Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego l-/ -8-{2-/2-keto-4-hydroksytetrahydropiranylo-6/etylo]- -l,2,3,7,8a-heksahydronaftalenu, bedacego nowym zwiazkiem zwanym Monakolinem K o wzorze przedstawionym na rysunku, wskazujacym aktyw¬ nosc przeciwhipercholesterolemiczna.Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze na podlozu hodowlanym zawierajacym przyswajalne zródlo wegla i przyswajalne zródlo azotu, prowa¬ dzi sie w temperaturze 7—40°C, w warunkach ae- robowych, hodowle drobnoustroju Monascus ruber szczepu 1005 (FERM 4822).Przyjmuje sie, ze wysoki poziom cholesterolu w krwi jest jedna z glównych przyczyn chorób ser¬ ca, takich jak zawal serca lub stwardnienie tetnic.W rezultacie podjeto powazne badania w celu od¬ krycia fizjologicznie dopuszczalnych substancji zdol¬ nych do zahamowania syntezy cholesterolu i przez to obnizenia poziomu cholesterolu w krwi. Jednym z takich zwiazków jest ML-236, ujawniony w bry¬ tyjskim opisie patentowym nr 1453 425. ML-236 wytwarzany jest droga hodowli drobnoustrojów ro¬ dzaju Penicillium.W trakcie badania grzybów z rodzaju Monascus stwierdzono, ze grzyby te, a zwlaszcza Monascus ruber szczep 1005 (FERM 4822), wytwarzaja czyn¬ nik antyhipercholesterolemiczny, posiadajacy zna¬ cznie wyzsza aktywnosc niz ML-236. Czynnik ten nazwano Monakolinem K. 10 15 20 30 Monascus ruber szczep 1005 (Ferm 4822) jest drobnoustrojem nowo wyizolowanym, którego wla¬ sciwosci podano ponizej.Szczep ten zostal wyizolowany z produktów zyw¬ nosciowych wytworzonych w Tajlandii i zdepo¬ nowany dnia 16 lutego 1979 r. pod numerem reje¬ stracyjnym 4822 w The Fermentation Research In- stitute, Agency of Industrial Science and Tech¬ nology, Ministry of International Trade and Indu- stry w Japonii oraz pod numerem rejestracyjnym NRRL 12073 w Agricular Service, Nerthern Regio- nal Research Laboratory w Stanach Zjednoczo¬ nych Ameryki. 1. Wzrost Wzrost na agarze ziemniaczano-glikozowym w temperaturze 25°C^j©et szybki, a srednica kolonii po uplywie 10 dni od zaszczepienia osiaga 6—6,5 cm. Kolonia jest plaska i wyksztalca wzglednie cienka warstwe podstawowa strzepek. Rozwój strzepek grzybni powietrznej jest skapy. Strzepki powietrzne maja barwe biala i wiekszosc z nich jest welnista. Na warstwie grzybni podstawowej tworza sie liczne kleistotecja, które w miare doj¬ rzewania przybieraja barwe czerwono-brazowa. Tak powierzchnia, jak i odwrotna strona kolonii maja barwe brazowa do czerwonawo-brazowej.Wzrost na agarze Sabouraud w temperaturze 25°C jest bardzo szybki i srednica kolonii po uply- 124 304124 304 3 wie 10 dni od zaszczepienia dochodzi do 6—6,5 cm.Powierzchnia kolonii jest bardzo plaska, a strzep¬ ki grzybni podstawowej i powietrznej rozwijaja sie lepiej niz w przypadku agaru ziemniaczano- -glikozowego. Ilosc kleistotecjów jest bardzo nie- s wielka. Powierzchnia kolonii ma barwe czerwona- wo-zólta do czerwonawó-brazowej, a z odwrotnej strony czerwonawo-brazowa do ciemno brazowej.Wzrost na agarze owsianym w temperaturze 25°C jest powolny, a srednica kolonii po uplywie 10 10 dni od zaszczepienia dochodzi do 1,5 — 2 cm.Kolonia jest plaska. Rozwój grzybni powietrznej i tworzenie kleistotecjów sa bardzo slabe. Tak powierzchnia jak i strona odwrotna kolonii maja barwe ciemnoczerwona do czerwonawo-brazowej. 