CN109810157B - 一种β-葡萄糖醛酸苷酶沉淀型荧光底物合成方法 - Google Patents

一种β-葡萄糖醛酸苷酶沉淀型荧光底物合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于2‑(苯并噻唑‑2'‑基)‑4‑溴苯酚的β‑葡萄糖醛酸苷酶沉淀型荧光底物合成方法。该合成方法包括以下三步反应：1)糖基化反应；2)芳环化反应；3)脱保护基反应。该合成方法中每一步反应产率均可达中等以上，最高超过90％，价格或制备成本相对高的物料反应转化率相对较高，三步总产率可达37％，而且反应条件温和，易于实施。同时该合成方法中的糖基化反应步骤和脱保护基反应步骤可应用于以4‑甲基伞形酮为糖基受体合成常见荧光底物4‑甲基伞形酮基‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷，两步反应产率分别可达51％、89％，总产率可达约45％。

Description

一种β-葡萄糖醛酸苷酶沉淀型荧光底物合成方法
技术领域
本发明涉及有机合成与酶分析技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖醛酸苷酶沉淀型荧光底物合成方法。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)被普遍视为与食品、水、饲料、临床和环境样本卫生质量、清洁程度或致病风险密切相关的粪便污染指示菌。由于绝大部分(96～98％)E.coli具有β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)活性，而具有该酶活性的non-E.coli细菌相当少，β-葡萄糖醛酸苷酶已被人们用作检测E.coli的生物标记物。尽管肠道出血性(或产志贺毒素)E.coli中最主要的致病血清型E.coli O157不具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性，但也可通过检测该酶活性而将它与non-O157E.coli加以区分。因此，基于合成底物与β-葡萄糖醛酸苷酶特异性反应的可视化检测技术已被广泛用于检测E.coli。
检测或分析β-葡萄糖醛酸苷酶，这除了可应用于检测E.coli之外，在植物分子生物学、应用微生物学和药物开发等领域中也具有重要的应用价值。例如，由于E.coli编码β-葡萄糖醛酸苷酶的基因(gusA)在微生物、植物等基因工程研究中被常用作报告基因，因此可通过分析gusA表达产物β-葡萄糖醛酸苷酶以确认目的基因的时空表达模式(Myronovskyi et al.,Applied and Environmental Microbiology,2011,77:5370-5383；Jefferson et al.,Embo Journal,1987,6:3901-3907；Xiong et al.,Critical Reviewsin Biotechnology,2012,32:133-142.)。此外，在人体正常组织中，β-葡萄糖醛酸苷酶仅表现出溶酶体活性，若缺少该酶则会导致粘多糖病VII型，而在肿瘤胞外微环境、神经炎症部位细胞外间隙呈现出过高水平表达，因此对β-葡萄糖醛酸苷酶分析也有助于诊断粘多糖病VII型以及肿瘤、神经炎症所在部位(Naz et al.,Rejuvenation Research,2013,16:352；Rempel et al.,Molecular Imaging,2017,16:1-30；Tronel et al.,InternationalJournal of Molecular Sciences,2017,18:802.)，或者利用其开发相关的靶向前药(Nazet al.,Rejuvenation Research,2013,16:352；Tranoy-Opalinski et al.,EuropeanJournal of Medicinal Chemistry,2014,74:302-313；Joubert et al.,EuropeanJournal of Medicinal Chemistry,2017,142:393-415.)。而由于在对酶分析方法中，最简单和最可行的是基于合成底物的分析方法(Reymond et al.,Chemical Communications,2009,34–46)，因此β-葡萄糖醛酸苷酶新型合成底物的开发及其相关高效合成方法的发展，对于E.coli检测以及其它研究领域都是很有意义的。
在分析大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶所用的合成底物中，最常见的一种荧光底物是4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)(Frampton et al.,Journal of AppliedBacteriology,1993,74:223-233；Manafi M.,International Journal of FoodMicrobiology,1996,31:45-58；Rompréet al.,Journal of Microbiological Methods,2002,49:31-54.)。然而，MUG被酶水解而释放出的荧光物4-甲基伞形酮可溶于水，并易于从反应位点扩散离去，这种扩散性问题会导致它在应用于琼脂培养基中时，使目标菌附近的杂菌也容易染上荧光物，从而使目标菌不易与杂菌辨别开来，因此也制约了它在固体培养基中的广泛应用。此外，酸性条件会导致它产生的荧光信号减弱，因此它通常需要在中性至偏碱性条件下应用(Frampton et al.,Journal of Applied Bacteriology,1993,74:223-233；Manafi M.,International Journal of Food Microbiology,1996,31:45-58；ManafiM.,International Journal of Food Microbiology,2000,60:205-218.)