CN106543254B - 棕榈酰辅酶a钾盐的化学合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法，包括以下步骤：S1、棕榈酸酐的合成；S2、棕榈酸二甲胺基乙巯酯的合成；S3、棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物的合成；S4、棕榈酰辅酶A钾盐的合成。本发明提供的棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法通过引入巯酯置换反应，有效降低了副反应，仅需要四步化学反应，经过一步纯化后，能得到纯度在95％的棕榈酰辅酶A钾盐产品，原料便宜，工艺简单，便于实施，利于规模化生产。

Description

棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法

技术领域

本发明涉及化学合成方法，具体涉及一种棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法。

背景技术

棕榈酰辅酶A钾盐(Palmitoyl Coenzyme A Potassium salt，简称：Palmityl-CoA)是一种特殊的生化试剂，主要用于乙酰辅酶A氧化酶活力测定，反应原理如下：

有关该化合物制备的文献有许多，归纳一下，有下面几种：1，生物酶法制备，如中国专利CN103074400B提到一种采用生物发酵方法制备棕榈酰辅酶A的方法，该方法的优点是大大降低了制造成本，但缺点也是明显的，得到的产品纯度只有40～50％，且后续纯化工艺非常复杂，对产品品质的提升有了限制；2，美国专利US5519128，涉及到一种化学合成的方法，现将辅酶A硅烷化，在氟化铯和二环己基-18-冠-6的作用下和棕榈酰N-琥珀酰亚胺缩合来制备，工艺路线如下：

该工艺第一步先进行辅酶A的硅烷化反应，第二步生成的硅烷化辅酶A与棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，反应中要用到氟化铯及昂贵的原料二环己基-18-冠-6，反应后处理需进行柱层析纯化，不利于规模化制备,所以原材料昂贵，纯化工艺复杂；3，KarineLucet-Levannier J.Am.Chem.Soc.1995,117,7546-7547，提到的也是采用与US5519128相类似的化学合成方法。4，Pierrev.vignais Biochimica et Biophysica ActaVol.29(1958)，采用辅酶A和棕榈酸酐反应来制备，缺点是收率低，产品纯度不高，这是由于辅酶A自身活化点多，反应过程中过多的副反应造成的。

发明内容

针对现有棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法原料昂贵，工艺复杂，不便于实施和规模化生产。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法，包括以下步骤：S1、棕榈酸酐的合成：将棕榈酸和乙酸酐进行反应，反应体系呈黄色透明溶液，静置降温至室温，随后旋蒸除去过量的乙酸酐，得到白色固体物，即为棕榈酸酐；S2、棕榈酸二甲胺基乙巯酯的合成：将制备的所述棕榈酸酐和溶剂丙酮二者混合，再加入N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐及三乙胺，加热反应后得到淡黄色油状液体产品，即为棕榈酸二甲胺基乙巯酯；S3、棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物的合成：反应瓶中，依次加入甲醇和所述棕榈酸二甲胺基乙巯酯，搅拌并恒温，再加入碘甲烷，反应完成经过后处理，得到碘化硫代棕榈酰胆碱的粗产品，该粗产品用甲醇与丙酮的混合溶剂进行重结晶，得到白色固体产品，即为棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物；S4、棕榈酰辅酶A钾盐的合成：将定量的辅酶A与棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物反应得到反应混合物，反应混合物用盐酸水溶液调PH值后析出白色固体，过滤并收集滤饼，将滤饼溶于异丙醇中，搅拌并滴加氢氧化钾乙醇溶液，监控体系PH值，体系中慢慢有白色固体物析出，过滤，滤饼干燥得到白色固体产品，即为棕榈酰辅酶A钾盐。

上述技术方案中，在步骤S1中，将棕榈酸和乙酸酐加入到反应烧瓶中，室温下搅拌反应1小时，然后慢慢加热升温至回流状态，保持回流反应1小时，直到反应体系呈黄色透明溶液。