15 I a VC^9st na^agarle Czapka w temperaturze 25°C j jest bardzo 'póytflijy i rodnica kolonii dochodzi do i 1,6—1,8 cm po uplywie 10 dni od zaszczepienia.I Saybkesc jwzroslii na kazdym z powyzszych pod- Ljg^y w ¦ temteratti|ze 37°C jest zasadniczo taka sa- 10 ma jak w temperaturze 25°C. 2. Wlasciwosci morfologiczne 25 Kleistotecja sa kuliste, o srednicy 30—60 nm. Ich sciany sa cienkie i bloniaste, a ich trzonki maja przegrody poprzeczne i kazdy sklada sie ze strzep¬ ki o srednicy 3,5—4,5 (im i dlugosci 15—80 jim.Worek zawiera 8 zarodników, jest prawie kulisty 30 i szybko zanika.Askospery sa bezbarwne i jajowate lub owalne.Maja wielkosc 4—5 X 4—7 Jim. Powierzchnia ich jest gladka. Konidia sa bezbarwne, kuliste lub gruszkowate, maja wielkosc 6—9 X 6—11 \uoa. 35 Podstawy ich sa plaskie, a sciany stosunkowo gru¬ be i gladkie. Konidia polaczone sa ze soba w kie¬ runku podstaw. Trzonek konidialny podobny jest do wegetatywnej strzepki i jest albo rozgaleziony albo nierozgaleziony. Konidia tworza sie na szczy- *o cie. Grzybnie sa bezbarwne i rozgalezione i maja przegrody poprzeczne. Wiekszosc z nich ma sredni¬ ce 3—5 |un.Na podstawie wyzej przytoczonych obserwacji wlasciwosci szczepu zidentyfikowano go jako 45 szczep Monascus ruber (van Tiegham).Wlasciwosci mikrobiologiczne Monascus ruber opisano w nastepujacych zródlach literaturowych: Takada, Transactions of the Microbiological Socie- ty of Japan, 9, 125-h130 (1969) [Materials for the 50 Fungus Flora of Japan (7)], van Tiegham, Buli.Soc. Botan. France, 31, 227 (1884) oraz Takada, Journal of Biology, Japan, 9, 128 (1969). Wytwa¬ rzanie askesper przez szczep opisali Cole i wspp. w Canadian Journal of Botany, 46, 987 (1968): "Co- 55 nidium Ontogeny in hyphomycetes. The imperfect state of Monascus ruber and its meristem arthro- spores".Monakolin K mozna wytwarzac za pomoca ho¬ dowli wybranego drobnoustroju w brzeczce fer- w mentacyjnej w warunkach aerobowych stosujac te same metody, które sa dobrze znane z dotych¬ czasowego stanu techniki, jesli chodzi o hodowle grzybów i innych drobnoustrojów. Przykladowo najpierw mozna przeprowadzic na odpowiednim <& podlozu hodowle drobnoustroju produkcyjnego, a nastepnie wyprodukowany drobnoustrój mozna "wy¬ odrebnic i uzyc jako inokulum, po .czym budowac na innym podlozu hodowlanym w celu wytworze¬ nia Monokolinu K. Podloza hodowlane uzywane do namnazania drobnoustroju i wytworzenia Monoko¬ linu K moga byc te same lub rózne.Mozna zastosowac kazde dobrze znane podloze hodowlane do prowadzenia hodowli grzybów, z tym, ze musi ono zawierac, jak to dobrze wiadomo, nie¬ zbedne skladniki odzywcze, a zwlaszcza zródlo przyswajalnego wegla i zródlo przyswajalnego azo¬ tu. Przykladami odpowiednich zródel przyswajal¬ nego wegla sa glikoza, maltoza, dekstryna, skrobia, laktzoa, sacharoza i gliceryna.Sposród nich do wytwarzania .MonakoliAu K szczególnie korzystne sa glikoza, gliceryna i skro¬ bia. Przykladami