。尽管能产生更强荧光信号和可适用于偏酸性条件下的基于甲基伞形酮衍生物的其它荧光底物已被发展出来(Briciu-Burghina et al.,Analyst,2015,140:5953-5964；Perry et al.,Journalof Applied Microbiology,2006,101:977-985；Heery et al.,Talanta,2016,148:75-83.)，但是它们也仍然存在扩散性问题。目前基于5-溴-4-氯-3-吲哚酚(X)、5-溴-6-氯-3-吲哚酚(Magenta)等吲哚酚衍生物的β-glucuronidase沉淀型显色底物可以克服扩散性问题，它们尤其是5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷(X-glucuronide，X-Gluc)已被广泛应用于显色培养基中(Manafi M.,International Journal of Food Microbiology,1996,31:45-58；Manafi M.,International Journal of Food Microbiology,2000,60:205-218.)。这类吲哚酚基显色底物被酶解后可生成难溶于水、定位较好的靛蓝信号产物，但其产色过程是间接性的，因被酶解后释放的吲哚酚类色原需要在有氧甚至还需要铁氰化物/亚铁氰化物等助氧化剂存在的条件下才可自动发生两分子偶合而生成靛蓝信号产物，并且酸性条件也可能会不利于其产色(Kiernan J.A.,Biotechnic&Histochemistry,2007,82:73-103.)。而仅仅依靠显色底物已不能解决所有检测问题。当需要在同一琼脂培养基中辨析多种酶/菌时，若仅仅依靠不同显色底物或色泽变化，则容易导致颜色繁多、各种酶/菌之间区分不明显而难以辨析的。
目前有关能给出不溶于水、定位性能好的信号产物的β-葡萄糖醛酸苷酶沉淀型荧光底物研究报道仍然极少。尽管已有基于2-(2'-羟基苯基)-4(3H)-喹唑啉酮(HPQ)衍生物的β-葡萄糖醛酸苷酶沉淀型荧光底物被报道(Haugland et al.,1994,U.S.PatentNo.5316906；Zhou et al.,Journal of Biochemical&Biophysical Methods,1996,33:197-205；Diwu et al.,Tetrahedron,1997,53:7159-7164.)，但其合成非常困难，相关应用研究也极不充分，而在对E.coli活体检测应用上更是缺乏报道。目前，基于2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的一些糖苷酶沉淀型荧光底物已被合成出来，例如相应的β-葡萄糖苷(Wei et al.,Chemical Communications,2017,53:103-106.)、β-半乳糖苷(Otsubo etal.,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2013,23:2245–2249.)、β-纤维糖苷(Ivanen et al.,Journal of Microbiological Methods,2009,76,295–300.)、唾液酸苷(Minami et al.,PLoS One,2014,9:e81941.)。然而，由于与相应的β-葡萄糖苷等相比，β-葡萄糖醛酸苷要更难以合成(Stachulski et al.,Natural Product Reports,1998,15:173-186；Wei et al.,Molecules,2015,20:21681–21699.)，上述基于2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的糖苷合成方法对于相应的β-葡萄糖醛酸苷合成却未必可行。对基于2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯酚的β-葡萄糖醛酸苷合成，本发明团队也曾尝试以2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯酚为糖基受体、三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯为糖基供体，并采用已报道的相应β-葡萄糖苷合成方法——固液相转移催化法(Wei et al.,ChemicalCommunications,2017,53:103-106.)进行糖基化反应研究，但发现糖基供体主要发生了1,2-消除HBr副反应，目标物得率非常低(＜20％)；而采用氧化银(或碳酸铯)/乙腈条件进行糖基化反应时，目标物得率也仍然很低(＜30％)。此外，对于获得的含有保护基β-葡萄糖醛酸苷，由于它含有甲氧基、乙酰基两种不同保护基，且在脱保护基反应中可能会发生糖环4,5-位脱水副反应，导致其脱保护基反应处理相对更麻烦(Stachulski et al.,NaturalProduct Reports,2013,30:806-848.)；为减少难以分离的副产物产生，有研究者甚至采用剧毒的KCN作为脱保护基反应催化剂，但也比较容易产生难以分离的杂质而导致在用于核磁共振波谱分析前需要过柱子纯化(Perry et al.,Journal of Applied Microbiology,2010,101:977-985；Diwu et al.,Tetrahedron,1997,53:7159-7164；Haugland et al.,1994,U.S.Patent No.5316906.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种相对高效和简便的基于2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯酚的β-葡萄糖醛酸苷酶沉淀型荧光底物合成方法。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种基于2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯酚的2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，该合成方法包括以下三步反应步骤：
