CN110331151A - 紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法 - Google Patents

紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：（1）设计引物，2)通过PCR扩增紫色红曲菌基因组中的mokH基因；3)将扩增得到的mokH基因连接到pBC‑hygro原核表达载体上，构建pBC‑hygro‑mokH高表达质粒，4)制备红曲菌原生质体，将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，得到mokH过表达菌株。本发明成功的克隆出了紫色红曲菌中的调控基因mokH，将得到的mokH基因在紫色红曲菌中进行过表达，从而探究mokH基因在紫色红曲菌中的功能。通过HPLC检测和潮霉素基因组的扩增，筛选出mokH基因过表达的目的工程菌株。对筛选出的工程菌株次级代谢产物、菌丝体形态及基因表达量进行检测，从而探究mokH基因在紫色红曲菌M1中对代谢、生长及基因表达的作用。

Description

紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法，属于生物基因工程领域。
背景技术：
红曲菌又称“红曲霉”，在真菌分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，不整子囊菌纲，红曲菌科，红曲霉属。红曲菌可以产生多种次级代谢产物，如红曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸和桔霉素等，其中许多代谢产物被广泛的应用于食品色素、医药、酿酒等方面，MonacolinK又称“洛伐他汀”，是红曲菌产生的一种具有生理活性的聚酮类物质。研究发现，MonacolinK具有抑制胆固醇合成中关键酶HMG-CoA活性的作用，能够有效的抑制胆固醇合成，因此，Monacolin K被国内外视为降胆固醇的理想药
由于对红曲菌中次级代谢产物Monacolin K生物合成途径的研究起步较晚，所以很多细节尚未清楚。但由于与土曲霉中Monacolin K的结构相似，因此根据土曲霉中MonacolinK的生物合成途径来推测红曲菌中Monacolin K的生物合成途径。经过研究初步推测，红曲菌中Monacolin K的生物合成基因簇中有9个功能域与土曲霉中Monacolin K生物合成酶基因高度同源，即mokA-mokI。基因过表达技术是分子生物学中十分重要的一项技术，主要是通过将完整的强启动子与目的基因融合，使目的基因能在宿主中进行表达，从而构建过表达载体，通过转化受体菌，获得该目的基因产物大量积累的菌株。曾有相关实验对红曲霉CG-6中的mokE基因进行过表达，最后发现mokE的过表达对红曲霉的菌体生长、孢子形态及生殖方式均有影响。而对于mokH基因在紫色红曲菌中的调节机制，目前未有研究，通过比较，发现mokH基因与lovE基因、mlcR基因具有同源性，因此推测mokH基因在Monacolin K合成过程中起到转录因子的作用，调控特异性途径上的基因，其表达量可能会直接影响其余8段基因的表达，从而影响Monacolin K的合成。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
1) 设计了一对引物mokH-F和mokH-R，具体如下：
mokH-F：5’-GCTCTAGAATGGCCCTATCGCCAGT-3’(XbaI)；
mokH-R：5’-CCCAAGCTTTTAGGAGGCCAGGTTGTGTT-3’(HindIII)；
2) 通过PCR扩增紫色红曲菌基因组中的mokH基因；
3) 将扩增得到的mokH基因连接到pBC-hygro原核表达载体上，构建pBC-Hygro-mokH高表达质粒；
构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用QuickCutClaⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功。
4)制备红曲菌原生质体
（1）将红曲菌M1接种于试管斜面培养基，30 ℃培养7-10 d。
（2）加0.9%无菌生理盐水用接种环轻轻刮菌体表面，释放并收集孢子，制备成均一浓度的孢子悬液（1×108 -1×109个/mL）。
（3）取200 μL均一孢子悬液涂布于铺有玻璃纸的PDA固体培养基上，30 ℃培养36-40 h。
（4）用涂布棒刮取玻璃纸上的菌丝体并收集到500目尼龙布上，用0.6 M MgSO4溶液洗1-2次。
（5）取约0.3 g菌丝体于100 mL三角瓶中，并加入30 mL裂解酶液，于30 ℃，60 r/min酶解2.5 h，然后用500目尼龙布过滤。
（6）滤液于4 ℃，7000 r/min 离心5 min，弃上清。
（7）将收集的原生质体沉淀用1.2 mol/L预冷的山梨醇溶液洗涤2次，然后将其分成2份。一份用预冷的1.2 mol/L山梨醇溶液重悬后，于-80 ℃保存。另一份则用1.2 mol/L山梨醇溶液重悬后置于冰上备用。
5）通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，得到mokH过表达菌株。
本发明的有益效果：
本发明成功的克隆出了紫色红曲菌中的调控基因mokH，将得到的mokH基因在紫色红曲菌中进行过表达，从而探究mokH基因在紫色红曲菌中的功能。
通过HPLC检测和潮霉素基因组的扩增，筛选出mokH基因过表达的目的工程菌株。对筛选出的工程菌株次级代谢产物、菌丝体形态及基因表达量进行检测，从而探究mokH基因在紫色红曲菌M1中对代谢、生长及基因表达的作用。
附图说明：
图1是pBC-hygro-mokH重组质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳图，泳道 1：DL10000 DNAMarker；泳道 2,3：pBC-hygro-mokH+QuickCutClaⅠ+ XbaⅠ。
图2a 红曲菌M1菌株对潮霉素B的耐受浓度，图2b是导入质粒菌株的筛选结果，图中，第一行：M1 菌株；第二行；加入质粒的M1菌株。
图3是 RNA 琼脂糖凝胶电泳图，泳道 1：DL2000 DNA Marker；泳道 2：过表达 H7菌株转录组；泳道 3：紫色红曲菌M1 转录组。
图 4是 H7 菌株潮霉素转录组的 PCR 电泳图，泳道 1：DL2000 DNA Marker；泳道2,3: H7 菌株；泳道 4：M1 菌株。
图5是三种菌株 Monacolin K 产量检测。每组比较中，从左到右以此是M1 菌株、过表达菌株和敲除菌株。
图6是三种菌株色素产量检测，A：红曲红色素；B：红曲橙色素；C：红曲黄色素。每组比较中，从左到右以此是M1 菌株、过表达菌株和敲除菌株。
图7 是mokH基因过表达菌株H7与普通M1菌株在不同倍率下扫描电镜图，A：M1菌株5000×；B：H7菌株5000×；C：M1菌株10000×；D：H7菌株10000×。1：凹陷；2：褶皱。
具体实施方式：
实施例1
本实施例提供一种紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：
1) 设计了一对引物mokH-F和mokH-R，具体如下：
mokH-F：5’-GCTCTAGAATGGCCCTATCGCCAGT-3’(XbaI)。
mokH-R：5’-CCCAAGCTTTTAGGAGGCCAGGTTGTGTT-3’(HindIII)。
2) 通过PCR扩增紫色红曲菌基因组中的mokH基因；
3) 将扩增得到的mokH基因连接到pBC-hygro原核表达载体上，构建pBC-Hygro-mokH高表达质粒；
构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用QuickCutClaⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功。
4)制备红曲菌原生质体，并通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，得到mokH过表达菌株。
实施例2质粒验证
一、重组质粒的验证
构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用QuickCutClaⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证。结果如图1所示，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功。
二、重组质粒的导入及转化子的筛选
制备红曲菌原生质体，并通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，再结合潮霉素 B 浓度筛选浓度结果，筛选导入过表达质粒的转化子。结果如图2a所示，从图中看出，随着潮霉素B浓度的增加，加入质粒和未加入质粒的红曲菌 M1 菌株的菌落数都逐渐减少；当潮霉素B浓度为 10 μg/mL 时，加入质粒的红曲菌 M1 菌株的菌落数明显多于未加入质粒红曲菌 M1 菌株；当潮霉素 B 浓度为 15 μg/mL 时，加入质粒的红曲菌 M1菌株有菌落生长，而未加入质粒的红曲菌 M1 菌株则无菌落生长。因此，挑取潮霉素 B 浓度为 15 μg/mL 抗性板上的菌落，从而成功获得具有潮霉素B 抗性的转化子。
通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，再结合潮霉素 B浓度筛选浓度结果，筛选导入过表达质粒的转化子。结果如图2b所示，从图中看出，随着潮霉素 B 浓度的增加，加入质粒和未加入质粒的红曲菌 M1 菌株的菌落数都逐渐减少；当潮霉素 B 浓度为 10 μg/mL 时，加入质粒的红曲菌 M1 菌株的菌落数明显多于未加入质粒的红曲菌 M1 菌株；当潮霉素 B 浓度为 15 μg/mL 时，加入质粒的红曲菌 M1 菌株有菌落生长，而未加入质粒的红曲菌 M1 菌株则无菌落生长。因此，挑取潮霉素 B 浓度为 15 μg/mL抗性板上的菌落，从而成功获得具有潮霉素 B 抗性的转化子。将获得的转化子在具有潮霉素 B 抗性的平板上传 5 代，再进行发酵培养，对其 Monacolin K 的产量以及潮霉素 B基因组进行测定，以筛选出阳性转化子。
实施例3过表达菌株的验证
一、RNA质量验证
将 M1 菌株在发酵培养基中培养 12 天后，对菌株中的 RNA 进行提取，通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的 RNA 质量，电泳结果如图3所示，有清晰的条带出现，且 28s 条带的亮度是 18s 的2倍，说明 RNA 提取成功，且未降解。然后检测 RNA 的 OD260/280 比值、浓度，RNA 的浓度在 300-500ng/μL之间，OD260/280 比值在 1.8-2.1 之间，说明 RNA 提取成功，且未被污染。综上结果，该 RNA 可以作为反转录扩增的模板，并进行后续实验。
二、过表达菌株 H7潮霉素基因的 PCR验证
通过 HPLC 初步筛选出高产 Monacolin K 的转化子红曲菌株 H7 后，对 H7菌株进行潮霉素基因的 PCR 验证。分别提取红曲菌 M1 菌株和 H7 菌株的 RNA，再将其反转录成cDNA。以 cDNA 为模板，Hygro-F 和Hygro-R 为引物进行扩增潮霉素基因。结果如图 4所示，对照菌株红曲菌 M1 菌株未能扩增出明显条带，而 H7 菌株能扩增出明显条带，说明H7 菌株中成功的导入了过表达质粒，因此说明，mokH过表达菌株构建成功。
三、Monacolin K产量检测
将过表达菌株H7、红曲菌 M1 菌株及mokH基因缺失菌株一起进行摇瓶发酵培养，通过HPLC分别检测两种菌株不同阶段 Monacolin K产量，以观测mokH基因对 Monacolin K 产量的影响。结果如图5所示。由图可知，第 15 d 时，过表达菌株与 M1 菌株相比 MonacolinK 产量提高了 0.82倍，达到了 243.84 mg/L，敲除菌株产量为 84.42 mg/L，降低了 0.37倍。由此推测，mokH基因对紫色红曲菌 Monacolin K 的合成起正调控作用。
四、红曲色素产量检测
通过紫外分光光度计分别检测 2，5，8，12，15 d 的 H7 菌株、M1 菌株及mokH基因缺失菌株的红曲红色素、红曲橙色素和红曲黄色素。结果如图6A-C所示，由图得三种色素的产量变化总体呈现一致性，均是过表达菌株的三种色价低于普通的 M1 菌株和敲除菌株；敲除菌株的色价略高M1菌株。结合Monacolin K 产量检测结果及文献报道推测：由于合成Monacolin K 和红曲色素的前体物质均为乙酰辅酶 A，所以两支路存在竞争关系，因此当Monacolin K 产量增多时，红曲色素的产量会在一定程度上减少；反之，当 Monacolin K产量降低时，红曲色素的产量会相应提高。所以，mokH基因过表达菌株的色素产量最低；mokH基因缺失菌株的色素产量最高。
五、过表达菌株H7微观菌体形态的检测
通过扫描电镜检测H7菌株和M1菌株菌丝体的形态差异，结果如图7所示，对比图A和图B可知，H7菌株的菌丝体与M1菌株相比更为饱满；对比图C和图D可知，H7菌株的菌丝体凹陷程度及褶皱明显多于M1菌株。由此推测，mokH基因的过表达可能会刺激胞内物质分泌到胞外，从而使红曲菌菌丝体的形态发生改变。
序列表
<110> 北京工商大学
<120> 紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctctagaat ggccctatcg ccagt 25
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaagcttt taggaggcca ggttgtgtt 29

Claims (1)

1.紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：
1) 设计了一对引物mokH-F和mokH-R，具体如下：
mokH-F：5’-GCTCTAGAATGGCCCTATCGCCAGT-3’(XbaI)；
mokH-R：5’-CCCAAGCTTTTAGGAGGCCAGGTTGTGTT-3’(HindIII)；
2) 通过PCR扩增紫色红曲菌基因组中的mokH基因；
3) 将扩增得到的mokH基因连接到pBC-hygro原核表达载体上，构建pBC-Hygro-mokH高表达质粒；
构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用QuickCut ClaⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功；
4)制备红曲菌原生质体，并通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，得到mokH过表达菌株；
制备红曲菌原生质体的具体步骤是：
（1）将红曲菌M1接种于试管斜面培养基，30 ℃培养7-10 d；
（2）加0.9%无菌生理盐水用接种环轻轻刮菌体表面，释放并收集孢子，制备成均一浓度的孢子悬液（1×108 -1×109个/mL）；
（3）取200 μL均一孢子悬液涂布于铺有玻璃纸的PDA固体培养基上，30 ℃培养36-40h；
（4）用涂布棒刮取玻璃纸上的菌丝体并收集到500目尼龙布上，用0.6 M MgSO4溶液洗1-2次；
（5）取约0.3 g菌丝体于100 mL三角瓶中，并加入30 mL裂解酶液，于30 ℃，60 r/ min酶解2.5 h，然后用500目尼龙布过滤；
（6）滤液于4 ℃，7000 r/min 离心5 min，弃上清；
（7）将收集的原生质体沉淀用1.2 mol/L预冷的山梨醇溶液洗涤2次，然后将其分成2份；一份用预冷的1.2 mol/L山梨醇溶液重悬后，于-80 ℃保存；另一份则用1.2 mol/L山梨醇溶液重悬后置于冰上备用。
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