CN101139566A - 一种莽草酸生产菌株及其构建方法 - Google Patents
一种莽草酸生产菌株及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101139566A CN101139566A CNA2006100309858A CN200610030985A CN101139566A CN 101139566 A CN101139566 A CN 101139566A CN A2006100309858 A CNA2006100309858 A CN A2006100309858A CN 200610030985 A CN200610030985 A CN 200610030985A CN 101139566 A CN101139566 A CN 101139566A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacterial strain
- arok
- arol
- gene
- shikimic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种莽草酸生产菌株及其构建方法，首先构建了aroL和aroK双基因敲除菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)，并构建了含有莽草酸代谢途径中关键基因aroF、aroE、aroB、ppsa以及tktA基因的重组表达质粒pSUFEBPT，然后将重组表达质粒转入aroL和aroK双基因敲除的菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)中，从而获得莽草酸生产菌株。本发明的莽草酸生产菌株能够实现发酵过程中莽草酸的有效积累，从而为莽草酸生产的产业化奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种莽草酸生产菌株及其构建方法。
背景技术
莽草酸(Shikimic acid)是合成生物体内新陈代谢化合物的中间体，也是合成许多生物碱、芳香氨基酸与吲哚衍生物、手性药物(如抗病毒药)的原料。莽草酸的分子结构中有三个羟基、一个羧基、一个双键，具有手性异构体，它可以成酯，也可以成盐。莽草酸化学名称为3，4，5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，其结构式如下：
达菲(Tamiflu)目前认为是抗H5N1型高致病性禽流感病毒的最有效药物，而莽草酸正是生产达菲的上游关键原料。
目前，莽草酸主要由中国广西生长的中药八角的种子萃取提纯而来。八角含有多种化合物，有的对人体有害。多食八角非但不能医治禽流感，反而会引起身体不适。从八角提取的莽草酸，再经过十几步反应得到的Tamiflu(达菲)才是抗禽流感病毒药。瑞士罗氏制药公司拥有Tamiflu(达菲)生产的专利权，价格非常昂贵。
虽然罗氏公司和日本味之素已经发展出以生物工程手段生产莽草酸的方法，但从提纯、生物活性及成本角度考虑，“达菲”的生产依然主要依赖中国广西八角。目前，莽草酸和八角都已经短缺，价格上涨好几倍，莽草酸每公斤在200～250美元之间，质量特别好的，价格高达每克50美元。
因此，利用葡萄糖甚至更廉价的可再生资源，通过微生物来发酵生产莽草酸，从而开辟新的原料制备途径，是业内所追求的目标。微生物繁殖快、代谢能力强，通过利用其莽草酸代谢途径进行改造，可获得目标产物莽草酸的有效积累，解决达菲制备原料不足的瓶颈。国外一些公司已开展相关研究，但实现产业化还需进一步优化条件。
发明内容
本发明的目的就在于通过基因工程的方法对大肠杆菌的莽草酸合成途径进行改造，从而提供一种莽草酸的生产菌株。
本发明的另一个目的在于提供所述莽草酸生产菌株的构建方法。
本发明的莽草酸生产菌株的构建方法包括以下步骤：
A、构建aroL和aroK双基因敲除的菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)；
B、构建含有莽草酸代谢途径中的关键基因aroF、aroE、aroB、ppsa以及tktA基因的重组表达质粒pSUFEBPT；
C、将重组表达质粒pSUFEBPT转入双敲除菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)获得表达莽草酸的生产菌株。
本发明所构建的莽草酸生产菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)已于2006年9月4日提交位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 206083。
利用本发明所获得的基因工程菌株CCTCC M 206083进行发酵，可以获得目的产物莽草酸的有效积累，从而为莽草酸生产的产业化奠定了基础。
附图说明
图1为单敲除菌株BW25113(ΔaroK)的PCR鉴定结果示意图，显示aroK基因已经被敲除；其中泳道1：野生型BW25113菌株PCR产物(1.3kb)；泳道2-5：ΔaroK-773/BW25113突变株PCR产物(2.1kb)；泳道6：DNA marker。
图2为单敲除菌株BW25113(ΔaroL)的PCR鉴定结果示意图，显示aroL基因已经被敲除；其中泳道1：DNA marker；泳道2-4：ΔaroL-778/BW25113突变株；泳道5：野生型BW25113菌株。
图3为双敲除菌株BW25113(ΔaroLΔaroK)以引物aroL-up和aroL-down进行PCR鉴定的结果示意图，显示aroL基因已经被敲除；其中泳道1：野生型BW25113菌株；泳道2-3：ΔaroL-778/BW25113突变株；泳道4：DNA marker。
图4为双敲除菌株BW25113(ΔaroLΔaroK)以引物aroK-up和aroK-down进行PCR鉴定的结果示意图，显示aroK基因已经被敲除；其中泳道1：DNA marker；泳道2：野生型BW25113菌株；泳道3-6：ΔaroK-773/BW25113突变株。