odpowiednich zródel przyswajal¬ nego azotu sa pepton, ekstrakt miesny, drozdze, ekstrakt drozdzowy, maka sojowa, maka arachido¬ wa, namek kukurydziany, otreby ryzowe i zródla azotu nieorganicznego. Sposród nich szczególnie ko¬ rzystnym jest pepton. W trakcie wytwarzania Mo- nakolinu K, do podloza budowlanego mozna doda¬ wac, jezeli jest to konieczne, sól nieorganiczna i/lub sól metalu. Poza tym, jesli jest to konieczne, moz¬ na takze dodac niewielka ilosc metalu ciezkiego.Hodowle drobnoustroju prowadzi sie w warun¬ kach aerobowych stosujac dobrze znane metody hodowli, takie jak hodowla na podlozu stalym, ho¬ dowla wstrzasana lub hodowla z mieszaniem i na¬ powietrzaniem. Drobnoustrój rosnie w szerokim za¬ kresie temperatur, np. 7—40°C, jednakze, zwlasz¬ cza gdy chodzi o wytwarzanie Monakolinu K, ko¬ rzystna temperatura hodowli wynosi 20—35°C.W trakcie hodowli drobnoustroju, Wytwarzanie Monakolinu K mozna sledzic pobierajac próbki brzeczki fermentacyjnej i oznaczajac aktywnosc fi¬ zjologiczna Monakolinu K zawartego w brzeczce za pomoca testów opisanych w dalszej czesci opisu.Hodowle mozna wiec kontynuowac az do nagro¬ madzenia sie w brzeczce znacznej ilosci Monakoli¬ nu K i po uplywie tego czasu Monakolin K mozna wyodrebnic z brzeczki fermentacyjnej za pomoca jakiejkolwiek dogodnej kombinacji metod wyodreb¬ niania, dobranych z uwzglednieniem jego wlasci¬ wosci fizycznych i chemicznych..I tak, mozna uzyc jednej lub wszystkich takich metod wyodrebniania, jak ekstrakcja bulionu z brzeczki fermentacyjnej rozpuszczalnikiem hydro- filowym takim, jak eter etylowy, octan etylu, chlo¬ roform i benzen, ekstrakcja biomasy rozpuszczal¬ nikiem hydrofilowym, takim jak aceten lub alko¬ hol, zatezanie, rozpuszczenie w rozpuszczalniku bardziej polarnym, takim jak aceton lub alkohol, usuwanie zanieczyszczen przy uzyciu rozpuszczal¬ nika mniej polarnego, takiego jak eter naftowy lub heksan, saczenie molekularne na kolumnie wy¬ pelnionej materialem"takim, jak Sephadex (nazwa fabryczna produktu wytwarzanego przez Pharma¬ cia, Co., Ltd., USA), chromatografia absorpcyjna na weglu aktywnym lub na zelu krzemionkowym, itd.Stosujac odpowiednia kombinacje tych metod moz¬ na z brzeczki fermentacyjnej wyodrebnic Monako¬ lin K w postaci czystej substancji.124 304 Stwierdzono, ze Monakolin K ma nastepujace wlasciwosci. 1. Barwa i postac: bezbarwne krysztaly 2. Temperatura topnienia: 157^159°C (z rozkla¬ dem) 3. Analiza elementarna: C 71,56°/*, H 8,85%, O 19,59f/t 4. Ciezar czasteczkowy: 404 (metoda spektrome¬ trii masowej) 5. Wzór czasteczkowy: C^H^Os 6. Widmo UV (metanol): jak to uwidoczniono na fig. 1 rysunku maksima wystepuja przy 232, 238 i 246 nm 7. Widmo IR (KBr): przedstawia je fig. 2 rysun¬ ku 8. Widmo NMR (proton 60 MHz): przedstawia je fig. 3 rysunku (CDCls, czterometylosilan jako wzo¬ rzec wewnetrzny) 9. Widmo NMR ("C): przedstawia je fig. 4 ry¬ sunku (w deuterowanym metanolu) 10. Rozpuszczalnosc: rozpuszczalny w nizszych alkoholach, takich jak metanol, etanol i propanol, acetonie, chloroformie, octanie etylu i benzenie.Nierozpuszczalny w eterze naftowym i heksanie 