上述技术方案中，在步骤S1中，除去过量的乙酸酐后，将剩余物过滤，滤饼用适量无水乙醚冲洗一遍，抽干后在40℃真空干燥2小时，得到白色固体物。

上述技术方案中，在步骤S2中，将棕榈酸酐和溶剂丙酮加入到一个三口反应瓶中，室温搅拌下，投入等摩尔质量的N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐及2倍摩尔质量的三乙胺，加热，使反应体系保持回流状态2-3小时，停止加热，自然降温至室温下，反应混合物经后处理得到棕榈酸二甲胺基乙巯酯。

上述技术方案中，在步骤S3中，将甲醇和所述棕榈酸二甲胺基乙巯酯搅拌、冰浴控温，使体系温度在0～5°，开始通过恒压滴液漏斗滴加1.2～1.3当量的碘甲烷，滴加完毕后，撤掉冰水浴，在室温下搅拌反应4～5小时，反应完成，进行后处理：反应液浓缩1/3，倾倒到无水乙醚液中，有淡黄色固体物析出，过滤，滤饼用乙醚洗涤两遍，得到碘化硫代棕榈酰胆碱的粗产品，该粗产品用甲醇与丙酮的混合溶剂进行重结晶，得到白色固体产品，测其熔点为213～215℃。

上述技术方案中，在步骤S4中，将定量的辅酶A加入到一250ml单口瓶中，体系外用冰水浴控温，加入磷酸盐缓冲溶液，磁力搅拌下，使固体物完全溶解呈透明溶液，随后再投入1.2-1.5当量的碘化硫代棕榈酰胆碱，氮气保护，反应10～12小时，反应结束，反应混合物用1N盐酸水溶液调PH＝3～4，有白色固体物析出，在2-8℃冷冻数小时，过滤，收集滤饼，将该滤饼溶于1N的氢氧化钾水溶液中，再次用1N盐酸水溶液调PH＝3～4，白色固体析出，在2～8℃冷冻数小时，过滤，再次收集滤饼，滤饼溶于异丙醇中，0℃，搅拌下，滴加0.1N的氢氧化钾乙醇溶液，监控体系PH值，当PH＝8.5～9，停止滴加，持续搅拌2小时，随着搅拌的进行，体系中慢慢有白色固体物析出，过滤，滤饼用少量的冷乙醚冲洗一次，滤饼在35℃下真空干燥2小时，得到棕榈酰辅酶A钾盐。

本发明提供的棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法，通过引入巯酯置换反应，有效降低了副反应，仅需要四步化学反应，经过一步纯化后，能得到纯度在95％的棕榈酰辅酶A钾盐产品，原料便宜，工艺简单，便于实施，利于规模化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明具体实施方式中酶液吸光度变化图；

图2为其他工艺的酶液吸光度变化图。

具体实施方式

下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

作为实施例所示的棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法，包括以下步骤：S1、棕榈酸酐的合成：将棕榈酸和乙酸酐进行反应，反应体系呈黄色透明溶液，静置降温至室温，随后旋蒸除去过量的乙酸酐，得到白色固体物，即为棕榈酸酐；S2、棕榈酸二甲胺基乙巯酯的合成：将制备的所述棕榈酸酐和溶剂丙酮二者混合，再加入N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐及三乙胺，加热反应后得到淡黄色油状液体产品，即为棕榈酸二甲胺基乙巯酯；S3、棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物的合成：反应瓶中，依次加入甲醇和所述棕榈酸二甲胺基乙巯酯，搅拌并恒温，再加入碘甲烷，反应完成经过后处理，得到碘化硫代棕榈酰胆碱的粗产品，该粗产品用甲醇与丙酮的混合溶剂进行重结晶，得到白色固体产品，即为棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物；S4、棕榈酰辅酶A钾盐的合成：将定量的辅酶A与棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物反应得到反应混合物，反应混合物用盐酸水溶液调PH值后析出白色固体，过滤并收集滤饼，将滤饼溶于异丙醇中，搅拌并滴加氢氧化钾乙醇溶液，监控体系PH值，体系中慢慢有白色固体物析出，过滤，滤饼干燥得到白色固体产品，即为棕榈酰辅酶A钾盐。

本发明所提到的发光物质化学结构如下：

反应机理如下：

具体步骤如下：

1、棕榈酸酐的合成：将棕榈酸和乙酸酐加入到反应烧瓶中，室温下搅拌反应1小时，然后慢慢加热升温至回流状态，保持回流反应1小时，反应体系呈黄色透明溶液，静置降温至室温，随后旋蒸除去过量的乙酸酐，剩余物过滤，滤饼用适量无水乙醚冲洗一遍，抽干后在40℃真空干燥2小时，得到白色固体物，即为棕榈酸酐。

2、棕榈酸二甲胺基乙巯酯的合成：将上步制备的棕榈酸酐和溶剂丙酮加入到一三口反应瓶中，室温搅拌下，投入等摩尔质量的N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐及2倍摩尔质量的三乙胺，加热，使反应体系保持回流状态2-3小时，停止加热，自然降温至室温下，反应混合物经后处理得到淡黄色油状液体产品。

3、棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物的合成：反应瓶中，依次加入甲醇和棕榈酸二甲胺基乙巯酯，搅拌、冰浴控温，使体系温度在0～5°，开始通过恒压滴液漏斗滴加1.2～1.3当量的碘甲烷。滴加完毕后，撤掉冰水浴，在室温下搅拌反应4～5小时，反应完成。后处理：反应液浓缩1/3，倾倒到无水乙醚液中，有淡黄色固体物析出，过滤，滤饼用乙醚洗涤两遍，得到碘化硫代棕榈酰胆碱的粗产品。该粗产品用甲醇与丙酮的混合溶剂进行重结晶，得到白色固体产品，测熔点：213～215℃。

4、棕榈酰辅酶A钾盐的合成：将定量的辅酶A(CoASH)加入到一250ml单口瓶中，体系外用冰水浴控温，加入磷酸盐缓冲溶液，磁力搅拌下，使固体物完全溶解呈透明溶液，随后再投入1.2-1.5当量的碘化硫代棕榈酰胆碱，氮气保护，反应10～12小时，反应结束。反应混合物用1N盐酸水溶液调PH＝3～4，有白色固体物析出，在2-8℃冷冻数小时，过滤，收集滤饼。将该滤饼溶于1N的氢氧化钾水溶液中，再次用1N盐酸水溶液调PH＝3～4，白色固体析出，在2～8℃冷冻数小时，过滤，再次收集滤饼。滤饼溶于异丙醇中，0℃，搅拌下，滴加0.1N的氢氧化钾乙醇溶液，监控体系PH值，当PH＝8.5～9，停止滴加，持续搅拌2小时。随着搅拌的进行，体系中慢慢有白色固体物析出。过滤，滤饼用少量的冷乙醚冲洗一次，滤饼在35℃下真空干燥2小时，得到白色固体产品棕榈酰辅酶A钾盐。

以下是一份就本发明的完整实验报告：

1、实验材料

1)棕榈酸(AR,阿拉丁公司)

2)乙酸酐(AR,阿拉丁公司)

3)辅酶A(AR,Roche公司)

4)N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐(AR，Sigma公司)

2、试验方法、数据和结果

1)、棕榈酸酐的合成

在一250ml三口反应瓶中，配备加热回流冷凝装置，加入10g棕榈酸及120ml乙酸酐，室温下搅拌反应一小时，然后慢慢加热升温至回流状态，保持回流反应1小时，反应体系呈黄色透明溶液，静置降温至室温，随后旋蒸除去过量的乙酸酐，剩余物过滤，抽干后在40℃真空干燥2小时，得到近乎白色固体物7.2g，即为棕榈酸酐粗产品。

纯化：将上述制备的7.2g棕榈酸酐用150ml石油醚进行重结晶纯化，结晶液在-20°冷冻结晶4～5小时，慢慢有白色固体产品析出，过滤，滤饼用适量无水乙醚冲洗一遍，充分抽干后在40℃真空干燥2小时，得到白色纯净固体产品5.0g，测熔点63.5～65.5℃(怕潮，应迅速密封保存备用)。

2)、棕榈酸二甲胺基乙巯酯的合成

150ml三口反应瓶中，加入2.5g棕榈酸酐(5mmol)，75ml丙酮，室温下搅拌5分钟，固体物完全溶解，然后再投入0.71g(5mmol)N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐和1.5ml三乙胺，加热，使反应体系保持回流状态2.5小时，反应结束，停止加热，自然降温。

后处理：反应混合物减压旋蒸除去溶剂丙酮，加入80ml乙酸乙酯，分别用等体积1N稀盐酸，5％碳酸氢钠水溶液冲洗，最后用去离子水冲洗至水洗液呈中性，分层，有机相用无水硫酸镁干燥处理，分离干燥剂，旋蒸溶剂，得到淡黄色油状液体1.2g。

3)、棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物的合成

在一150ml三口反应瓶中，加入60ml甲醇和1.7g(5mmol)上步制备的棕榈酸二甲胺基乙巯酯，磁力搅拌、冰浴控温，使体系温度在0～5°，慢慢滴入碘甲烷0.85g(6mmol)。滴加完毕后，撤掉冰水浴，在室温下搅拌反应4小时，反应完成。

后处理：反应液浓缩1/3，倾倒到80ml无水乙醚液中，有淡黄色固体物析出，过滤，滤饼用少量乙醚洗涤两遍，充分抽滤，50℃真空干燥后，得到棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物的粗产品2.1g。该粗产品1:1甲醇与丙酮的混合溶剂50ml进行重结晶，得到白色固体产品1.6g，熔点：175～177℃

4)、棕榈酰辅酶A钾盐的合成

250ml单口瓶，外用冰水浴控温0～5℃，加入0.75g(1mmol)辅酶A，50ml水，磁力搅拌5分钟，使固体物完全溶解呈透明溶液，随后再投入0.63g(1.3mmol)上步制备的中间体，氮气保护下，搅拌反应12小时。反应结束。

反应混合物用1N盐酸水溶液调PH＝3～4，有白色固体物析出，在2-8℃冷冻数小时，过滤，收集滤饼。将该滤饼溶于1N的氢氧化钾水溶液中，再次用1N盐酸水溶液调PH＝3～4，白色固体析出，在2～8℃冷冻数小时，过滤，再次收集滤饼。

滤饼溶于异丙醇中，0℃，搅拌下，慢慢滴加0.1N的氢氧化钾乙醇溶液，监控体系PH值，当PH＝8.5～9，停止滴加，持续搅拌2小时。随着搅拌的进行，体系中慢慢有白色固体物析出。过滤，滤饼用少量的冷乙醚冲洗一次，滤饼在35℃下真空干燥2小时，得到白色固体产品棕榈酰辅酶A钾盐0.46g，收率45％。

6、应用验证试验

棕榈酰辅酶A钾盐在乙酰辅酶A氧化酶的酶活力检测上的应用试验。

实验方法简述：

R1试剂——10mg棕榈酰辅酶A钾盐溶于2mL(PH＝7.6)磷酸盐缓冲液。

1.R2试剂

名称	用量
		苯酚	0.5g
Tris Ultra Pure	20g
		水	800mL

800mL水中依次溶入上述试剂，用HCl调节pH至8.0±0.05(25℃),加水定容至1L。

3.实验操作方法：

(1)按“R1+R2＝900ul+100ul”添加至“d＝1.0cm，容积为1500ul”的石英比色皿中(注意液面高度)，充分混匀，记录500nm下的吸光度OD500初，37℃温育反应至2min。

(2)在120s时，加入20ul酶稀释液，充分混合均匀，37℃继续反应至6min(360s)；记录第4-5min(240s-300s)内OD500初的变化，并计算每分钟吸光值变化ΔAb/min。

(3)混合液初始吸光度OD500初应该小于0.08。ΔAb/min应小于0.03(显示酶活小于20U/L)，否则酶稀释液可能被污染，需更换，或者是比色皿被污染，需用重新清洗。

(4)若符合要求，则可以进行酶活检测。

(5)重复(1)-(2)步骤，用20ul稀释后酶液代替酶稀释液测定酶液吸光度变化(ΔAs/min)。

该工艺如图1所示，其他工艺如图2所示。

从上述实验图谱不难看出，该工艺合成的棕榈酰辅酶A钾盐原料纯度较高，使乙酰辅酶A的活力检测准确，反应度良好，且手动方法得到的图谱更加平滑，稳定，对酶活度实验方法的研究探索极具优势，有着不可或缺的意义。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、棕榈酸酐的合成：将棕榈酸和乙酸酐进行反应，反应体系呈黄色透明溶液，静置降温至室温，随后旋蒸除去过量的乙酸酐，得到白色固体物，即为棕榈酸酐；

S2、棕榈酸二甲胺基乙巯酯的合成：将制备的所述棕榈酸酐和溶剂丙酮二者混合，再加入N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐及三乙胺，加热反应后得到淡黄色油状液体产品，即为棕榈酸二甲胺基乙巯酯；

S3、棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物的合成：反应瓶中，依次加入甲醇和所述棕榈酸二甲胺基乙巯酯，搅拌并恒温，再加入碘甲烷，反应完成经过后处理，得到棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物的粗产品，该粗产品用甲醇与丙酮的混合溶剂进行重结晶，得到白色固体产品，即为棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物；

S4、棕榈酰辅酶A钾盐的合成：将定量的辅酶A与棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物反应得到反应混合物，反应混合物用盐酸水溶液调pH值后析出白色固体，过滤并收集滤饼，将滤饼溶于异丙醇中，搅拌并滴加氢氧化钾乙醇溶液，监控体系pH值，体系中慢慢有白色固体物析出，过滤，滤饼干燥得到白色固体产品，即为棕榈酰辅酶A钾盐。

2.根据权利要求1所述的棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法，其特征在于：在步骤S1中，将棕榈酸和乙酸酐加入到反应烧瓶中，室温下搅拌反应1小时，然后慢慢加热升温至回流状态，保持回流反应1小时，直到反应体系呈黄色透明溶液。

3.根据权利要求1所述的棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法，其特征在于：在步骤S1中，除去过量的乙酸酐后，将剩余物过滤，滤饼用适量无水乙醚冲洗一遍，抽干后在40℃真空干燥2小时，得到白色固体物。

4.根据权利要求1所述的棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法，其特征在于：在步骤S2中，将棕榈酸酐和溶剂丙酮加入到一个三口反应瓶中，室温搅拌下，投入等摩尔质量的N,N-二甲基乙硫醇盐酸盐及2倍摩尔质量的三乙胺，加热，使反应体系保持回流状态2-3小时，停止加热，自然降温至室温下，反应混合物经后处理得到棕榈酸二甲胺基乙巯酯。

5.根据权利要求4所述的棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法，其特征在于：在步骤S3中，将甲醇和所述棕榈酸二甲胺基乙巯酯搅拌、冰浴控温，使体系温度在0～5℃，开始通过恒压滴液漏斗滴加1.2～1.3当量的碘甲烷，滴加完毕后，撤掉冰水浴，在室温下搅拌反应4～5小时，反应完成，进行后处理：反应液浓缩1/3，倾倒到无水乙醚液中，有淡黄色固体物析出，过滤，滤饼用乙醚洗涤两遍，得到棕榈酰三甲胺基乙巯酯碘化物的粗产品，该粗产品用甲醇与丙酮的混合溶剂进行重结晶，得到白色固体产品，测其熔点为213～215℃。

6.根据权利要求1所述的棕榈酰辅酶A钾盐的化学合成方法，其特征在于：在步骤S4中，将定量的辅酶A加入到一250ml单口瓶中，体系外用冰水浴控温，加入磷酸盐缓冲溶液，磁力搅拌下，使固体物完全溶解呈透明溶液，随后再投入1.2-1.5当量的碘化硫代棕榈酰胆碱，氮气保护，反应10～12小时，反应结束，反应混合物用1N盐酸水溶液调pH=3～4，有白色固体物析出，在2-8℃冷冻数小时，过滤，收集滤饼，将该滤饼溶于1N的氢氧化钾水溶液中，再次用1N盐酸水溶液调pH=3～4，白色固体析出，在2～8 ℃冷冻数小时，过滤，再次收集滤饼，滤饼溶于异丙醇中，0℃，搅拌下，滴加0.1N的氢氧化钾乙醇溶液，监控体系pH值，当pH=8.5～9，停止滴加，持续搅拌2小时，随着搅拌的进行，体系中慢慢有白色固体物析出，过滤，滤饼用少量的冷乙醚冲洗一次，滤饼在35℃下真空干燥2小时，得到棕榈酰辅酶A钾盐。