CN114591880B - 一种可积累莽草酸的大肠杆菌的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可积累莽草酸的大肠杆菌的构建及其应用，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌中敲除莽草酸激酶(aroL和aroK)阻止莽草酸的降解，然后再敲除磷酸烯醇式丙酮酸‑糖磷酸转移酶系统操纵子中的基因ptsI、葡萄糖转运酶基因ptsG，同时在基因组上用强的内源启动子Pssra‑infc替换葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(zwF)的本地启动子，最后再通过质粒表达强化关键基因酶tktA的表达，弱化aroK的表达，进一步提高莽草酸的积累。将本发明构建得到的重组大肠杆菌在发酵罐体系中发酵生产莽草酸，发酵78h，可以积累63.494g/L的莽草酸，对工业化生物法生产莽草酸具有重要的意义。

Description

一种可积累莽草酸的大肠杆菌的构建及其应用
技术领域
本发明涉及一种可积累莽草酸的大肠杆菌的构建及其应用，属于基因工程及生物工程技术领域。
背景技术
莽草酸(Shikimic acid)是一种有机酸，化学名是3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-甲酸，是植物和微生物合成芳香族氨基酸合成的关键物质。同时也是合成许多种生物碱、芳香族氨基酸、吲哚衍生物以及手性药物的关键原料。特别是抗流感药物磷酸奥司他韦(Oseltamivir)，磷酸奥司他韦几乎对所有的流感病毒都有较强的抗病毒活性(如H5N1、H1N1、H7N9等)具有极大的市场潜力。
目前莽草酸主要从木兰科植物八角茴香(Illicium verum)中提取，每30kg干植物能提取1kg莽草酸，原料易受到地域季节的限制，难以满足大规模生产。而微生物如大肠杆菌由于生长快、周期短、不受时间、地点，环境等因素的限制。因此，利用微生物发酵法从头合成莽草酸，提高生产效率，降低生产成本具有极大的应用前景。
发明内容
为了实现莽草酸在大肠杆菌中的积累，本发明首先在大肠杆菌中通过基因编辑技术敲除大肠杆菌自身的莽草酸激酶(aroL和aroK)的编码基因以阻止莽草酸的降解，实现莽草酸在所述大肠杆菌中的积累，在此基础上敲除磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统操纵子中的基因ptsI和葡萄糖转运酶基因ptsG，同时在大肠杆菌的基因组上用强的内源启动子Pssra-infc替换葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwF的自身启动子，然后再强化关键基因转酮醇酶tktA的表达，并实现莽草酸激酶aroK的弱化表达，进一步提高莽草酸的积累，得到能够生产莽草酸的大肠杆菌。
本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述的大肠杆菌敲除了莽草酸激酶的编码基因aroL和aroK，敲除了编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统操纵子中PTSI酶的编码基因ptsI和葡萄糖转运酶的编码基因ptsG。
在一种实施方式中，在所述大肠杆菌的基因组上内源启动子Pssra-infc替换葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwF的自身启动子。
在一种实施方式中，所述的大肠杆菌强化了转酮醇酶编码基因tktA的表达并弱化表达了莽草酸激酶的编码基因aroK。
在本发明的一种实施方式中，用大肠杆菌内源组成型启动子PrpsU控制的tktA基因的表达。
在一种实施方式中，用大肠杆菌内源弱组成型启动子PgapA控制的带有蛋白降解标签LAA的aroK基因的表达。
在一种实施方式中，所述莽草酸激酶aroL的核苷酸序列的Gene ID：945031，所述编码莽草酸激酶的基因aroK的核苷酸序列的Gene ID：2847759，所述ptsI的核苷酸序列的Gene ID：946879，所述ptsG的核苷酸序列的Gene ID：945651。
在一种实施方式中，所述zwF的核苷酸序列的Gene ID：946370。
在一种实施方式中，所述tktA的核苷酸序列的Gene ID：947420。
本发明提供了一种生产莽草酸的方法，利用所述的重组大肠杆菌以发酵生产莽草酸。
在一种实施方式中，将OD600为1～2的菌株按照1％～2％(v/v)量接种至摇瓶发酵体系中，在35～40℃，200～250rpm发酵不少于84h；
或者，将OD600为2～3的菌株按照体积比5～8％的量接种至发酵罐发酵体系中，维持发酵过程中pH6.5～7.0并控制溶氧在25％～30％，当溶氧反弹时，补加甘油以维持发酵体系中的甘油浓度为2～4g/L，发酵时间不少于48h；优选地，发酵时间不少于60h，更优选地，发酵时间为72h。