图5为双敲除菌株W3110(ΔaroLΔaroK)的PCR鉴定结果，显示了aroL和aroK基因均已经被敲除；其中泳道1：W3110中aroK单敲除菌株，验证aroL位点；泳道2：W3110原始菌株，验证aroL位点；泳道3：W3110 aroL/K双敲除菌株，验证aroL位点；泳道4：Marker；泳道5：W3110 aroK单敲除菌株，验证aroK位点；泳道6：w3110原始菌株，验证aroK位点；泳道7：W3110 aroL/K双敲除菌株，验证aroK位点。
图6为重组质粒pSUFEBPT的结构示意图，其中PnaroF表示带有自身启动子的aroF基因，PtrcaroE表示带有trc启动子的aroE基因，PnppaA表示带有自身启动子的ppsA基因。
图7显示了莽草酸生产菌株W3110(ΔaroLΔaroK)在发酵过程中，发酵液中莽草酸含量以及干细胞重量随时间的变化情况。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
根据大肠杆菌中莽草酸的代谢途径，本发明首先构建了aroL和aroK双基因敲除的菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)，以在代谢途径中获得莽草酸的积累；同时构建了含有莽草酸代谢途径中关键基因aroF、aroE、aroB、ppsa以及tktA基因的重组表达质粒pSUFEBPT，以实现莽草酸的过表达，然后将重组表达质粒转入aroL和aroK双基因敲除的菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)中，获得莽草酸的生产菌株W3110(ΔaroLΔaroK)。
本发明所获得的莽草酸生产菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)已于2006年9月4日提交位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 206083。
在一个具体的实施例中，本发明所构建的莽草酸生产菌株CCTCC M 206083经发酵后能够有效实现目的产物莽草酸的积累，从而为莽草酸生产的产业化奠定了基础。
实施例1、双敲除菌株W3110(ΔaroLΔaroK)的构建
1.1、BW25113(E.coli Genetic Stock Center)中aroL和aroK基因的敲除
参考Gust.B.等的文献(PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor，Gust.B.，KieserT.et al，2002)，利用PCR-Targeting方法进行大肠杆菌基因组中aroL和aroK基因的敲除，具体如下：
1.1.1、单敲除菌株BW25113(ΔaroL)的获得
以质粒pIJ773(E.coli Genetic Stock Center)为模板，利用引物aroK-up和aroK-down，PCR扩增质粒pIJ773中的aac(Apra)基因，引物序列如下：
aroK-up：5’-tacgctaatcttacccggtgatttatcgccagagcggtgattccggggatccgtcgacc-3’；
aroK-down：5’-tactgtacccgcagacgagtgtatataaagccagaattatgtaggctggagctgcttc-3’；
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，55℃，45sec，72℃，90sec，30循环。
胶回收PCR产物，借助电击转化(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)将PCR产物转入大肠杆菌BW25113感受态细胞中，于37℃培养2～3小时，将菌液涂布在含有阿普拉霉素(50μg/ml)的平板上，能够长出的转化子就是敲除aroK基因的菌株。
将获得的阳性转化子以引物aroK-up和aroK-down进行PCR鉴定，PCR条件同上。鉴定结果如图1所示，显示了ΔaroK基因已经被敲除。
1.1.2、单敲除菌株BW25113(ΔaroK)的获得
以质粒pIJ778(E.coli Genetic Stock Center)为模板，利用引物aroL-up和aroL-down，PCR扩增质粒pIJ778中的aadA(Spec)基因，引物序列如下：
aroL-up：5’-tttcgccgcattgcgacctattggggaaaacccacgatgattccggggatccgtcgacc-3’；
aroL-down：5’-ttcacgggatgaacgttaagtataggcgctcgaaaatcatgtaggctggagctgcttc-3`；
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，55℃，45sec，72℃，90sec，30循环。
胶回收PCR产物，借助电击转化(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)将PCR产物转入大肠杆菌BW25113感受态细胞中，于37℃培养2～3小时，将菌液涂布在含有壮观霉素(50μg/ml)的平板上，能够长出的转化子就是敲除aroL基因的菌株。
获得的阳性转化子以引物aroL-up和aroL-down进行PCR鉴定，PCR条件同上，鉴定结果如图2所示，显示了ΔaroL基因已经被敲除。
1.2、双敲除菌株BW25113(ΔaroL ΔaroK)的获得
分别以步骤1.1.1和1.1.2获得的单敲除菌株BW25113(ΔaroL)和BW25113(ΔaroK)作为供体和受体，利用P1噬菌体转导方法获得双敲除菌株BW25113(ΔaroLΔaroK)。
P1噬菌体转导方法具体如下：
经过夜培养的BW25113(ΔaroL)供体菌液接种至LB液体培养基中，37℃培养1～2小时至O.D.值约为0.4；取20μl供体菌液，100μl P1噬菌体原液，30μl 0.5M的CaCl2以及3ml半固体LB培养基(含0.7％琼脂糖)，在半固体培养基温度约为50℃时混合，倒在LB培养基上，待培养基凝固后于37℃培养4～6小时。待噬菌体充分增殖后，在平皿里面加入4.5ml LB液体培养基，4℃放过夜，将平皿表面的液体移至5ml EP管，加入几滴氯仿，剧烈来回摇动；离心后，小心地将上清液移至另一试管，加入几滴氯仿，水相即为lysate。将lysate用生理盐水(0.85％NaCl)稀释一倍后置于平皿中，用紫外照射5min。
经过夜培养的BW25113(ΔaroK)受体菌株接种于LB液体培养基上，37℃培养2～3小时；取100μl受体菌液，加入450μl 50mM的CaCl2和10μl lysate，放置37℃温育30min，离心除去上清，加入100μl LB和100μl 1M的柠檬酸钠，将菌液涂布在含有阿普拉霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的平板上，能够长出的转化子就是aroL和aroK已经被双敲除的菌株。
通过以上步骤获得的敲除aroL和aroK双基因的大肠杆菌BW25113(ΔaroLΔaroK)分别以引物aroK-up和aroK-down(PCR条件同1.1.1)以及aroL-up和aroL-down(PCR条件同1.1.2)进行PCR鉴定，鉴定结果分别如图3和4所示，显示了aroL和aroK基因均已被敲除。
1.3、双敲除菌株W3110(ΔaroLΔaroK)的获得
以步骤2.2获得的双敲除菌株BW25113(ΔaroLΔaroK)作为供体，W3110(E.coli GeneticStock Center)作为受体，利用P1噬菌体转导方法(同以上1.2)获得双敲除菌株W3110(ΔaroLΔaroK)。
获得的双敲除菌株W3110(ΔaroLΔaroK)分别以引物aroK-up和aroK-down(PCR条件同2.1.1)以及aroL-up和aroL-down(PCR条件同2.1.2)进行PCR鉴定，鉴定结果如图5所示，显示了aroL和aroK基因已经被敲除。
实施例2、重组质粒pSUFEBPT的构建
2.1、重组质粒pSU-F的克隆
以E.coli DH5α(Amersham公司)的基因组为模板，利用引物P148L(+)、P148L(-)、aroFSac I(+)和aroFSac I(-)进行重叠PCR，扩增E.coli DH5α的aroF基因，引物序列如下：
P148L(+)：5′-ttagatctgaatagcccgcaatacctgggc-3′；
P148L(-)：5′-gctattcagatctaacgcttccgtcgccagtgg-3′；
aroFSac I(+)：5′-aacgagctcaccggaaagtcctcgggcataag-3′；
aroFSac I(-)：5′-aacgagctccgacttcatcaatttgatcgcgtaa-3′；
首先用引物对aroFSac I(+)和P148L(+)扩增出一片段，扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1min，30循环；再用引物对aroFSac I(-)和P148L(-)扩增出另一个片段，扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，1min，72℃，1min，30循环；胶回收上述两个PCR片段，再用引物对aroFSac I(+)和aroFSac I(-)扩增出aroF全长基因：扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，1.5min，72℃，1min，30循环。
PCR结果中已经将E.coli DH5α中的aroF基因148位脯氨酸突变成亮氨酸，克隆得到突变的aroF基因，然后将PCR片断用Sac I酶切后克隆至pSU2718质粒(Martinez，E.，B.Bartolome，and F.de la Cruz.1988.pACYC184-derived cloning vectors containing the multiplecloning site and lacZα reporter gene of pUC8/9 and pUC18/19 plasmids.Gene 68：159-162)，得到重组质粒pSU-F。
2.2、重组质粒pSU-FE的克隆
以E.coli DH5α的基因组为模板，利用引物aroE(Nco)和aroE(Bam)，PCR扩增E.coliDH5α的aroE基因，引物序列如下：
aroE(Nco)：5′-catgccatggaaacctatgctgtttttg-3′；
aroE(Bam)：5′-cgggatcctcacgcggacaattcctcctg-3′；
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1min，30循环。
扩增得到的aroE基因用Nco I和BamH I酶切后，克隆至质粒pTrc99a(Pharmacia公司)，得到重组质粒pTrc-aroE；
以质粒pTrc-aroE为模板，利用引物aroE(BglII)和aroE(Bam)，PCR扩增质粒pTrc-aroE中的aroE基因，引物序列如下：
aroE(BglII)：5′-gaagatctcgacatcataacggttctggc-3′；
aroE(Bam)：5′-cgggatcctcacgcggacaattcctcctg-3′；
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1min，30循环。
扩增得到的aroE基因再以Bgl II和BamH I酶切克隆至载体质粒pSU-F，得到重组质粒pSU-FE。
2.3、重组质粒pSU-FEB的构建
以E.coli DH5α的基因组为模板，利用引物aroB(Nco)和aroB(Sac I)，PCR扩增E.coliDH5α的aroB基因，引物序列如下：
aroB(Nco)：5′-catgccatggatggagaggattgtcg-3′；
aroB(Sal I)：5′-gcgtcgacttacgctgattgacaatc-3′；
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1min，30循环。
扩增得到的aroB基因以Nco I和Sal I酶切后克降至质粒pET28(b)(Novagen公司)，得到重组质粒pET-aroB，再使用Xbal I和Sal I酶切重组质粒pET-aroB，将切下的aroB基因克隆至pSU-FE，得到重组质粒pSU-FEB。
2.4、重组质粒pSU-FEBP的构建
以E.coli DH5α的基因组为模板，利用引物ppsa-3和ppsa-4，PCR扩增E.coli DH5α的ppsa基因，引物序列如下：
ppsa-3：5′-cggaattcaaacgcacagaagcgtagaacg-3′；
ppsa-4：5′-cgggatcccataaccccggcgactaaacgc-3′；
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，57℃，45sec，72℃，2.5min，30循环。
将重组质粒pSU-FEB用HindIII酶切后补平，然后将扩增得到的ppsa基因的平端连接至pSU-FEB，得到重组质粒pSU-FEBP。
2.5、重组质粒pSU-FEBPT的构建
以大肠杆菌K12的基因组为模板，利用引物tktA(Nde)和tktA(BamH I)，PCR扩增大肠杆菌K12的tktA基因，引物序列如下：
tktAF(Nde)：5′-ggaattccatatgtcctcacgtaaagagcttg-3′；
tktAR(BamH I)：5′-cgggatccttacagcagttcttttgctttcg-3′；
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，2min，30循环。
扩增得到的tktA基因以Nde I和BamH I酶切后克隆至pET-24(a)(Novagen公司)中，得到质粒pET-tktA。
以质粒pET-tktA为模板，使用引物tktA(I)和tktA(II)，PCR扩增重组质粒pET-tktA中的tktA基因连同pET24(a)中的RBS位点，引物序列如下：
tktA(I)：5′-catgcatgctctcagtggtggtggtggtg-3′；
tktA(II)：5′-catgcatgcttacagcagttcttttgctttcg-3′；
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，60℃，45sec，72℃，2min，30循环。
扩增产物以Sph I酶切后克隆至质粒pSU-FEBP，得到重组质粒pSUFEBPT，其结构如图6所示，其中pnaroF表示带有自身启动子的aroF基因，ptrcaroE表示带有trc启动子的aroE基因，pnppsa表示带有自身启动子的ppsa基因。
实施例3、莽草酸表达菌株的获得
将实施例1获得的敲除了aroL和aroK基因的大肠杆菌宿主菌W3110(ΔaroLΔaroK)制成感受态细胞，然后用化学转化方法将实施例2获得的重组表达质粒pSUFEBPT转入感受态细胞(具体方法参考分子克隆III)，获得表达莽草酸的大肠杆菌宿主菌W3110(ΔaroLΔaroK)。
以上获得的莽草酸表达菌株W3110(ΔaroLΔaroK)并已于2006年9月4日提交位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M206083。
实施例4、大肠杆菌宿主菌W3110(ΔaroLΔaroK)表达莽草酸
挑取W3110(ΔaroLΔaroK)单菌落接种于含4ml LB培养基的试管中，37℃过夜，然后按1％的接种量转接至含200ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃培养6～8小时，随后按5～8％的接种量转接于5L发酵罐(发酵罐的培养基装量为3L)中进行发酵。
发酵采用低糖补料的方法，温度33℃，用浓氨水自动调pH至7.0，控制溶氧在10～30％。
采用三阶段发酵：起始设置通气量为0.06L/L/min，溶氧浓度通过转速来调整(250～700rpm)；当转速达到700rpm时，进入第二阶段，将通气量设置为1.0L/L/min；当转速再次达到最大值时，进入第三阶段，开始补加葡萄糖(60％)，使罐中的葡萄糖浓度维持在2％左右。
发酵过程中每隔3小时取样，参考周雅璇等的方法(周雅璇等，酶法测定酒中葡萄糖含量，中国卫生检验杂志，2005，15(2)，194-221)测定发酵液中的葡萄糖含量，以控制发酵液中的葡萄糖浓度；同时以HPLC测定其中的莽草酸含量，HPLC的测定条件如下：HPLC(Agilent technologies，1100)，柱子：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm)，流动相组成：1.29％乙酸∶0.115％三乙胺＝39∶61，流速是1ml/min，检测波长240nm。
另外将发酵液样品离心，除去上清发酵液，然后将菌体放在80℃的烘箱蒸干水分，再称重，以计算干细胞的重量。
以发酵时间对莽草酸的含量以及干细胞重量作图，结果如图7所示。由图7的结果可见，从接种时刻开始计时，13.5小时菌体生长进入指数期，30小时进入平台期。从零时刻起莽草酸产量逐步增加，当发酵至128小时时，莽草酸产量达到39.3g/L。
综上所述，本发明所构建的大肠杆菌宿主菌W3110(ΔaroLΔaroK)能够实现发酵过程中莽草酸的有效积累，从而为莽草酸生产的产业化奠定了基础。
Claims (10)
1.一种莽草酸生产菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
A、构建aroL和aroK双基因敲除的菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)；
B、构建含有莽草酸代谢途径中的关键基因aroF、aroE、aroB、ppsa以及tktA基因的重组表达质粒pSUFEBPT；
C、将重组表达质粒pSUFEBPT转入双敲除菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)获得表达莽草酸的生产菌株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A包括：
a、构建aroL单基因敲除的菌株BW25113(ΔaroL)；
b、构建aroK单基因敲除的菌株BW25113(ΔaroK)；
c、分别以BW25113(ΔaroL)和BW25113(ΔaroK)作为供体和受体，通过P1噬菌体转导方法获得aroL和aroK双基因敲除菌株BW25113(ΔaroLΔaroK)；
d、以双敲除菌株BW25113(ΔaroLΔaroK)作为供体，W3110作为受体，利用P1噬菌体转导方法获得双敲除菌株W3110(ΔaroLΔaroK)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B包括依次将aroF、aroE、aroB、ppsa以及tktA基因克隆至pSU2718质粒，获得重组表达质粒pSUFEBPT。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组表达质粒pSUFEBPT所含的aroF基因带有自身启动子。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组表达质粒pSUFEBPT所含的aroE基因带有trc启动子。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组表达质粒pSUFEBPT所含的ppsa基因带有自身启动子。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤C包括将大肠杆菌宿主菌W3110(ΔaroLΔaroK)制成感受态细胞，然后用化学转化方法将重组表达质粒pSUFEBPT转入所述感受态细胞，从而获得莽草酸生产菌株。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法构建的莽草酸生产菌株。
9.如权利要求8所述的莽草酸生产菌株，其特征在于，该菌株的保藏号为CCTCC M206083。
10.一种莽草酸的生产方法，其特征在于，通过发酵培养权利要求8或9的莽草酸生产菌株获得莽草酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2006100309858A CN101139566A (zh) | 2006-09-08 | 2006-09-08 | 一种莽草酸生产菌株及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2006100309858A CN101139566A (zh) | 2006-09-08 | 2006-09-08 | 一种莽草酸生产菌株及其构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101139566A true CN101139566A (zh) | 2008-03-12 |
Family
ID=39191669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2006100309858A Pending CN101139566A (zh) | 2006-09-08 | 2006-09-08 | 一种莽草酸生产菌株及其构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101139566A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102304539A (zh) * | 2011-08-26 | 2012-01-04 | 河南孟成生物药业股份有限公司 | 一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法 |
| CN102994439A (zh) * | 2012-12-12 | 2013-03-27 | 江南大学 | 一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用 |
| CN103930556A (zh) * | 2011-09-07 | 2014-07-16 | 国立大学法人信州大学 | 从丝状菌生产有用代谢产物的方法 |
| CN109423468A (zh) * | 2017-08-24 | 2019-03-05 | 中国科学院微生物研究所 | 提高芳香族氨基酸生物合成途径中的化合物及其衍生物产量的方法 |
| CN111057672A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-24 | 东莞市东阳光生物合成药有限公司 | 重组菌株及其应用 |
| CN112592863A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-02 | 河南巨龙生物工程股份有限公司 | 一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高产酸水平的方法 |
| CN114591880A (zh) * | 2022-03-16 | 2022-06-07 | 江南大学 | 一种可积累莽草酸的大肠杆菌的构建及其应用 |
-
2006
- 2006-09-08 CN CNA2006100309858A patent/CN101139566A/zh active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102304539A (zh) * | 2011-08-26 | 2012-01-04 | 河南孟成生物药业股份有限公司 | 一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法 |