S1:以5-溴水杨醛(Ⅰ)为糖基受体，三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯(Ⅱ)为糖基供体进行糖基化反应，得到中间体A(Ⅲ)；
S2:将S1得到的中间体A(Ⅲ)和2-氨基苯硫酚(Ⅳ)，进行芳环化反应，得到中间体B(Ⅴ)；
S3:将中间体B(Ⅴ)于含碳酸钾和微量水的二氯甲烷和甲醇混合体系中进行脱保护基反应，酸化后得到目标荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(Ⅵ)。
上述的合成方法的路线大致如图1所示。
上述的合成方法中，所述的糖基化反应是在以氧化银为催化剂、添加有4A分子筛干燥剂、以无水乙腈为反应溶剂、室温条件下进行的，所述的5-溴水杨醛和氧化银在投料摩尔量上均多于三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯，糖基化反应时间为3h。
优选，所述的5-溴水杨醛：氧化银：三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯的摩尔(物质的量)比为1.7:1.2:1.0。
所述的芳环化反应是在以体积比为1:1的甲醇和四氢呋喃的混合液为反应溶剂、65～70℃加热回流条件下进行的，2-氨基苯硫酚在投料摩尔量上多于中间体A，芳环化反应时间为24h。
优选，所述的2-氨基苯硫酚：中间体A的摩尔比为1.1:1.0。
所述的脱保护基反应中碳酸钾和微量水是分两个时间段控制的，第一个时间段为4h，在第一个时间段期间，碳酸钾相对于中间体B的投料量为大于0.6摩尔当量，水的投料量为0；第二个时间段为24h，在第二个时间段期间，碳酸钾相对于中间体B的投料量为不小于1.0摩尔当量，水的投料量为3摩尔当量，两个时间段的反应温度均为0～5℃。
优选，在第一个时间段期间，碳酸钾相对于中间体B的投料量为1.0摩尔当量，在第二个时间段期间，碳酸钾相对于中间体B的投料量为1.2摩尔当量。
上述糖基化反应方法和脱保护基反应方法可应用于以4-甲基伞形酮为糖基受体合成常见荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)。
一种荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，包括以下步骤：
S1:以4-甲基伞形酮(Ⅶ)为糖基受体，三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯(Ⅱ)为糖基供体进行糖基化反应，得到中间体C(Ⅷ)；
S2:将中间体C(Ⅷ)于含碳酸钾和微量水的二氯甲烷和甲醇混合体系中进行脱保护基反应，酸化后得到目标荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷。
所述的糖基化反应是在以氧化银为催化剂、添加有4A分子筛干燥剂、以无水乙腈为反应溶剂、室温条件下进行的，所述的4-甲基伞形酮和氧化银在投料摩尔量上均多于三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯，糖基化反应时间为3h；优选，所述的4-甲基伞形酮：氧化银：三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯的摩尔比为1.7:1.2:1.0。
所述的脱保护基反应中碳酸钾和微量水是分两个时间段控制的，第一个时间段为4h，在第一个时间段期间，碳酸钾相对于中间体C的投料量为大于0.6摩尔当量，水的投料量为0；第二个时间段为24h，在第二个时间段期间，碳酸钾相对于中间体C的投料量为不小于1.0摩尔当量，水的投料量为3摩尔当量，两个时间段的反应温度均为0～5℃。优选，在第一个时间段期间，碳酸钾相对于中间体C的投料量为1.0摩尔当量，在第二个时间段期间，碳酸钾相对于中间体C的投料量为1.2摩尔当量。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明的合成方法每一步反应产率均可达中等以上，最高超过90％，价格或制备成本相对高的物料(例如糖基供体与各步骤目标中间体)反应转化率相对较高，三步总产率可达37％，而且反应条件温和，易于实施。
(2)本发明的合成方法中的糖基化反应步骤和脱保护基反应步骤可应用于以4-甲基伞形酮为糖基受体合成常见荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)，两步反应产率分别可达51％、89％，总产率可达约45％。
附图说明
图1为目标荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(Ⅵ)的合成路线。
图2为实施例1的2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(Ⅵ)的合成路线。
图3为实施例2的4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)的合成路线。
图4为2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(Ⅵ；BTBP-Gluc)的核磁共振氢谱。
图5为2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(Ⅵ；BTBP-Gluc)的核磁共振碳谱。
图6为4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)的核磁共振氢谱。
图7为4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)的核磁共振碳谱。
图8为不同荧光底物的对大肠杆菌ATCC 25922的对比检测效果图，其中A为目标荧光底物BTBP-Gluc组；B为常用荧光底物MUG组；C为无荧光底物组。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1 2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(BTBP-Gluc)的合成
一种基于2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯酚的2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，包括以下步骤
(1)糖基化反应
将1.709g(8.50mmol)5-溴水杨醛(Ⅰ)、1.986g(5.00mmol)三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯(Ⅱ)、1.391g(6.00mmol)氧化银置于含有4.0g粉末状4A分子筛的40mL干燥乙腈中，于氩气氛围、避光和室温条件下搅拌反应3h。然后，将反应混合物用装填有致密的300-400目柱层层析硅胶层的砂芯漏斗抽滤，用二氯甲烷和乙酸乙酯混合液(v/v＝2/1)洗涤，合并洗脱液并减压旋蒸去除溶剂，用甲醇重结晶，干燥得到约1.345g(产率约52％)目标中间体A(结构式为式Ⅲ)。
Figure BDA0001889564530000081
1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ＝10.25(s,1H),7.94(s,1H),7.65(d,J＝8.5Hz,1H),7.04(d,J＝8.8Hz,1H),5.36(m,3H),5.23(d,J＝5.5Hz,1H),4.22(d,J＝7.7Hz,1H),3.73(s,3H),2.06(s,6H),2.05(s,3H)ppm.13C-NMR(126MHz,CDCl3):δ＝187.63,169.93,169.28,169.09,166.50,157.35,138.28,131.08,127.57,118.17,116.91,98.92,72.69,71.27,70.63,68.81,53.11,20.57,20.54,20.48ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]+Calcd.forC20H21BrNaO11:539.0159；found:539.0163。
(2)芳环化反应
将1.035g(2.00mmol)中间体A(Ⅲ)、241μL(2.20mmol)2-氨基苯硫酚(Ⅳ)置于20mL甲醇和四氢呋喃混合溶剂(v/v＝1/1)中，加热回流(65～70℃)下搅拌反应24h。于45℃水浴下减压旋蒸浓缩，抽滤，用乙酸乙酯重结晶，干燥得到约1.149g(产率约92％)目标中间体B(结构式为式Ⅴ)。
Figure BDA0001889564530000091
1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.65(s,1H),8.10(d,J＝8.0Hz,1H),7.94(d,J＝8.0Hz,1H),7.55(d,J＝8.7Hz,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.41(t,J＝7.5Hz,1H),7.11(d,J＝8.8Hz,1H),5.52(t,J＝8.0Hz,1H),5.45(t,J＝9.3Hz,1H),5.39(d,J＝7.5Hz,1H),5.35(t,J＝9.3Hz,1H),4.27(d,J＝9.4Hz,1H),3.71(s,3H),2.06(s,3H),2.05(s,3H),1.81(s,3H)ppm.13C-NMR(126MHz,CDCl3):δ＝170.12,169.29,166.59,160.77,153.03,151.80,136.10,134.35,132.49,126.37,125.41,125.19,123.14,121.39,116.95,116.55,98.97,72.85,72.08,71.10,68.70,53.11,20.61,20.55,20.52ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]+Calcd.for C26H25BrNO10S:622.0377；found:622.0375。
(3)脱保护基反应
将0.500g(0.80mmol)中间体B(Ⅴ)置于30mL无水甲醇和二氯甲烷混合溶剂(v/v＝1/1)中，冰水浴冷却，搅拌下加入0.111g(0.80mmol,1.0e.q.)碳酸钾，冰水浴(0～5℃)下搅拌反应4h。接着，再加入0.134g(0.970mmol,1.2e.q.)碳酸钾和44μL(3e.q.)水，于冰水浴(0～5℃)下再反应12h，然后补加10mL甲醇和二氯甲烷混合溶剂(v/v＝1/1)，并再反应12h。接着，加入30mL四氢呋喃和甲醇混合溶剂(v/v＝2/1)，于冰水浴和快速搅拌下加入AmberliteIR-120(H+)氢型阳离子交换树脂调pH值至约4.5，抽滤，用四氢呋喃充分洗涤树脂，抽滤，合并滤液并于40℃水浴下减压旋蒸去除溶剂，加入少量乙腈搅拌，再加入二氯甲烷充分搅拌，抽滤，将固体再用二氯甲烷浸泡和充分搅拌，抽滤，少量乙腈洗涤固体，将所得固体干燥后，得到约0.303g(产率约78％)的最终目标荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(结构式为式Ⅵ；BTBP-Gluc)。
Figure BDA0001889564530000101
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝8.55(s,1H),8.13(d,J＝8.1Hz,1H),8.10(d,J＝8.0Hz,1H),7.73(d,J＝8.4Hz,1H),7.57(t,J＝7.2Hz,1H),7.48(t,J＝6.7Hz,1H),7.38(d,J＝8.5Hz,1H),5.55(d,J＝4.5Hz,1H),5.46(d,J＝7.5Hz,1H),5.39(s,1H),4.03(d,J＝9.5Hz,1H),3.65-3.68(m,1H),3.45(t,J＝9.3Hz,1H),3.42-3.35(m,2H)ppm.13C-NMR(126MHz,DMSO-d6):δ＝169.98,160.68,153.49,151.34,135.92,134.39,130.63,126.45,125.38,123.69,122.76,121.87,117.22,113.94,99.77,76.02,75.45,72.89,71.25ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]+Calcd.for C19H17BrNO7S:481.9904；found:481.9906。
上述方法中糖基化反应的产率为52％，芳环化反应的的产率为92％，脱保护基反应的产率为78％，总产率约为37％。
上述的基于2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯酚的2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法的路线如图2所示。
得到的目标荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(Ⅵ；BTBP-Gluc)的核磁共振氢谱数据和碳谱数据分别如图4、图5所示。
实施例2 4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)的合成
一种荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，包括以下步骤：
(1)糖基化反应
将0.529g(3.00mmol)4-甲基伞形酮(Ⅶ)、0.794g(2.00mmol)三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯(Ⅱ)、0.556g(2.40mmol)氧化银置于含有1.6g粉末状4A分子筛的16mL干燥乙腈中，于氩气氛围、避光和室温条件下搅拌反应3h。然后，将反应混合物用装填有致密的300-400目柱层层析硅胶层的砂芯漏斗抽滤，用二氯甲烷和乙酸乙酯混合液(v/v＝2/1)洗涤，合并洗脱液并减压旋蒸去除溶剂，用甲醇重结晶，干燥得到约0.506g(产率约51％)目标中间体C(结构式为式Ⅷ)。
Figure BDA0001889564530000111
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ＝7.53(d,J＝9.4Hz,1H),6.91-6.95(m,2H),6.20(s,1H),5.42-5.19(m,4H),4.28-4.17(m,1H),3.74(s,3H),2.41(s,3H),2.07(s,3H),2.06(s,3H),2.06(s,3H)ppm.13C-NMR(75MHz,CDCl3)δ220.08,193.86,170.02,169.37,169.19,166.62,160.79,159.02,154.74,152.22,125.80,115.65,113.89,113.22,104.15,98.26,77.50,77.08,76.65,72.56,71.61,70.79,68.88,53.09,20.60,20.60,20.50,18.69ppm。
(2)脱保护基反应
将0.500g(1.02mmol)中间体C(Ⅷ)置于30mL无水甲醇和二氯甲烷混合溶剂(v/v＝1/1)中，冰水浴冷却，搅拌下加入0.141g(1.02mmol,1.0e.q.)碳酸钾，冰水浴(0～5℃)下搅拌反应4h。接着，再加入0.169g(1.22mmol,1.2e.q.)碳酸钾和55μL(3e.q.)水，于冰水浴(0～5℃)下再反应12h，然后补加10mL甲醇和二氯甲烷混合溶剂(v/v＝1/1)，并再反应12h。接着，加入30mL甲醇，于冰水浴和快速搅拌下加入Amberlite IR-120(H+)氢型阳离子交换树脂调pH值至约4.5，抽滤，用甲醇充分洗涤树脂，抽滤，合并滤液并于40℃水浴下减压旋蒸去除溶剂，加入乙醚搅拌后静置，捣碎固体，抽滤，依次用乙醚、少量乙腈洗涤固体，将所得固体干燥后，得到约0.320g(产率约89％)的最终目标产物4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)。
Figure BDA0001889564530000121
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝7.71(d,J＝8.0Hz,1H),7.16–6.95(m,2H),6.25(s,1H),5.52(s,1H),5.21(d,J＝5.4Hz,1H),3.95(d,J＝8.5Hz,1H),3.36–3.30(m,5H),2.40(s,3H)ppm.13C-NMR(126MHz,DMSO-d6):δ＝170.14,160.07,159.69,154.40,153.32,126.56,114.25,113.25,111.82,103.06,99.33,75.75,75.26,72.83,71.31,18.14ppm。
上述方法中糖基化反应的产率为51％，脱保护基反应的产率为89％，总产率约为45％。
上述的荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法的路线如图3所示。
得到的目标荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)的核磁共振氢谱数据和碳谱数据分别如图6、图7所示。
实施例3不同荧光底物对大肠杆菌ATCC 25922的对比检测效果
采用琼脂平板法检测不同荧光底物对大肠杆菌ATCC 25922的定位效果，具体步骤为：
(1)称取一定量的哥伦比亚琼脂培养基置于干净的三角瓶中，加入定量的蒸馏水，加热预溶解，再分别加入定量的目标荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(BTBP-Gluc)和常用荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)的DMSO溶液，使荧光底物的浓度均为0.2mmol/L，密封并于121℃下高压蒸汽灭菌15min，然后待培养基温度降至45℃左右时，摇匀并在无菌条件下迅速倒平板，水平放置使培养基凝固一段时间后待用。
(2)以大肠杆菌ATCC 25922作为检测目标菌，用接种环蘸取含该菌的LB培养液，分别划线接种于上述含不同荧光底物的哥伦比亚琼脂培养基上，于37℃下有氧下培养24h，然后在365nm紫外光下观察不同荧光底物对大肠杆菌ATCC 25922定位效果，并设置无荧光底物组作为比较，结果见图8。
图8中，A为目标荧光底物BTBP-Gluc(2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷)组；B为常用荧光底物MUG组(4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷)；C为无荧光底物组。从本发明目标荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(Ⅵ；BTBP-Gluc)与常用荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)对大肠杆菌ATCC25922的对比检测效果中，可以发现本发明目标荧光底物无扩散性性，对大肠杆菌菌落的定位效果好，利于辨别；而与此相反的是MUG存在显著的扩散性问题。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:以5-溴水杨醛为糖基受体，三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯为糖基供体进行糖基化反应，得到中间体A；
S2:将S1得到的中间体A和2-氨基苯硫酚，进行芳环化反应，得到中间体B；
S3:将中间体B于含碳酸钾和水的二氯甲烷和甲醇混合体系中进行脱保护基反应，酸化后得到目标荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷。
2.根据权利要求1所述的2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，其特征在于，所述的糖基化反应是在以氧化银为催化剂、添加有4A分子筛干燥剂、以无水乙腈为反应溶剂、室温条件下进行的，所述的5-溴水杨醛和氧化银在投料摩尔量上均多于三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯，糖基化反应时间为3h。
3.根据权利要求2所述的2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，其特征在于，所述的5-溴水杨醛：氧化银：三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯的摩尔比为1.7:1.2:1.0。
4.根据权利要求1所述的2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，其特征在于，所述的芳环化反应是在以体积比为1:1的甲醇和四氢呋喃的混合液为反应溶剂、65～70℃加热回流条件下进行的，2-氨基苯硫酚在投料摩尔量上多于中间体A，芳环化反应时间为24h。
5.根据权利要求4所述的2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，其特征在于，所述的2-氨基苯硫酚：中间体A的摩尔比为1.1:1.0。
6.根据权利要求1所述的2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，其特征在于，所述的脱保护基反应中碳酸钾和水是分两个时间段控制的，第一个时间段为4h，在第一个时间段期间，碳酸钾相对于中间体B的投料量为大于0.6摩尔当量，水的投料量为0；第二个时间段为24h，在第二个时间段期间，碳酸钾相对于中间体B的投料量为不小于1.0摩尔当量，水的投料量为3摩尔当量，两个时间段的反应温度均为0～5℃。
7.根据权利要求6所述的2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成方法，其特征在于，在第一个时间段期间，碳酸钾相对于中间体B的投料量为1.0摩尔当量，在第二个时间段期间，碳酸钾相对于中间体B的投料量为1.2摩尔当量。
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