CN101575575B

CN101575575B - 一株点青霉菌株及其在生物转化桑叶黄酮苷中的应用

Info

Publication number: CN101575575B
Application number: CN2009100281663A
Authority: CN
Inventors: 吴福安; 王俊; 陈明胜; 耿涛; 仇荣; 赵璐璐
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2009-01-20
Filing date: 2009-01-20
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2029-01-20
Also published as: CN101575575A

Abstract

一株点青霉菌株(Penicillium notatum)LJ-2菌株，保藏日期为2008年7月14日，保藏登记号为CGMCC No.2590。点青霉Penicillium notatum LJ-2在生物转化桑叶黄酮苷制备黄酮苷元的应用。

Description

一株点青霉菌株及其在生物转化桑叶黄酮苷中的应用

一、技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株点青霉菌株及其在生物转化桑叶黄酮苷中的应用。

二、背景技术

现有技术：桑树资源的药用在我国历史悠久，将其作为天然药物加以应用非常广泛。我国是桑树的起源中心，桑树的种质类型丰富多样，我国桑属植物有15个种4个变种。国家种质镇江桑树圃现保存有12个桑种、3个变种的各类桑种质1900余份。我国大部分地区均有桑树分布与栽培，全国桑园面积约1000万亩，其中以江苏、浙江、四川等主产区产量最多。桑叶是桑树生物产量最大的部分，在实际蚕桑生产中，往往出现桑叶过剩的情况，这造成资源的极大浪费。若对这些资源加以充分利用，其经济效益与社会效益均相当可观。现代药理研究发现，桑叶提取物在治疗糖尿病、高血压、高血脂等症及抗衰老、抗病毒、抗炎等方面都具有良好的疗效，这与桑叶中的黄酮、多糖和生物碱等有效成分密切相关，其中桑叶黄酮的药理活性最为显著。因此，近年来人们已经开始越来越多地关注到桑叶黄酮资源的综合利用与开发。

桑叶黄酮主要是由槲皮素和山奈酚等为苷元的糖苷类黄酮苷组成。生物利用度研究表明，天然糖苷类的分子结构并不是其活性发挥的最佳形式，苷元才是活性发挥的最佳形式，因为苷元更容易被人体吸收，在人体内具有更高的生物利用度。因此，如果能够在体外将糖苷型桑叶黄酮转变为苷元型黄酮，就可以增强桑叶黄酮的生物活性。虽然在酸性或碱性条件下糖苷键可以断裂，并且反应得率也很高，但在酸或碱性条件下桑叶黄酮苷元的稳定性较差。另外，在强酸或强碱条件下也不易进行工业化生产。由于酶反应有其独特的优势，不仅作用条件温和，而且多采用弱酸性缓冲溶液，桑叶黄酮苷元也不易变性。因此，寻找一种通过微生物转化或酶促水解生产桑叶黄酮苷元的高效、环境友好的工艺方法就显得十分迫切和必要。

目前，对桑叶黄酮苷的提取分离方法报道较多，如CN 1683360、CN101244124公开了采用大孔树脂吸附法分离桑叶黄酮的方法，CN 1762428公开了采用超临界CO₂法从桑叶中提取桑叶黄酮和生物碱，CN 101214279公开了采用超声波辅助萃取法提取桑叶黄酮和多糖的方法；对糖苷酶催化水解的研究则主要还集中在对酶学、催化等性质方面的研究，如CN 1483825公开了采用酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，CN1229086公开了采用酶法水解人参皂苷糖基制备稀有人参皂苷的方法。然而，对于采用微生物或酶法转化桑叶黄酮苷制备高活性苷元的研究未见报道。

虽然现有技术表明微生物能够产生糖苷水解酶，但产量及转化率报道很不稳定，对桑叶黄酮苷转化定向水解生产桑叶黄酮苷元的应用研究缺乏基础数据。若能采用自行设计的快速筛选体系筛选到能水解桑叶黄酮苷的糖苷水解酶生产菌株，高效转化桑叶黄酮苷制备高活性苷元，可应用于工业化生产。因而，制备糖苷水解酶及用该酶定向水解桑叶中黄酮苷来代替化学水解法生产高活性苷元，为其在医药、保健、食品、化妆品等工业上开拓新市场具有十分重要的意义。