| CN103930556A (zh) * | 2011-09-07 | 2014-07-16 | 国立大学法人信州大学 | 从丝状菌生产有用代谢产物的方法 |
| CN103930556B (zh) * | 2011-09-07 | 2016-03-30 | 国立大学法人信州大学 | 从丝状菌生产有用代谢产物的方法 |
| CN102994439A (zh) * | 2012-12-12 | 2013-03-27 | 江南大学 | 一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用 |
| CN109423468A (zh) * | 2017-08-24 | 2019-03-05 | 中国科学院微生物研究所 | 提高芳香族氨基酸生物合成途径中的化合物及其衍生物产量的方法 |
| CN111057672A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-24 | 东莞市东阳光生物合成药有限公司 | 重组菌株及其应用 |
| CN111057672B (zh) * | 2019-12-20 | 2022-02-15 | 宜昌东阳光生化制药有限公司 | 重组菌株及其应用 |
| CN112592863A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-02 | 河南巨龙生物工程股份有限公司 | 一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高产酸水平的方法 |
| CN114591880A (zh) * | 2022-03-16 | 2022-06-07 | 江南大学 | 一种可积累莽草酸的大肠杆菌的构建及其应用 |
| CN114591880B (zh) * | 2022-03-16 | 2023-10-03 | 江南大学 | 一种可积累莽草酸的大肠杆菌的构建及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101139566A (zh) | 一种莽草酸生产菌株及其构建方法 | |
| MX2010013307A (es) | Metodo de produccion de biomasa de levadura. | |
| CN101307301A (zh) | L-色氨酸基因工程菌及其生产l-色氨酸的方法 | |
| CN104560852B (zh) | 一种l‑苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌 | |
| US20240093247A1 (en) | Genetically engineered strain of zymomonas mobilis and uses thereof | |
| CN109207373A (zh) | 一株高产柠檬酸的微生物菌株及其发酵淀粉糖质生产柠檬酸的方法 | |
| CN103013843A (zh) | 一种高产延胡索酸米根霉工程菌及其应用 | |
| CN116751731A (zh) | 一种大规模质粒生产的发酵工艺 | |
| CN116179571A (zh) | 通过改造林可链霉菌slcg_2185基因提高林可霉素产量的方法及应用 | |
| CN107058144A (zh) | 一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用 | |
| CN117721135A (zh) | 一种表达α-淀粉酶的重组菌株及其构建方法和应用 | |
| CN116555054B (zh) | 一株高产dha的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用 | |
| CN101613707B (zh) | 一种用代谢工程菌生产谷胱甘肽的方法 | |
| CN103215198B (zh) | 利用重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法 | |
| CN105062938A (zh) | 一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产d-乳酸的工程菌及其构建和应用 | |
| CN104845926A (zh) | 一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌及其应用 | |
| CN102559518B (zh) | 一种高产延胡索酸米根霉及其应用 | |
| CN111484942A (zh) | 一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法 | |
| CN104204206A (zh) | 一种用于生产丁醇的方法 | |
| CN113969288B (zh) | 一种产法尼醇基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN113832087B (zh) | 一种利用大肠杆菌全生物合成丙二酸的方法 | |
| CN103087950A (zh) | 一株高产丙酮酸的大肠杆菌菌株的构建及应用 | |
| CN112779174B (zh) | 一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN108676811A (zh) | 一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用 | |
| CN114874961B (zh) | 一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |