到。最后SDG的转化率为82.3±3.4％，见图5。
实施例3、Strain-I对不同葡萄糖苷类成分的转化活性
一、不同葡萄糖苷类底物选择
大豆苷、染料木苷、异槲皮苷、虎杖苷、牛蒡子苷、连翘苷、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷购自中国食品药品检定研究院，HPLC检测纯度90％以上。瑞香苷由中国药科大学植物化学教研室提供，HPLC检测其纯度为90％以上。七叶苷购买自国药集团化学试剂有限公司，HPLC检测其纯度为80％以上。番泻苷购买自成都曼思特生物制品有限公司，HPLC检测其纯度为98％以上。桃叶珊瑚苷购自上海顺勃生物工程技术有限公司，HPLC检测其纯度为98％以上。
黄豆苷分离自大豆提取物，为大豆经丙酮提取和无水乙醇结晶后，用Sephadex LH-20分离得到，HPLC检测纯度90％以上。朝霍苷D分离自朝鲜淫羊藿地上部分提取物，经溶剂法、色谱法获得HPLC检测纯度为90％以上。松柏苷分离自筒鞘蛇菰提取物，经溶剂法、色谱法获得，HPLC检测纯度为90％以上。
不同葡萄糖苷类分子结构式见图6。
二、实验方法
1、增菌
配制500mL体系的庖肉培养基，覆盖50mL液体石蜡，121℃高压灭菌30分钟。取冻存的Strain-I样本1mL，接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37℃增菌24小时。
2、接种
在无碳源培养基(2L)中分别加入不同的底物(20mg/mL)，用液体石蜡覆盖，121℃高压灭菌30分钟；以体积比1∶10分别接种增菌后的Strain-I菌液，37℃培养。
3、检测
每隔24h取200μL培养液，加入400μL水饱和正丁醇萃取，5000rpm/min离心10分钟，取上清液320μL于离心管中，氮气吹干，加入200μL色谱甲醇，12500rpm/min离心3分钟，取上清液20μL，HPLC检测。
三、检测结果
不同底物的12-48hr培养液中均可检测到苷元(见表1)。
表1不同时间点不同底物培养液中苷元的HPLC峰面积
实施例4、Strain-I转化亚麻籽粕产生SECO的量-时变化规律(5mL体系)
一、制作SECO标准曲线
精密称定5.28mg SECO对照品，加入5mL容量瓶中，甲醇稀释到刻度，配成264.0μg/mL对照品母液。将对照品母液逐级稀释，分别得到浓度为264.0～2.50μg/mL的对照品溶液。吸取上述溶液分别进样20μL，进行HPLC分析。以SDG峰面积(Y)对SDG进样量(X，μg/mL)进行线性回归计算，得回归方程：Y＝14.25X+7.515(R2＝0.9999)，线性范围为2.50～264.0μg/mL。定量限(S/N＝10)为0.33μg/mL；检测限(S/N＝3)为0.66μg/mL。
二、培养条件
1、增菌
配制5mL庖肉培养基，覆盖1mL液体石蜡，121℃高压灭菌30分钟。另取冻存Strain-I样本0.5mL，接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37℃增菌24小时。
2、接种
配制5mL无碳源培养基，加入亚麻子粕0.5g作为底物，用1ml液体石蜡覆盖，121℃高压灭菌30分钟。接种增菌后的菌液0.5mL于无碳源培养基中，37℃培养。
3、检测
在第一个24h内每隔3h取样一次，之后每24h取样一次，取200μL培养液，加入400μL水饱和正丁醇萃取，5000rpm/min离心10分钟，取上清液320μL于离心管中，氮气吹干，加入200μL色谱甲醇，12500rpm/min离心3分钟，取上清液20μL，HPLC检测。
三、培养结果
培养9h后，培养液中首次检测到少量的SECO，随后SECO的量快速增加。到24h时，培养液中SECO的含量达到29.2±1.1mg/L。随着培养的进行，SECO含量逐渐增加，在7天后达到峰值48.3±1.4mg/L。在随后的3天时间里，发酵液中SECO的浓度略有下降但基本维持稳定，见图7。
实施例5、Strain-I转化亚麻籽粕产生SECO的量-时变化规律(2L体系)
一、制作SECO标准曲线
精密称定5.28mg SECO对照品，加入5mL容量瓶中，甲醇稀释到刻度，配成264.0μg/mL对照品母液。将对照品母液逐级稀释，分别得到浓度为264.0～2.50μg/mL的对照品溶液。吸取上述溶液分别进样20μL，进行HPLC分析。以SDG峰面积(Y)对SDG进样量(X，μg/mL)进行线性回归计算，得回归方程：Y＝14.25X+7.515(R2＝0.9999)，线性范围为2.50～264.0μg/mL。定量限(S/N＝10)为0.33μg/mL；检测限(S/N＝3)为0.66μg/mL。
二、培养条件
1、增菌
配制200mL庖肉培养基，覆盖20mL液体石蜡，121℃高压灭菌30分钟。另取冻存Strain-I样本1mL，接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37℃增菌24小时。
2、接种
配制2L无碳源培养基，加入亚麻子粕40g作为底物，覆盖液体石蜡，121℃高压灭菌30分钟。接种增菌后的菌液200mL于无碳源培养基中，37℃培养。
3、检测
在第一个24h内每隔6h取样一次，之后每48h取样一次，取200μL培养液，加入400μL水饱和正丁醇萃取，5000rpm/min离心10分钟，取上清液320μL于离心管中，氮气吹干，加入200μL色谱甲醇，12500rpm/min离心3分钟，取上清液20μL，HPLC检测。
三、培养结果
培养12h后，发酵液中检测到少量的SECO。在最初的24h内，发酵液中SECO的量快速增加。24h时，发酵液中转化产生的SECO的含量达到28.4±3.5mg/L。随着培养时间的延长，SECO含量逐渐增加，在8天后达到峰值56.9±1.2mg/L，见图8。
实施例6、不同氧气条件Strain-I对亚麻子粕的转化作用
一、实验方法
1、增菌
配制500mL体系的庖肉培养基，覆盖50mL液体石蜡，121℃高压灭菌30分钟。取冻存的Strain-I样本1mL，接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37℃增菌24小时。
2、接种
共分为有氧培养①和缺氧培养②两组，分别加入含有亚麻子粕(20mg/mL)的无碳源培养基(2L)中。其中有氧培养组①的培养基不加石蜡油，直接121℃高压灭菌30分钟；缺氧培养组②的培养基用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌30分钟。以体积比1∶10分别接种增菌后的Strain-I菌液，37℃培养。
3、检测
取200μL培养液，加入400μL水饱和正丁醇萃取，5000rpm/min离心10分钟，取上清液320μL于离心管中，氮气吹干，加入200μL色谱甲醇，12500rpm/min离心3分钟，取上清液20μL，HPLC检测。
二、检测结果
分别在缺氧和有氧条件下进行Strain-I转化实验，培养液中转化产物SECO的含量没有差别，见图9。
Claims (10)
1.单形拟杆菌Bacteroides ubiformis Strain-I(CGMCC No.4897)脱葡萄糖糖基水解反应活性的应用。
2.单形拟杆菌Bacteroides uniformis Strain-I(CGMCC No.4897)转化葡萄糖苷类成分产生相应苷元的应用。
3.单形拟杆菌Bacteroides uniformis Strain-I(CGMCC No.4897)转化含葡萄糖苷类成分的生药而产生相应苷元的应用。
4.单形拟杆菌Bacteroides uniformis Strain-I(CGMCC No.4897)转化含葡萄糖苷类成分的粗提物而产生相应苷元的应用。
5.利用单形拟杆菌Bacteroides uniformis Strain-I(CGMCC No.4897)的水解反应活性发酵脱脂亚麻子而获得开环异落叶松树脂酚的应用。
6.利用单形拟杆菌Bacteroides uniformis Strain-I(CGMCC No.4897)的水解反应活性发酵开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(SDG)粗提物而获得开环异落叶松树脂酚的应用。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵单形拟杆菌Bacteroides uniformis Strain-I所用的底物包括：开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(SDG)、大豆苷、染料木苷、黄豆苷、异槲皮苷、朝霍苷D、虎杖苷、松柏苷、瑞香苷、七叶苷、牛蒡子苷、连翘苷、松脂醇二葡萄糖苷、番泻苷、京尼平苷和桃叶珊瑚苷中的任何一种。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵单形拟杆菌Bacteroides uniformis Strain-I(CGMCCNo.4897)所用的底物包括含权利要求7中所述底物的生药中的任何一种。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵单形拟杆菌Bacteroides uniformis Strain-I所用的底物包括含权利要求7中所述底物生药的任何一种粗提物。
10.如权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于：所述单形拟杆菌Bacteroides uniformis Strain-I是在有氧或缺氧条件下进行的。
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| CN104212754A (zh) * | 2013-06-03 | 2014-12-17 | 北京大学 | 一种生产β-D-葡萄糖苷酶的工程菌及其应用 |
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2011
- 2011-05-26 CN CN2011101379806A patent/CN102796676A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121128 |