三、发明内容

技术问题：本发明针对上述技术缺陷，提供一株点青霉菌株及其在生物转化桑叶黄酮苷中的应用。使得该菌株所产的糖苷水解酶能高效转化桑叶黄酮苷生成高活性苷元。

技术方案：一株点青霉菌株(Penicillium notatum)LJ-2菌株，保藏日期为2008年7月14日，保藏登记号为CGMCC No.2590。点青霉Penicillium notatumLJ-2在生物转化桑叶黄酮苷制备黄酮苷元的应用。点青霉Penicillium notatum LJ-2在生物转化桑叶黄酮苷制备黄酮苷元的应用方法，利用点青霉Penicilliumnotatum LJ-2进行发酵产酶培养生产糖苷水解酶：在温度25～40℃的培养基中接菌，摇瓶培养1～6天得发酵液，所述培养基的pH 5.0～8.0，其质量百分比含量为：磷酸氢二钾0.1％～1.5％、磷酸二氢钾0.1％～1.5％、硫酸铵0.1％～1.5％、硝酸钠0.01％～0.5％、硫酸镁0.01％～0.5％、七水合硫酸亚铁0.001％～0.5％、硫酸锌0.001％～0.5％、蔗糖1～5％；配制质量浓度1％～10％的桑叶黄酮苷溶液，用NaOH或HCl溶液调pH为4.0～9.0，作为酶催化反应底物，向步骤a所得发酵液过滤得到的粗酶液或湿菌体中加入该反应底物溶液，并控制反应体系中的pH为4.0～9.0，在20～55℃条件下，转速100～200r/min，反应时间8～36h，得黄酮苷元。

有益效果：本发明的微生物分类命名为点青霉Penicillium notatum LJ-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏单位地址：中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。保藏编号是：CGMCC No.2590，保藏时间是2008年7月14日。

筛菌过程利用芦丁为唯一碳源建立了新型快速筛选产糖苷水解酶菌株的培养体系和对目的菌株筛选的快速检验方法，结合初筛、复筛过程成功筛选出点青霉Penicillium notatum LJ-2。所筛选到的点青霉Penicillium notatum LJ-2是一种好气性、易培养、产多种复合酶的真菌，生长速度快，繁殖力强，产酶效率高，安全高效，产糖苷水解酶具有生物转化桑叶黄酮苷制备高活性苷元的活性，转化率高。

本发明菌株Penicillium notatum LJ-2系从土壤中分离得到，观察分析了该菌形态特征、培养特征、生理特性及代谢特征，结果表明该菌株具有以下特征：(1)形态学特征：生长迅速，长成的菌落青绿色，正反面颜色不同，菌丝深入培养基，子囊孢子青绿色；显微照片显示其具有典型的青霉“扫把”分生孢子，但是该菌分生孢子比较小，成串珠型，相互交联；(2)培养特征：在以芦丁为唯一碳源的培养基上与在蔗糖培养基上相比，菌落颜色更为鲜绿，有时会达到深绿色，3-5天长出分生孢子，亦为鲜绿色，菌落反面显示龟裂均匀；(3)生理特征：对碳源、氮源及温度有广泛的适应性，易培养；(4)代谢特征：将该菌液体扩大培养后应用HPLC分析发现，其分解芦丁生成异槲皮苷和槲皮素，最终转化为二氧化碳和水，降解芦丁的速度非常迅速。

四、附图说明

图1点青霉Penicillium notatum LJ-2的菌落照片

图2点青霉Penicillium notatum LJ-2的镜检照片

五、具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本实施例说明点青霉Penicillium notatum LJ-2的筛选过程。

采集多处土壤样品，放入50mL无菌水的锥形瓶中，加入20颗左右的玻璃珠，剧烈震荡20min，使泥土完全捣碎，静置。在每只50mL无菌水的三角瓶中加入1mL土壤样品悬浮液，放入恒温震荡培养箱培养，37℃下培养2天。取悬液涂布于初筛平板培养基上，进行产酶菌株的初筛。初筛培养基的质量组成为：磷酸氢二钾1.0％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.1％、硝酸钠0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.005％、硫酸锌0.005％、琼脂5％、pH 6.5，并加入1％芦丁。温度35℃，培养时间1～6天。挑选产生菌落较大的菌株20株，接种到真菌完全培养基斜面培养。

将斜面上生长比较好的菌体转接到产酶液体培养基中，进行产酶菌株的复筛。产酶培养基质量比组成：磷酸氢二钾1.0％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.1％、硝酸钠0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.005％、硫酸锌0.005％、pH6.5，并加入1％芦丁于500mL，三角瓶装液量50mL。摇瓶转速150r/min，温度35℃，培养时间1～6天，取发酵液用HPLC测定芦丁、异槲皮苷和槲皮素浓度评价其产糖苷水解酶的粗酶活力，得到酶活最高的一株菌株，命名为点青霉Penicillium notatum LJ-2。

其中，HPLC法的检测条件为：

色谱柱：Alltima C₁₈(150mm×4.6mm)；流动相：0.5M醋酸铵缓冲液(pH4)-乙腈(85∶15，V/V)；检测波长：360nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

本发明对点青霉Penicillium notatum LJ-2菌株的形态特征、培养特征、生理特性及代谢特征，结果表明该菌株具有以下特征：(1)形态学特征：生长迅速，长成的菌落青绿色，正反面颜色不同，菌丝深入培养基，子囊孢子青绿色；显微照片显示其具有典型的青霉“扫把”分生孢子，但是该菌分生孢子比较小，成串珠型，相互交联；(2)培养特征：在以芦丁为唯一碳源的培养基上与在蔗糖培养基上相比，菌落颜色更为鲜绿，有时会达到深绿色，3-5天长出分生孢子，亦为鲜绿色，菌落反面显示龟裂均匀；(3)生理特征：对碳源、氮源及温度有广泛的适应性，易培养；(4)代谢特征：将该菌液体扩大培养后应用HPLC分析发现，其分解芦丁生成异槲皮苷和槲皮素，最终转化为二氧化碳和水，降解芦丁的速度非常迅速。

实施例2

本实施例说明利用点青霉Penicillium notatum LJ-2进行了发酵产酶培养生产糖苷水解酶及其生物转化桑叶黄酮苷制备高活性苷元的方法。

培养基质量比组成：磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸铵0.1％、硝酸钠0.01％、硫酸镁0.01％、硫酸亚铁0.001％、硫酸锌0.001％、pH 5.0，并加入1％芦丁。

将点青霉Penicillium notatum LJ-2的孢子悬浮液(质量浓度)以1％的接种量接种于培养基中，于温度25℃好气培养1天，即产酶结束。

将桑叶黄酮苷溶解配制成质量浓度1％的溶液，用NaOH或HCl溶液调pH为4.0，作为酶催化反应底物。在发酵液过滤得到的粗酶液或湿菌体中加入该底物溶液，并控制pH为4.0，20℃，转速100r/min，反应培养8h，水解桑叶黄酮苷生成高活性苷元的转化率达16％。

实施例3

本实施例的方法与实施例2相同，改变所用方法参数。

培养基质量比组成：磷酸氢二钾1.0％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.1％、硝酸钠0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.005％、硫酸锌0.005％、pH 6.0。

将点青霉Penicillium notatum LJ-2的孢子悬浮液(质量浓度)以2％的接种量接种于培养基中，于温度35℃好气培养4天，即产酶结束。

将溶解配制成质量浓度为3％的溶液，作为酶催化反应底物。在发酵液过滤得到的粗酶液或湿菌体中加入该底物溶液，并用NaOH或HCl溶液调pH为6.5，35℃，转速150r/min，反应培养24h，水解桑叶黄酮苷生成高活性苷元的转化率达57％。

实施例4

本实施例的方法与实施例2相同，改变所用方法参数。

培养基质量比组成：磷酸氢二钾1.5％、磷酸二氢钾1.5％、硫酸铵1.5％、硝酸钠0.5％、硫酸镁0.5％、硫酸亚铁0.5％、硫酸锌0.5％、pH 8.0。

将点青霉Penicillium notatum LJ-2的孢子悬浮液(质量浓度)以3％的接种量接种于培养基中，于温度40℃好气培养6天，即产酶结束。

将桑叶黄酮苷溶解配制成质量浓度为10％的溶液，用NaOH或HCl溶液调pH为9.0，作为酶催化反应底物。在发酵液过滤得到的粗酶液或湿菌体中加入该底物溶液，并控制pH为9.0，55℃，转速200r/min，反应培养36h，水解桑叶黄酮苷生成高活性苷元的转化率达33％。

Claims

1.一株点青霉菌株(Penicillium notatum)LJ-2菌株，其特征在于：保藏日期为2008年7月14日，保藏登记号为CGMCC No.2590。

2.一种根据权利要求1所述的点青霉Penicillium notatum LJ-2在微生物法转化桑叶黄酮苷制备黄酮苷元的应用。

3.根据权利要求2所述的点青霉Penicillium notatum LJ-2在微生物法转化桑叶黄酮苷制备黄酮苷元的应用，其特征在于：

a.利用点青霉Penicillium notatum LJ-2进行发酵产酶培养生产糖苷水解酶：在温度25～40℃的培养基中接菌，摇瓶培养1～6天得发酵液，所述培养基的pH 5.0～8.0，其质量百分比含量为：磷酸氢二钾0.1％～1.5％、磷酸二氢钾0.1％～1.5％、硫酸铵0.1％～1.5％、硝酸钠0.01％～0.5％、硫酸镁0.01％～0.5％、七水合硫酸亚铁0.001％～0.5％、硫酸锌0.001％～0.5％、蔗糖1～5％；

b.配制质量浓度1％～10％的桑叶黄酮苷溶液，用NaOH或HCl溶液调pH为4.0～9.0，作为酶催化反应底物，向步骤a所得发酵液过滤得到的粗酶液或湿菌体中加入该反应底物溶液，并控制反应体系中的pH为4.0～9.0，在20～55℃条件下，转速100～200r/min，反应时间8～36h，得黄酮苷元。