在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的单菌落接种至LB培养基中，在37℃、180～220rpm下培养至OD600为1～2得到种子液；再将OD600为1～2的种子液接种至新鲜的LB培养基中，在装液量为300mL的2L摇瓶中培养得到OD600为2～3的种子液。
在一种实施方式中，所述摇瓶发酵体系中以葡萄糖为碳源，所述发酵罐发酵体系中以甘油为碳源。
在一种实施方式中，所述摇瓶体系中含有葡萄糖35g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，NaCl 1g/L，无水柠檬酸1.5g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeSO4·7H2O 0.1125g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨4g/L，维生素B1 0.045g/L；微量元素营养液(TES1.5mL/L)；所述微量元素营养液(TES)的成分包括Al2(SO4)3·18H2O 2.0g/L，CoSO4·7H2O0.75g/L，CuSO4·5H2O 2.5g/L，H3BO3 0.5g/L，MnSO4·H2O 24g/L，Na2MoO4·2H2O 3.0g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，ZnSO4·7H2O 15g/L。
在一种实施方式中，所述发酵罐体系中含有甘油50g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，NaCl 1g/L，无水柠檬酸1.5g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeSO4·7H2O 0.1125g/L，酵母粉10g/L，甜菜碱0.2g/L，维生素B1 0.045g/L，芳香族氨基酸(酪氨酸1.0g/L，色氨酸1.0g/L，苯丙氨酸1.0g/L)，芳香族维生素(对羟基苯甲酸0.01g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，2,3-二羟基苯甲酸0.01g/L)，硫酸链霉素添加量为50mg/L以及微量元素营养液(TES 1.5mL/L)；所述微量元素营养液(TES)的成分包括Al2(SO4)3·18H2O 2.0g/L，CoSO4·7H2O 0.75g/L，CuSO4·5H2O 2.5g/L，H3BO3 0.5g/L，MnSO4·H2O 24g/L，Na2MoO4·2H2O 3.0g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，ZnSO4·7H2O 15g/L。
本发明提供了所述的重组大肠杆菌在莽草酸生产中的应用。
本发明的有益效果：
本发明基于所述大肠杆菌自身的莽草酸途径，通过敲除莽草酸激酶(aroL和aroK)阻止莽草酸的降解，在此基础上敲除磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统操纵子中的基因ptsI、葡萄糖转运酶基因ptsG，同时在大肠杆菌的基因组上用强的内源启动子Pssra-infc替换葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwF)的本地启动子，然后在用大肠杆菌内源组成型启动子PrpsU控制的tktA基因和内源弱组成型启动子PgapA控制的带有蛋白降解标签LAA的aroK基因，强化关键基因转酮醇酶tktA的表达，弱化莽草酸激酶aroK的表达，较大提高了莽草酸的积累量。利用本发明构建得到的大肠杆菌发酵生产莽草酸，在发酵罐条件下发酵78h，可以从发酵液中获得63.494g/L的莽草酸。
附图说明
图1为所述大肠杆菌中莽草酸合成的代谢示意图。
图2为所述大肠杆菌工程菌内源组成型启动子PrpsU控制的tktA基因和内源弱组成型启动子PgapA控制的带有蛋白降解标签LAA的aroK基因的质粒图谱。
图3为大肠杆菌SA2～SA6摇瓶84h发酵结果图。
图4为所述大肠杆菌工程菌在15L发酵罐上的生长和莽草酸积累图。
具体实施方式
(一)下述实施例中涉及的大肠杆菌HGXΔtyrP来源于文献“王钦,曾伟主,周景文.大肠杆菌酪氨酸转运系统基因敲除对酪氨酸生产的影响[J].生物工程学报,2019,35(07):1247-1255.DOI:10.13345/j.cjb.180533.”；下列实施例中设计的大肠杆菌JM109购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；下述实施例中涉及的质粒pCas9和p-Target质粒记载于文献“Jiang Y,Chen B,Duan C,et al.Multigene Editing in the Escherichia coli Genomevia the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology,2015,81(7):2506.”
(二)下述实施例中涉及的培养基如下：
种子(LB)培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。
摇瓶发酵培养基：葡萄糖35g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，NaCl 1g/L，无水柠檬酸1.5g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeSO4·7H2O 0.1125g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨4g/L，维生素B1 0.045g/L；微量元素营养液(TES 1.5mL/L)；所述微量元素营养液(TES)的成分包括Al2(SO4)3·18H2O 2.0g/L，CoSO4·7H2O 0.75g/L，CuSO4·5H2O 2.5g/L，H3BO3 0.5g/L，MnSO4·H2O 24g/L，Na2MoO4·2H2O 3.0g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，ZnSO4·7H2O 15g/L。
发酵罐发酵培养基：甘油50g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，NaCl 1g/L，无水柠檬酸1.5g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeSO4·7H2O 0.1125g/L，酵母粉10g/L，甜菜碱0.2g/L，维生素B1 0.045g/L，芳香族氨基酸(酪氨酸1.0g/L，色氨酸1.0g/L，苯丙氨酸1.0g/L)，芳香族维生素(对羟基苯甲酸0.01g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，2,3-二羟基苯甲酸0.01g/L)，硫酸链霉素添加量为50mg/L以及微量元素营养液(TES 1.5mL/L)；所述微量元素营养液(TES)的成分包括Al2(SO4)3·18H2O 2.0g/L，CoSO4·7H2O 0.75g/L，CuSO4·5H2O 2.5g/L，H3BO3 0.5g/L，MnSO4·H2O 24g/L，Na2MoO4·2H2O 3.0g/L，NiSO4·6H2O2.5g/L，ZnSO4·7H2O 15g/L。
(三)大肠杆菌电转化感受态细胞的制备
1.从平板上挑取单菌落接种于装有50mL LB培养基的三角瓶，在30℃，200rpm过夜振荡培养。
2.以1％(v/v)接种量接种于含有的50ml LB培养基，在30℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.2时加入500μL 1mol/L的阿拉伯糖(终浓度为10mmol/L)诱导，30℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.6。
3.将菌液转移到50mL离心管中冰上冷却10min，再在4℃，4000rpm离心5min收集菌体，用25mL冷却的10％(v/v)甘油洗涤菌体3次。
4.用500μL预冷的10％(v/v)甘油重悬菌体，80μL每管分装后-80℃保存。
(四)DNA片段的电转
1.分别将感受态细胞、目的基因上下游同源臂和pTarget质粒放于冰上冰浴5min。
2.加入500ng目的基因上下游同源臂和500ng pTarget质粒转移至电转感受态细胞中，轻轻混匀，放置于冰上10min，同时电击杯预冷5min。
3.将上述DNA片段和细胞的混合液加入到预冷的1mm电击杯中，在1.8kv，25μF，200Ω电击，电击后迅速加入1mL预冷的LB培养基后转移到1.5mL EP管中30℃，200rpm孵育2h。
4.将上述混合液于5000rpm离心2min后移去900μL上清，将EP管底部的菌体重悬涂布Spc和Kan抗性的LB琼脂平板，30℃培养过夜。
(五)下述实施例中莽草酸的检测方法：高效液相色谱(HPLC)测定。色谱条件为：Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm)；检测器：UV 210nm；柱温：45℃；流动相：5mM H2SO4；进样体积：10μL；流速：0.6mL/min。实验样品和标准品均用0.22μm滤膜过滤。
(六)Gibson组装方法：反应体系如下，DNA片段加入50ng，载体加入100ng，Gibsonmix加入5μL，加入无菌超纯水至体系10μL。反应条件如下，50℃反应60min，反应结束后立即置于冰上。取10μL转化至大肠杆菌感受态JM109。
实施例1：大肠杆菌莽草酸激酶ΔaroL缺失菌株SA2的构建
具体步骤如下：
(1)将pCas9质粒转入大肠杆菌HGXΔtyrP中，构建菌株SA1(pCas9)，将菌株SA1(pCas9)制成电转化感受态。
(2)根据所述菌株基因组中aroL的上下游550bp基因序列设计特异性引物，以菌株HGXΔtyrP的基因组为模板，以aroL-UF/aroL-UR，aroL-DF/aroL-DR扩增该基因aroL的上下游基因550bp的基因序列。
PCR条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸30s，30个循环。
(3)使用融合PCR技术将步骤(2)得到的上下游550bp的基因序列融合，得到aroL的同源臂。
(4)设计特异性引物，以p-Target质粒为模板，使用PCR定点突变技术构建aroL-pTarget质粒，所用引物为aroL-sgRNA-F/R。测序验证构建的质粒。
(5)将步骤(3)得到的aroL的上下游同源臂和步骤(4)得到的aroL-pTarget质粒电转化进菌株SA1(pCas9)感受态中。得到aroL敲除的菌株SA2。
实施例2：大肠杆菌莽草酸激酶(ΔaroL和ΔaroK)缺失菌株SA3的构建
具体步骤如下：
(1)将pCas9质粒转入大肠杆菌SA2中，构建菌株SA2(pCas9)，将菌株SA2(pCas9)制成电转化感受态。
(2)根据所述菌株基因组中aroK的上下游550bp基因序列设计特异性引物，以菌株HGXΔtyrP的基因组为模板，以aroK-UF/aroK-UR，aroK-DF/aroK-DR扩增该基因aroK的上下游基因550bp的基因序列。
PCR条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸30s，30个循环。
(3)使用融合PCR技术将步骤(2)得到的上下游550bp的基因序列融合，得到aroK的同源臂。
(4)设计特异性引物，以p-Target质粒为模板，使用PCR定点突变技术构建aroK-pTarget质粒，所用引物为aroK-sgRNA-F/R。测序验证构建的质粒。
(5)将步骤(3)得到的aroK的上下游同源臂和步骤(4)得到的aroK-pTarget质粒电转化进菌株SA2(pCas9)感受态中。得到aroK敲除的菌株SA3。
实施例3：大肠杆菌ΔaroL，ΔaroK，ΔptsI缺失菌株SA4的构建
具体步骤如下：
(1)将pCas9质粒转入大肠杆菌SA3中，构建菌株SA3(pCas9)，将菌株SA3(pCas9)制成电转化感受态。
(2)根据所述菌株基因组中ptsI的上下游550bp基因序列设计特异性引物，以菌株HGXΔtyrP的基因组为模板，以ptsI-UF/ptsI-UR，ptsI-DF/ptsI-DR扩增该基因ptsI的上下游基因550bp的基因序列。
PCR条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸30s，30个循环。
(3)使用融合PCR技术将步骤(2)的得到的上下游550bp的基因序列融合，得到ptsI的同源臂。
(4)设计特异性引物，以p-Target质粒为模板，使用PCR定点突变技术构建ptsI-pTarget质粒，所用引物为ptsI-sgRNA-F/R。测序验证构建的质粒。
(5)将步骤(3)得到的ptsI的上下游同源臂和步骤(4)得到的ptsI-pTarget质粒电转化进菌株SA3(pCas9)感受态中。得到ptsI敲除的菌株SA4。
实施例4：大肠杆菌ΔaroL，ΔaroK，ΔptsI，ΔptsG缺失菌株SA5的构建
具体步骤如下：
(1)将pCas9质粒转入大肠杆菌SA4中，构建菌株SA4(pCas9)，将菌株SA4(pCas9)制成电转化感受态。
(2)根据所述菌株基因组中ptsG的上下游550bp基因序列设计特异性引物，以菌株HGXΔtyrP的基因组为模板，以ptsG-UF/ptsG-UR，ptsG-DF/ptsG-DR扩增该基因ptsG的上下游基因550bp的基因序列。
PCR条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸30s，30个循环。
(3)使用融合PCR技术将(2)的得到的上下游550bp的基因序列融合，得到ptsG的同源臂。
(4)设计特异性引物，以p-Target质粒为模板，使用PCR定点突变技术构建ptsG-pTarget质粒，所用引物为ptsG-sgRNA-F/R。测序验证构建的质粒。
(5)将(3)得到的ptsG的上下游同源臂和(4)得到的ptsG-pTarget质粒电转化进菌株SA4(pCas9)感受态中。得到ptsG敲除的菌株SA5。
实施例5：大肠杆菌ΔaroL，ΔaroK，ΔptsI，ΔptsG缺失和启动子替换菌株SA6的构建将菌株基因组中zwF基因的自身启动子替换为Pssra-infc，具体步骤如下：
(1)将pCas9质粒转入大肠杆菌SA5中，构建菌株SA5(pCas9)，将菌株SA5(pCas9)制成电转化感受态。
(2)根据所述菌株基因组中zwF的基因序列起始密码子ATG前-200bp上游550bp和ATG下游550基因序列设计特异性引物，以菌株HGXΔtyrP的基因组为模板，以zwF-UF/zwF-UR，zwF-DF/zwF-DR扩增该基因zwF的上下游基因550bp的基因序列；以引物ssrA-R/Infc-F扩增Pssra-infc启动子序列。
PCR条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸50s，30个循环。
(3)使用融合PCR技术将步骤(2)的得到的上下游550bp的基因序列和启动子Pssra-infc序列加到上下游同源臂之间进行融合成一条模板序列，得到zwF的同源臂。
(4)设计特异性引物，以p-Target质粒为模板，使用PCR定点突变技术构建zwF-pTarget质粒，所用引物为zwF-sgRNA-F/R。测序验证构建的质粒。
(5)将步骤(3)得到的zwF的上下游同源臂和步骤(4)得到的zwF-pTarget质粒电转化进菌株SA5(pCas9)感受态中。得到启动子Pssra-infc控制zwF的菌株SA6。
表1
实施例6：表达载体pCDFDuet-PrpsU-tktA-PgapA-aroK-LAA的构建
使用Gibson组装技术在pCDFDuet-1载体中构建内源组成型启动子PrpsU控制的tktA基因和内源弱组成型启动子PgapA控制的带有蛋白降解标签LAA的aroK基因。
具体步骤如下：
(1)使用引物tktA-F/tktA-R扩增所述大肠杆菌基因组上的tktA，得到基因tktA片段；使用引物tktA-laci-R/aroK-LAA-F线性化载体pCDFDuet-1，得到线性化载体片段；使用引物gapA-aroK-F/LAA-aroK-R扩增所述大肠杆菌基因组上的aroK，得到aroK片段。
PCR条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸1min，26个循环。
(2)使用引物tktA-rpsU-F/rpsU-R，扩增所述大肠杆菌基因组上的rpsU启动子序列；使用引物rpsU-Z-F/gapA-Z-R，扩增载体上的lacI启动子序列。然后将获得的rpsU启动子序列和lacI启动子序列两个片段通过融合PCR融合成一个片段。
PCR条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸30s，30个循环。
(3)使用引物gapA-F/aroK-gapA-R扩增所述大肠杆菌基因组上的gapA启动子序列。PCR条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸15s，30个循环。
(4)将(1-3)中PCR扩增的片段纯化回收后，按照Gibson组装试剂盒的说明，进行50℃组装，转化大肠杆菌JM109，提质粒测序验证，构建的质粒pCDFDuet-PrpsU-tktA-PgapA-aroK-LAA(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
表2所用引物
实施例7：大肠杆菌工程菌SA2～SA6的摇瓶发酵
具体步骤如下：
(1)将大肠杆菌工程菌SA2～SA6在LB固体平板中划线，37℃过夜培养。
(2)将平板上长出的单菌落接种到含有25mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，37℃培养10～12h至OD600为1～2。
(3)将步骤(2)中的大肠杆菌工程菌SA2～SA6的种子液按照1％～2％(v/v)的接种量接入含有25mL摇瓶发酵培养基的250mL摇瓶中，在37℃，220rpm发酵84h。
(4)SA2～SA6摇瓶发酵结果见图3，菌株SA6摇瓶产量最高，84h积累到4.408g/L的莽草酸。
实施例8：大肠杆菌工程菌SA7的构建
具体步骤如下：将大肠杆菌SA6制成电转化感受态，将构建好的质粒pCDFDuet-PrpsU-tktA-PgapA-aroK-LAA转入菌株SA6中，得到菌株SA7。
实施例9：大肠杆菌工程SA7在15L发酵罐体系生产莽草酸
具体步骤如下：
(1)将大肠杆菌工程菌SA7在LB固体平板中划线，37℃过夜培养；
(2)将平板上长出的单菌落接种到含有25mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、220rpm培养10-12h至OD600为1-2；
(3)将步骤(2)中的种子液转接到含有300mL液体LB培养基的2000mL的摇瓶中，37℃、220rpm培养10-12h至OD600为2-3；
(4)将步骤(3)中培养好的种子液，按照6％(v/v)的接种量接种到含有10L发酵培养基的15L发酵罐中37℃培养。
初始pH控制在6.86，通过传感器以20％的氨水来控制发酵罐中的pH维持在6.86；初始转速控制在250rpm，以溶氧传感器关联搅拌转速，维持发酵罐中的溶氧在30％左右，通气量2vvm；观察溶氧变化，当溶氧反弹时，开始流加甘油750g/L的甘油，根据溶氧情况维持发酵罐中的甘油浓度在3g/L左右。实时监测整个发酵过程中，发酵液中莽草酸的积累量和菌体的生长情况。
(4)大肠杆菌工程菌在15L发酵罐中发酵78h，积累了63.494g/L的莽草酸，结果见图4和表3。
表3发酵过程莽草酸和生物量随时间的变化
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> BAA220131A
<130> 一种可积累莽草酸的大肠杆菌的构建及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 386
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attggctatc acatccgaca caaatgttgc catcccattg cttaatcgaa taaaaatcag 60
gctacatggg tgctaaatct ttaacgataa cgccattgag gctggtcatg gcgctcataa 120
atctggtata cttaccttta cacattgcgg gcattcgtgt taaagcagac ttgagaaatg 180
agaagattgg ctttaaaatc cgcgagcaca ctttgcgtcg cgtcccatat atgctggtct 240
gtggtgataa agaggtggaa tcaggcaaag ttgccgttcg cacccgccgt ggtaaagacc 300
tgggaagcat ggacgtaaat gaagtgatcg agaagctgca acaagagatt cgcagccgca 360
gtcttaaaca attggaggaa taaggt 386
<210> 2
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcgggttg atgtaaaact ttgttcgccc ctggagaaag cctcgtgtat actcctcacc 60
cttataaaag tccctttcaa aaaaggccgc ggtgctttac aaagcagcag caattgcagt 120
aaaattccgc accattttga aataagctgg cgttgatgcc agcggcaaac cgaattaatc 180
aaaggtgaga ggcac 195
<210> 3
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agtctttgat ataacgaatg gattcttcac ttaccggttc gtagaaactg ggccagccac 60
agccggaatc atacttggtt tgggaatgaa acagcggggc atcgcagatc aaacagtgat 120
atacgccgtc acgcttgtta tgcagtaaac gacccgtaaa tggcggctct gtcccatgat 180
tctgcgtcac gtaaaactgc atctcggaca aatttttttt cagttcttct gccgaaggtt 240
tattagccat ttgctcacat ctcactttaa tcgtgctcac attacgtgac tgattctaac 300
aaaacattaa caccaactgg caaaattttg tcctaaactt gatctcgacg aaatggctgc 360
acctaaatcg tgatgaaaat cacattttta tcgtaattgc cctttaaaat tcggggcgcc 420
gaccccatgt ggtctcaagc ccaaaggaag agtgaggcga gtcagtcgcg taatgcttag 480
gcacaggatt gatttgtcgc aatgattgac acgattccgc ttgacgctgc gtaaggtttt 540
tgtaatttta caggcaacct tttattcact aacaaatagc tggtggaata t 591
<210> 4
<211> 5825
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 60
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag ggtggttttt 120
cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc ctgagagagt 180
tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt 240
tacagcagtt cttttgcttt cgcaacaacg ttatcaacag tgaagccgaa ctcttcaaac 300
agcagctctg ccggagcaga ttcaccgaag gtggtcatac cgacgatagc accgttcagg 360
ccaacatact tgtaccagta gtcagcaata cccgcttcta cagcaacgcg tgcagtaacc 420
gctttcggca gtacggattc acggtaagca gcatcctgct tgtcaaatgc gtcggtagac 480
ggcatggaca ccacgcgcgc tttcacgcct tcggcagtca gtttttcgta ggcagcaaca 540
gccagttcaa cttctgaacc ggtagcgatg aaaatcagtt ccggctgacc ggcgcagtct 600
ttcagcacat aaccaccgcg cgcgatgttt gccagttgct cttcagttcg ttcctgctgc 660
gccaggttct gacgggagag gatcagtgcg gtcgggccgt cctgacgctc aacaccgtat 720
ttccacgcga ccgcggattc aacctggtca cacggacgcc atgtagacat gttcggggtt 780
acgcgcagag aagcgacctg ctcaaccggc tggtgagtcg ggccgtcttc gcccagaccg 840
atggagtcgt gggtgtaaac catcacctga cgctgtttca tcagcgcagc catacgtacg 900
gcgttacgtg cgtattccac gaacatcagg aaggtggagg tgtacggcag gaagccaccg 960
tgcagggaga taccgttagc aatcgcggtc ataccgaact cgcgaacacc gtagtggatg 1020
tagttacccg cagcatcttc gttgattgct ttagaaccag accacagggt caggttagac 1080
ggcgccaggt cagcagaacc gccgaggaat tccggcaaca gcggaccgaa cgcttcgata 1140
gcattctgag acgctttacg gctggcgatt ttcgccggat tagcctgcag tttagcgatg 1200
aactctttcg ctttagcgtc gaagtcagac ggcatttcgc ctttcatacg gcgggtaaat 1260
tcagcggctt cctgcggata agctttcgcg taagcagcga atttctcgtt ccatgcggat 1320
tctttcgcct ggcctgcttc tttcgcatcc cactgagcat agatttcaga cgggatttcg 1380
aacggcgcat atttccagcc cagttgttcg cgggtcaggg caatttcagc gtcgcccagc 1440
ggcgcaccgt gggagtcgtg ggtaccggct ttgttcgggg aaccgaaacc gatgatggtt 1500
ttgcacatca gcagggaagg tttgtcagtc actgcgcgcg cttcttctac tgcgcgtttg 1560
atagatgccg cgtcatgacc gtcgatgtcg cgaataacgt gccagccgta agcttcgaaa 1620
cgcattgcgg tgtcgtcggt gaaccagcct tcaacgtgac catcgataga aataccgttg 1680
tcatcgtaga atgcaatcag tttacccagc ttcagcgtac ccgccagaga gcaaacttcg 1740
tgggagatgc cttccatcat gcagccgtcg cccatgaagg cgtaggtgta gtggtcgaca 1800
atgtcgtggc ccggacggtt aaactgcgcc gccagcgttt tttctgcaat cgccataccg 1860
actgcgttgg caataccctg acccagcgga ccggtggtgg tttccacacc agcggtgtaa 1920
cccacttccg ggtgacccgg agttttagag tgcagctgac ggaagttttt cagttcttcc 1980
atcggcagat cgtaaccggt gaggtgcagc aggctgtaga tcagcatgga gccgtggccg 2040
ttggacagca cgaagcggtc acggtcagcc caggacggat tctgcgggtt gtgtttcagg 2100
aaatcacgcc acaggacttc ggcaatgtca gccataccca taggggcacc cgggtgaccg 2160
gatttggctt tctgtactgc gtccatgctc agcgcacgaa tagcattggc aagctcttta 2220
cgtgaggaca tgtgcctctc acctttgatt aattcggttt gccgctggca tcaacgccag 2280
cttatttcaa aatggtgcgg aattttactg caattgctgc tgctttgtaa agcaccgcgg 2340
ccttttttga aagggacttt tataagggtg aggagtatac acgaggcttt ctccaggggc 2400
gaacaaagtt ttacatcaac ccgcatattc accaccctga attgactctc ttccgggcgc 2460
tatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcgc cattcgatgg tgtccgggat ctcgacgctc 2520
tcccttatgc gactcctgca ttaggaaata gtctttgata taacgaatgg attcttcact 2580
taccggttcg tagaaactgg gccagccaca gccggaatca tacttggttt gggaatgaaa 2640
cagcggggca tcgcagatca aacagtgata tacgccgtca cgcttgttat gcagtaaacg 2700
acccgtaaat ggcggctctg tcccatgatt ctgcgtcacg taaaactgca tctcggacaa 2760
attttttttc agttcttctg ccgaaggttt attagccatt tgctcacatc tcactttaat 2820
cgtgctcaca ttacgtgact gattctaaca aaacattaac accaactggc aaaattttgt 2880
cctaaacttg atctcgacga aatggctgca cctaaatcgt gatgaaaatc acatttttat 2940
cgtaattgcc ctttaaaatt cggggcgccg accccatgtg gtctcaagcc caaaggaaga 3000
gtgaggcgag tcagtcgcgt aatgcttagg cacaggattg atttgtcgca atgattgaca 3060
cgattccgct tgacgctgcg taaggttttt gtaattttac aggcaacctt ttattcacta 3120
acaaatagct ggtggaatat atggcagaga aacgcaatat ctttctggtt gggcctatgg 3180
gtgccggaaa aagcactatt gggcgccagt tagctcaaca actcaatatg gaattttacg 3240
attccgatca agagattgag aaacgaaccg gagctgatgt gggctgggtt ttcgatttag 3300
aaggcgaaga aggcttccgc gatcgcgaag aaaaggtcat caatgagttg accgagaaac 3360
agggtattgt gctggctact ggcggcggct ctgtgaaatc ccgtgaaacg cgtaaccgtc 3420
tttccgctcg tggcgttgtc gtttatcttg aaacgaccat cgaaaagcaa cttgcacgca 3480
cgcagcgtga taaaaaacgc ccgttgctgc acgttgaaac accgccgcgt gaagttctgg 3540
aagcgttggc caatgaacgc aatccgctgt atgaagagat tgccgacgtg accattcgta 3600
ctgatgatca aagcgctaaa gtggttgcaa accagattat tcacatgctg gaaagcaacg 3660
ctgctaacga cgaaaactac gctctggctg cttaactagc gcagcttaat taacctaggc 3720
tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 3780
gggttttttg ctgaaacctc aggcatttga gaagcacacg gtcacactgc ttccggtagt 3840
caataaaccg gtaaaccagc aatagacata agcggctatt taacgaccct gccctgaacc 3900
gacgaccggg tcatcgtggc cggatcttgc ggcccctcgg cttgaacgaa ttgttagaca 3960
ttatttgccg actaccttgg tgatctcgcc tttcacgtag tggacaaatt cttccaactg 4020
atctgcgcgc gaggccaagc gatcttcttc ttgtccaaga taagcctgtc tagcttcaag 4080
tatgacgggc tgatactggg ccggcaggcg ctccattgcc cagtcggcag cgacatcctt 4140
cggcgcgatt ttgccggtta ctgcgctgta ccaaatgcgg gacaacgtaa gcactacatt 4200
tcgctcatcg ccagcccagt cgggcggcga gttccatagc gttaaggttt catttagcgc 4260
ctcaaataga tcctgttcag gaaccggatc aaagagttcc tccgccgctg gacctaccaa 4320
ggcaacgcta tgttctcttg cttttgtcag caagatagcc agatcaatgt cgatcgtggc 4380
tggctcgaag atacctgcaa gaatgtcatt gcgctgccat tctccaaatt gcagttcgcg 4440
cttagctgga taacgccacg gaatgatgtc gtcgtgcaca acaatggtga cttctacagc 4500
gcggagaatc tcgctctctc caggggaagc cgaagtttcc aaaaggtcgt tgatcaaagc 4560
tcgccgcgtt gtttcatcaa gccttacggt caccgtaacc agcaaatcaa tatcactgtg 4620
tggcttcagg ccgccatcca ctgcggagcc gtacaaatgt acggccagca acgtcggttc 4680
gagatggcgc tcgatgacgc caactacctc tgatagttga gtcgatactt cggcgatcac 4740
cgcttccctc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4800
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagcta gctcactcgg 4860
tcgctacgct ccgggcgtga gactgcggcg ggcgctgcgg acacatacaa agttacccac 4920
agattccgtg gataagcagg ggactaacat gtgaggcaaa acagcagggc cgcgccggtg 4980
gcgtttttcc ataggctccg ccctcctgcc agagttcaca taaacagacg cttttccggt 5040
gcatctgtgg gagccgtgag gctcaaccat gaatctgaca gtacgggcga aacccgacag 5100
gacttaaaga tccccaccgt ttccggcggg tcgctccctc ttgcgctctc ctgttccgac 5160
cctgccgttt accggatacc tgttccgcct ttctccctta cgggaagtgt ggcgctttct 5220
catagctcac acactggtat ctcggctcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgta 5280
agcaagaact ccccgttcag cccgactgct gcgccttatc cggtaactgt tcacttgagt 5340
ccaacccgga aaagcacggt aaaacgccac tggcagcagc cattggtaac tgggagttcg 5400
cagaggattt gtttagctaa acacgcggtt gctcttgaag tgtgcgccaa agtccggcta 5460
cactggaagg acagatttgg ttgctgtgct ctgcgaaagc cagttaccac ggttaagcag 5520
ttccccaact gacttaacct tcgatcaaac cacctcccca ggtggttttt tcgtttacag 5580
ggcaaaagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctactg 5640
aaccgctcta gatttcagtg caatttatct cttcaaatgt agcacctgaa gtcagcccca 5700
tacgatataa gttgtaattc tcatgttagt catgccccgc gcccaccgga aggagctgac 5760
tgggttgaag gctctcaagg gcatcggtcg agatcccggt gcctaatgag tgagctaact 5820
tacat 5825

Claims (7)

1. 一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌敲除了莽草酸激酶的编码基因aroL和aroK，敲除了编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统操纵子中PTSI酶的编码基因ptsI和葡萄糖转运酶的编码基因ptsG；强化了转酮醇酶编码基因tktA的表达并弱化表达了莽草酸激酶的编码基因aroK；在所述大肠杆菌的基因组上采用内源启动子Pssra-infc替换葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwF的自身启动子；所述莽草酸激酶aroL的核苷酸序列的Gene ID：945031；所述编码莽草酸激酶的基因aroK的核苷酸序列的Gene ID：2847759，所述ptsI的核苷酸序列的Gene ID：946879，所述ptsG的核苷酸序列的Gene ID：945651；所述zwF的核苷酸序列的Gene ID：946370；所述tktA的核苷酸序列的Gene ID：947420。
2.一种生产莽草酸的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的重组大肠杆菌以发酵生产莽草酸。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，将OD600为1~2的菌株按照1%~2%(v/v)量接种至摇瓶发酵体系中，在35~40℃，200~250 rpm发酵不少于84 h。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，将OD600为2~3的菌株按照体积比5~8%的量接种至发酵罐发酵体系中，维持发酵过程中pH6.5~7.0并控制溶氧在25%~30%，当溶氧反弹时，补加甘油以维持发酵体系中的甘油浓度为2~4 g/L，发酵时间不少于48 h。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述摇瓶发酵体系中以葡萄糖为碳源。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵罐发酵体系中以甘油为碳源。
7.权利要求1所述的重组大肠杆菌在莽草酸生产中的应用。
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