CN102533892A

CN102533892A - 一种生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法

Info

Publication number: CN102533892A
Application number: CN2010102665891A
Authority: CN
Inventors: 李刚; 孙允武; 朱占军; 马正创; 解芳
Original assignee: QINGHAI GENERAL HEALTH BIO-SCIENCE Co LLC
Current assignee: QINGHAI GENERAL HEALTH BIO-SCIENCE Co LLC
Priority date: 2010-08-24
Filing date: 2010-08-24
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明涉及一种沙棘提取技术，具体地说是涉及一种沙棘叶中提取沙棘黄酮的生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法。本发明一种生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法包括如下步骤：1)酶法生物转化精提沙棘总黄酮步骤；2)酶法转化沙棘总叶黄酮制备三羟基苯并吡喃-4-酮步骤；3)三羟基苯并吡喃-4-酮分离纯化步骤。本方法提高了黄酮的得率，同时对沙棘粗黄酮进行酶处理，利用葡萄糖苷酶使糖苷型黄酮转化为活性高的苷元型物质。

Description

一种生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法

技术领域

本发明涉及一种沙棘提取技术，具体地说是涉及一种沙棘叶中提取沙棘黄酮的生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法。

背景技术

沙棘是一种集医疗保健功能和生态环境改善功能为一体的具有极高使用价值的树种，其果实、叶和茎皮中含有280多种化学成份，在绿色食品开发、医疗保健、疾病防治以及环境保护等方面都有良好的应用前景。

黄酮类化合物是沙棘最重要的功能活性成分之一。对于黄酮类物质，在沙棘的果实和叶中都存在，但是叶中的黄酮要多得多，而且活性更好的苷元型黄酮的量要更多。黄酮类物质是色原酮或色原烷的衍生物，以C6-C3-C6结构为基本母核的天然产物，即两个苯环通过3个碳原子结合而成。其中C3部分可以是脂链，或与C6部分形成六元或五元氧杂环。黄酮类物质主要由花色素、黄酮醇、黄酮、儿茶酚和黄烷酮组成，其中以黄酮醇类最为常见，其次是黄酮类，其余则较少见。多具有颜色。这些黄酮糖苷类物质的结构又包括苷和苷元两类，植物界中的黄酮类化合物大部分以糖苷的形式存在，一部分以游离苷元形式存在。由沙棘果和叶中提取的沙棘黄酮(酚类化合物)是许多化合物的总称，其中包括主要三羟基苯并吡喃-4-酮，山柰黄酮醇，五羟基-2-苯基苯并-4-吡喃酮，六羟基2，3双氢黄酮醇和三羟基黄酮等，构成苷类的糖有：葡萄糖、异鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖，其存在形式为上述配基的糖苷。这些物质对减少器质性病变，诸如癌症、动脉硬化的发病率起到了重要作用。通过系统研究发现沙棘的叶子和果实中，几乎所有的沙棘黄酮都是由三羟基苯并吡喃-4-酮、山柰黄酮醇，五羟基-2-苯基苯并-4-吡喃酮，六羟基2，3双氢黄酮醇和三羟基黄酮这四种主要的苷元物质和各种糖组成的糖苷型黄酮类化合物，游离的黄酮苷元很少。这种糖苷型的结构使黄酮类化合物很稳定，不易受环境影响而降解。自然界很多植物中的黄酮类化合物如大豆异黄酮，银杏叶黄酮，竹叶黄酮等都是以这种糖苷型存在的。从动物体对黄酮的吸收率来看，黄酮在动物体内的代谢途径不相同，黄酮苷元可以直接被吸收进入动物血液中，黄酮苷元比黄酮糖苷具有更高的生物利用率。目前对于沙棘黄酮的需求逐渐增加，特别是沙棘黄酮中的主要成分三羟基苯并吡喃-4-酮，但是普通沙棘黄酮不能完全满足医药中间体方面需要，特别是活性方面还存在很大的不足，因此利用生物转化方法，提升沙棘黄酮中主要有效成分三羟基苯并吡喃-4-酮的含量成为十分迫切需要解决的问题。

目前黄酮在医药上应用日益广泛，尤其是沙棘黄酮的功效越来越受到重视。很多研究机构和公司纷纷开始投入资金进行沙棘黄酮深入开发研究。但是到目前为止大部分工作仅仅限于沙棘黄酮的常规提取，利用生物转化的方法，提升沙棘黄酮的功效及生产研究未见报道。国内其他类似提取制备沙棘黄酮的项目多采用普通的溶剂直接提取，传统的提取制备方法提取率不高，环境污染严重，制备的黄酮活性也比较低，国内生物转化普遍使用酶直接反应，这样不但造成酶的大量浪费，而且给后期分离纯化带来了很大问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，提供一种生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法。

本发明一种生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法通过下述技术方案予以实现：本发明一种生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：

1)酶法生物转化精提沙棘总黄酮步骤

选用合适的微生物对沙棘叶进行发酵处理；用半纤维素酶的生产菌株，生产所需要的专一性分离转化三羟基苯并吡喃-4-酮的酶，对沙棘总黄酮进行精提；利用微生物产生的各种酶充分分解沙棘叶细胞壁，提高沙棘总黄酮的提取率；对沙棘叶总黄酮的微生物转化方法进行优化组合，获得最大产率；

2)酶法转化沙棘总叶黄酮制备三羟基苯并吡喃-4-酮步骤

(a)L2001β-木聚糖酶：液体发酵链霉菌L2001发酵条件：农业废弃物复合碳源3％，酵母浸膏0.5％，蛋白胨1.0％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.60％，磷酸氢二钾0.15，40℃条件下140r/min培养，产生的耐热β-木聚糖酶2000U/ml以上；菌株产酶周期6d；

(b)LM-9β-葡萄糖苷酶：固体发酵米曲霉LM-9发酵条件：麸皮与农业废弃物复合碳源组分比为2∶3，蛋白胨添加量为培养基干料的1％。营养盐溶液(％)：硫酸镁0.13％，磷酸氢二钾6.5％，硫酸亚铁0.001％，硝酸钠0.2％，自然pH；料水比1∶4，30℃条件下培养，生产的β-葡萄糖苷酶2000U以上；菌株产酶周期6d；

(c)酶的固定化

酶转化条件：

①、L2001木聚糖酶20U，料水比1∶10，温度65℃，pH值5.8，作用时间1h，酶得率68％以上；

②、LM-9葡萄糖苷酶10U，料水比1∶8，温度60℃，pH值5.2，作用时间2h，酶得率68％以上；

③、将L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶共同作用，料水比1∶8，温度60℃，pH值5.2，作用时间2h，沙棘叶黄酮转化率达65％以上；

3)三羟基苯并吡喃-4-酮分离纯化步骤

沙棘总黄酮经过L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶固定化酶处理后得到三羟基苯并吡喃-4-酮，并对其进行分离纯化，过滤获得澄清液体，进行大孔树脂吸附解吸，然后进行凝缩喷雾干燥获得成品。

本发明一种生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法与现有技术相比较有如下有益效果：本发明选用的半纤维素酶是通过链霉菌L2001液体发酵产生，其中β-木聚糖酶2000U/ml以上；而目前国内外研究者报道的链霉菌产酶发酵水平在1500U/ml左右，本发明方法发酵链霉菌产酶的生产技术处于领先地位。本方法提高了黄酮的得率，同时对沙棘粗黄酮进行酶处理，利用葡萄糖苷酶使糖苷型黄酮转化为活性高的苷元型物质。

本发明方法采用沙棘叶作为提取原料，生产原料为沙棘叶，原料充足、价廉，同时符合国家资源节约和环境保护要求。因此比沙棘果和种子提取黄酮能大幅度降低成本，提高生产效率，具有明显的市场竞争力。本项目利用自主开发的高效固定化技术对酶进行固定化处理，可以连续生产，节约成本，使后期的活性黄酮回收成本低，纯度增加，所以能够保证高产稳产，减少了溶剂的用量。

利用生物转化方法来制备沙棘三羟基苯并吡喃-4-酮，可以满足不断增长的市场需求，加快我国利用生物转化来制备植物活性成分的工业化进程。

附图说明

图1为本发明一种生物转化沙棘叶黄酮高活性苯并吡喃4酮的方法工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明一种生物转化沙棘叶黄酮高活性苯并吡喃4酮的方法技术方案作进一步描述。

如图1所示，本发明一种生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法包括如下步骤：

1)酶法生物转化精提沙棘总黄酮步骤

2)酶法转化沙棘总叶黄酮制备三羟基苯并吡喃-4-酮步骤

(c)酶的固定化

酶转化条件：

3)三羟基苯并吡喃-4-酮分离纯化步骤

所述的农业废弃物碳源为玉米芯。

所述的选用合适的微生物是指酵母菌。

所述的利用微生物产生的各种酶指β-木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。

所述的农业废弃物碳源是指玉米芯、玉米秸秆、稻麸皮、麦麸皮中的任一种。

实施例1。

本发明一种生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法包括如下步骤：

1)酶法生物转化精提沙棘总黄酮步骤

2)酶法转化沙棘总叶黄酮制备三羟基苯并吡喃-4-酮步骤

(c)酶的固定化

酶转化条件：

1、L2001木聚糖酶20U，料水比1∶10，温度65℃，pH值5.8，作用时间1h，酶得率68％以上；

2、LM-9葡萄糖苷酶10U，料水比1∶8，温度60℃，pH值5.2，作用时间2h，酶得率68％以上；

3、将L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶共同作用，料水比1∶8，温度60℃，pH值5.2，作用时间2h，沙棘叶黄酮转化率达65％以上；

3)三羟基苯并吡喃-4-酮分离纯化步骤

所述的农业废弃物碳源为玉米芯、玉米秸秆、稻麸皮、麦麸皮等。

本发明方法采用生物转化法制备高活性沙棘黄酮，选择合适的菌种发酵沙棘叶，提高沙棘叶中黄酮的提取率，第二步利用自主产权的酶转化粗提黄酮，使之转化为三羟基苯并吡喃-4-酮。

本发明方法选择链霉菌L2001产生的耐热β-木聚糖酶及米曲霉LM-9生产的β-葡萄糖苷酶，在沙棘叶黄酮提取工艺的基础上，实现糖苷型的沙棘黄酮向苷元型的三羟基苯并吡喃-4-酮的高效转化，且其转化率远远高于同类产品。

本发明方法利用廉价的沙棘叶作为提取制备的原料，替代了以前通常以沙棘果为原料的做法，突破了沙棘三羟基苯并吡喃-4-酮工业化成本过高的瓶颈，提高了沙棘黄酮的质量，降低了沙棘黄酮的价格，必将为沙棘三羟基苯并吡喃-4-酮的应用开辟广阔的空间。

本发明方法采用固定化酶技术，实现生产自动化、连续化，大大降低生产成本，提高生产效率，在后期的分析纯化过程中节约了大量的能源。

Claims

1.一种生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：

1)酶法生物转化精提沙棘总黄酮步骤

2)酶法转化沙棘总叶黄酮制备三羟基苯并吡喃-4-酮步骤

(c)酶的固定化

酶转化条件：

3)三羟基苯并吡喃-4-酮分离纯化步骤

2.根据权利要求1所述的生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于：所述的农业废弃物碳源为玉米芯。

3.根据权利要求1所述的生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于：所述的选用合适的微生物是指酵母菌。

4.根据权利要求1所述的生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于：所述的利用微生物产生的各种酶指β-木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。

5.根据权利要求2所述的生物转化沙棘叶黄酮制备高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于：所述的农业废弃物碳源是指玉米芯、玉米秸秆、稻麸皮、麦麸皮中的任一种。