11. Skrecalnosc wlasciwa: [a]£«=+ 307,8 (c=l, metanol) 12. Chromatografia cienkowarstwowa: Ri=0,47 [zel krzemionkowy Kieselgel 60Fm, nr 5715 (Merck and Co., Ltd), przy uzyciu jako eluentu mieszani¬ ny (4:1 obj/obj.) chlorku metylenu i acetonu, wy¬ krywalny (jako skupienie absorbujace promienio¬ wanie UV) 50f/p obj/obj. kwasem siarkowym (przy ogrzaniu powstaje zabarwienie bladoczerwone do czerwonobrazowego) lub jodem].Zwiazek ma charakter obojetny i jest nieroz¬ puszczalny w obojetnym lub kwasnym srodowisku wodnym. Pod wplywem dzialania alkaliów ulega przemianie w substancje o charakterze kwasowym, która jest rozpuszczalna w wodzie. Substancje te mozna ekstrahowac octanem etylu lub chlorofor¬ mem przy zachowaniu odczynu kwasnego, a na¬ stepnie przeprowadzac w Monakolin K przez od¬ parowanie rozpuszczalnika.Fizjologiczna aktywnosc Monakolinu K mozna zbadac i oznaczyc ilosciowo za pomoca nastepuja¬ cych testów in vivo.Test in vivo na królikach.W tescie tym dokonuje sie pomiarów zdolnosci Monakolinu K obnizania poziomu cholesterolu w krwi królików. Powinno sie stosowac zwierzeta o wadze 2,5—3,0 kg. Bezposrednio przed poczatkiem testu pobiera sie od kazdego królika krew z zyly ucha i dokonuje sie pomiaru cholesterolu w suro¬ wicy krwi zwykla metoda. Nastepnie podaje sie uprzednio ustalona ilosc Monakolinu K doustnie w ciagu 1—5 dni i mierzy sie poziom cholesterolu w surowicy krwi po podaniu. Sile dzialania Mona¬ kolinu K lub hodowli zawierajacej Monakolin K mozna okreslic ilosciowo na podstawie poziomu cholesterolu przed i po podaniu Monakolinu K.Zdolnosc Monakolinu K obnizania poziomu cho¬ lesterolu w krwi i watrobie wykazano za pomoca róznych testów in vivo.Obnizanie poziomu cholesterolu w krwi szczu¬ rów.Jako zwierzat doswiadczalnych uzywa sie szczu¬ rów szczepu Wistar Imamichi, o wadze ciala okolo 300 g. Test prowadzi sie na grupach szczurów, z których kazda sklada sie z 5 zwierzat. Kazdemu 5 zwierzeciu podaje sie dozylnie Triton WR-h1339 (na¬ zwa fabryczna produktu znanego z podnoszenia poziomu cholesterolu w krwi) w ilosci 400 mg/kg, przy jednoczesnym podaniu Monakolinu K albo doustnie albo dootrzewnowo, w ilosci 10 mg/kg. 10 Po uplywie 20 godzin od doustnego podania, lub 14 godzin od podania dootrzewnowego, szczury:za¬ bija sie przez skrwawienie, pobiera krew i okresla w nich poziom cholesterolu zwyklymi metodami Ustalono, ze poziom cholesterolu w. krwi obnizyl w. sie, w porównaniu kontrolna grupa zwierzat, którym podano sam Triton WR-1339 o 23,0Vo.Obnizanie poziomu cholesterolu w krwi króli¬ ków Jako zwierzat doswiadczalnych uzywa sie króli- 20 ków o wadze ciala 2,7—2,9 kg. Kazdemu królikowi podaje sie doustnie Monakolin K w ilosci 1 mg/kg 2 razy dziennie (rano i wieczorem) w ciagu 5 dni.Przed podaniem i po uplywie 3 i 5 dni po podaniu pobiera sie krew z zyly ucha i okresla poziom 25 cholesterolu w surowicy krwi. Ustalono, ze poziom cholesterolu po 3 i 5 dniach po podaniu Mona¬ kolinu K obnizyl sie, odpowiednio o 15*/» i 29°/t w porównaniu do poziomu przed podaniem Mona¬ kolinu K. 30 Przy korzystnym wplywie hamujacym na bio¬ synteze cholesterolu, Monakolin K wykazuje bar¬ dzo mala toksycznosc. Tak wiec ostra toksycznosc przy podaniu doustnym (LD») Monakolinu K w ba¬ daniu na myszach wynosi 1 g (lub wiecej) /kg w wagi ciala.Monakolin K mozna podawac doustnie lub poza- jelitowo, w postaci kapsulek, tabletek, preparatów do wstrzykiwan lub jakiejkolwiek innej znanej postaci, aczkolwiek normalnie korzystna droga po- 40 dawania jest droga doustna. Stosuje sie dawki róz¬ nej wielkosci w zaleznosci od wieku i wagi ciala pacjenta i nasilenia stanu chorobowego, ale ogól¬ nie dawka dzienna dla doroslego wynosi 0,5—50 mg, albo jako dawka pojedyncza, albo w 2 lub 3 45 dawkach podzielonych. Tym niemniej, z uwagi na mala toksycznosc tego zwiazku, mozna stosowac wyzsze dawki, jesli jest to pozadane.Wynalazek ilustruje nastepujacy przyklad.Przyklad. Plynne podloze hodowlane zawie- 50 rajace 6f/o wag./obj. glikozy, 2,5^/» wag./obj. pepto¬ nu, 0,5f/o wagiobj. namoku kukurydzianego i 0,5*/* wagJobj. chlorku amonowego, zaszczepia sie Mo- nascus ruber szczep 1005. Hodowle prowadzi sie w warunkach aerobowych w temperaturze 28°C 55 w ciagu 10 dni. Otrzymany przesacz brzeczki fer¬ mentacyjnej (5 litrów) doprowadza sie do pH 3 za pomoca 6 N kwasu solnego, a nastepnie poddaje ekstrakcji taka sama iloscia octanu etylu. Roz¬ puszczalnik odparowuje sie z ekstraktu pód oo zmniejszonym cisnieniem i otrzymana pozostalosc rozpuszcza w 1O0 mU benzenu. Stibsitancje nieroz¬ puszczalne odsacza sie.Przesacz przemywa sie 2X100 ml 5f/t wag./obj. wodnego roztworu wodoroweglanu sodowego. Na- 05 stepnie do przemytego przesaczu dodaje sie 100 ml7 124 304 8 0,2 n wodnego roztworu wodorotlenku sodowego i mieszanine miesza sie w temperaturze pokojo¬ wej. Po potwierdzeniu za pomoca chromatografii cienkowarstwowej zaniku Monakolinu K w war¬ stwie benzenowej oddziela sie warstwe wodna. Od¬ czyn warstwy wodnej doprowadza sie do wartosci pH 3 za pomoca 6n kwasu solnego i otrzymany roztwór ekstrahuje 2X100 ml octanu etylu. Eks¬ trakt odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 260 mg oleistej pozosta¬ losci, która rozpuszcza sie w benzenie i krystali¬ zuje, a nastepnie rekrystalizuje z wodnego roztwo¬ ru acetonu, otrzymujac 87 mg Monakolinu K w po¬ staci bezbarwnych igiel, o wlasciwosciach opisa¬ nych uprzednio. 10 15 Zastrzezenia patentowe i. Sposób wytwarzania nowego l-/a-metylobuty- ryloksy/-3,7-dwumetylo-8-[2-/2-keto-4-hydroksyte- trahydropiranylo-6/etylo]nl,2,3,7,8,8a-heksahydronaf- talenu o wzorze przedstawionym na rysunku, zna¬ mienny tym, ze na podlozu hodowlanym, zawiera¬ jacym przyswajalne zródlo wegla i przyswajalne zródlo azotu, prowadzi sie w temperaturze 7—40°C, w warunkach aerobowych, hodowle drobnoustroju Monascus ruber szczepu 1005 (FERM 4822). 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie temperature 20—35°C.FIG. I 600 400 h 200 FIG. 2 220 240 260 rrtfji FIG. 4 L ¦ l__J—I—I—I—I—' iioó stoó 2000 moo moc i400 1200 tooo sooeoo 4oo cm* FIG3 «JJm»»it lHm¦¦».» mr»*-4f*jM* 190 140 120 K0 90 90 40 20 O PPM Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6. 3J8/84 Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL