CN112645809A - 一种基于甲萘醌结构的新型冠状病毒3cl蛋白酶抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗新型冠状病毒的甲萘醌衍生物及其医药用途；所述化合物的结构如式(Ⅰ)所示：

其中，R为氢原子、甲基、乙酰基或羟基，R₁为氢、甲氧基、苄氧基或苯甲酰氧基团。本发明所公开的化合物可抑制2019‑nCoV新型冠状病毒的3CL水解酶，并具有抗新型冠状病毒的活性。体外活性测定实验表明，部分化合物在1μM浓度下，其酶抑制率达90％以上,显著优于阳性对照药物紫草素。细胞水平的毒性测试实验结果表明，本发明的甲萘醌及其衍生物，对于宿主正常细胞HSF细胞的毒性显著低于阳性药物紫草素及胡桃醌，部分化合物在体外显示了较强的抗新型冠状病毒活性，对开发高效低毒的抗新型冠状病毒新药具有重要意义。

Description

一种基于甲萘醌结构的新型冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种基于甲萘醌结构的新型冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂；更具体的，涉及一种甲萘醌衍生物及其在制备抗新型冠状病毒2019-nCoV的药物中的用途。

背景技术

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)是一种具有包膜的正链单股RNA冠状病毒，它引起了近期在全球范围内流行的急性病毒性肺炎(Zhou et al.2020.A pneumonia ou tbreakassociated with a new coronavirus of probable bat origin.Nature,57 9：270-273.)。病毒属于非细胞微生物，主要由外部蛋白质和内部核酸组成，缺乏独立的代谢结构，只能寄生在宿主细胞内，利用宿主细胞的蛋白质、核酸作为其生存和繁殖的必须物质。病毒在宿主细胞内复制核酸，合成蛋白质，再装配在一起构成完整病毒体的繁殖过程称为病毒复制。新型冠状病毒的核酸(RNA)包含近3万个碱基，其基因组编码2个部分重叠的多聚蛋白pp1a及pp1ab(Wu et al.2020.Nature,579：265-269)。病毒复制过程中所必须的功能性蛋白源于病毒3CL蛋白酶(3-Chymotrypsin-like proteas e,3CL^pro)对多聚蛋白的切割，目前已知的剪切位点超过11处；这个蛋白酶也是多聚蛋白的一部分，通过剪切其自身C端的肽键从多聚蛋白中释放(Chen et al.2020.Predic tion of the SARS-CoV-2(2019-nCoV)3C-like protease(3CLpro)structure：virtual screen ing reveals velpatasvir,ledipasvir,and other drug repurposing candidates.F1000Resear ch 9：129)。由于新型冠状病毒的3CL蛋白酶在其复制过程中起着至关重要的作用，同时又通过损伤宿主细胞促进自身繁殖，是抗新型冠状病毒药物研发的重要靶标。

已报道的几种新型冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的结构式如下：

近期，上海药物所与上海科技大学联合攻关团队重点针对已上市药物以及自建的“高成药性化合物数据库”和“药用植物来源化合物成分数据库”进行药物筛选，从超过10000个化合物中，发现了包括天然萘醌紫草素(Shikonin,1)、农药中间体依布硒(Ebselen,2)等在内的多个对新型冠状病毒 3CL蛋白酶具有抑制活性的化合物(Jin et al.2020.Structure of Mpro from SARS-CoV-2and discovery of its inhibitors.Nature,582：289–293)，部分化合物在体外对病毒也显示了一定的抑制活性。在前期研究中，我们发明了一种基于胡桃醌(3)结构的萘醌类新型冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂(ZL 202010133985.0)。与紫草素、依布硒等化合物相比，胡桃醌衍生物在体外对3CL蛋白酶具有更强的抑制活性。然而，包括紫草素、胡桃醌在内的部分新型冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂，其分子结构中具有萘醌结构，表现出很强的毒性，对于宿主正常细胞有一定的杀伤作用；这一缺陷，限制了紫草素、胡桃醌等化合物作为抗新型冠状病毒药物的临床应用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种基于甲萘醌结构的萘醌类新型冠状病毒3CL酶抑制剂及其制备方法和医药用途。药理学研究结果显示，本发明的萘醌类化合物对2019-nCoV病毒3CL蛋白水解酶(3C－like proteinase，3CL^pro)具有强抑制活性，对病毒的复制有抑制作用，对正常细胞的毒性较已发现的病毒3CL酶抑制剂如紫草素、胡桃醌等显著降低。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种基于甲萘醌结构的萘醌类化合物，其特征在于，所述萘醌类化合物的结构如式(Ⅰ)所示：

其中，R为氢原子、甲基、乙酰基或羟基，R₁为氢、甲氧基、苄氧基或苯甲酰氧基团。优选，R为甲基、乙酰基或羟基时，R₁为氢或甲氧基；R为氢原子时，R₁为氢、苄氧基或苯甲酰氧基团。

作为本发明的一个实施方案，所述萘醌类化合物结构如式(Ⅱ)所示：

其中，R₁为氢或甲氧基。

作为本发明的一个实施方案，所述萘醌类化合物结构如式(Ⅲ)所示：

所述R₁为氢或甲氧基。

作为本发明的一个实施方案，所述萘醌类化合物结构如式(Ⅵ)所示：

其中，R₁为氢或甲氧基。

作为本发明的一个实施方案，所述萘醌类化合物结构如式(Ⅴ)所示：

其中，R₁为氢、苄氧基或苯甲酰氧基团。

第二方面，本发明涉及一种如上述结构Ⅰ所述的基于甲萘醌结构的萘醌类化合物，在制备抗新型冠状病毒2019-nCoV药物中的用途。

第三方面，本发明涉及一种如上述结构Ⅱ～Ⅴ所述的萘醌类化合物，在制备抑制新型冠状病毒2019-nCoV 3CL蛋白水解酶的药物中的用途。

本发明根据目前国内外对2019-nCoV冠状病毒的研究现状，以其3CL蛋白水解酶为药物作用靶点。我们通过化学方法合成甲萘醌及其衍生物，所制备的化合物送上海药物研究所新药筛选中心进行高通量筛选，高通量筛选模型为2019-nCoV新型冠状病毒的3 CL蛋白水解酶。筛选结果表明：在体外实验中，所合成的萘醌类化合物对3CL蛋白水解酶显示了非常强的抑制活性。其中部分化合物在1μM浓度下，对2019-nCoV新型冠状病毒3CL蛋白水解酶的抑制率可达90％以上。此外，本专利所述的萘醌类化合物结构明确，其制备方法简便、收率较高。以该类化合物为新药候选物，开发高效低毒的抗201 9-nCoV新型冠状病毒的外用制剂、口服制剂及注射剂等药物具有良好的应用前景。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1)本发明化合物的制备方法简便，收率较高且原料易得；

2)体外酶抑制活性实验研究表明，该类化合物对2019-nCoV新型冠状病毒的3CL蛋白水解酶有强抑制活性；

3)体外抗病毒活性实验及细胞水平毒性研究表明，部分化合物对2019-nCoV新型冠状病毒有较强的生长抑制活性，但对宿主细胞的毒性小，具有良好的新药开发前景；

4)本发明的萘醌类化合物，结构明确、制备方法简便、适合工业化生产，有进一步开发的前景。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的化合物的体外抗新型冠状病毒活性测试结果示意图；其中，(a)为化合物(Ⅲ-1)的体外抗新型冠状病毒活性测试结果；(b)为化合物(Ⅴ-1)的体外抗新型冠状病毒活性测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整与改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例涉及一种具有结构式(Ⅱ)的2-甲基-1,4-萘醌(Ⅱ-1)的制备方法，包括以下步骤：

在室温下，将14.2g的2-甲基萘(100mmol)溶解于冰醋酸(50mL)中，将该溶液滴加至58.7克铬酐的200毫升冰醋酸溶液中，滴加过程中反应液温度维持在35-40℃。加毕，在40℃保温0.5小时，升温到65℃保温20分钟；将反应物倾入大量冰水中，不断搅拌下析出2-甲基-1,4-萘醌粗品。将粗品过滤，用冰水反复清洗滤饼，至滤液无酸味。将滤饼用二氯甲烷溶解，分取有机层后，加入少量的活性炭脱色。在减压条件下将二氯甲烷蒸除，残留固体经冰醋酸-甲醇重结晶得2-甲基-1,4-萘醌(Ⅱ-1)纯品5.5 g，呈淡黄色粉末状结晶，收率32％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.13–7. 99(m,2H),7.71(dd,J＝5.7,3.3Hz,2H),6.83(q,J＝1.5Hz,1H),2.18 (d,J＝1.5Hz,3H).

实施例2

本实施例涉及一种具有结构式(Ⅲ)的2-乙酰基-8-甲氧基-1,4-萘醌(Ⅲ-1)的制备方法，包括以下步骤：

采用已报道的方法(Zhang et al.Synthesis of 4,8-dimethoxy-1-naphtholvia an acetyl migration.Synth.Commun.,2017,47(6),536-540)，以胡桃醌为原料，合成4,8-二甲氧基-1-萘酚乙酸酯。将4,8-二甲氧基-1-萘酚乙酸酯(300mg，1.22mm ol)溶于三氟化硼-乙醚溶液中(5mL，三氟化硼含量为48％)，将反应液升温至60℃并在该温度下搅拌反应30分钟。反应液冷却后用冰水稀释，二氯甲烷萃取，有机层经干燥后减压浓缩至干，残留物经柱层析纯化后得2-乙酰基-4,8-二甲氧基-1-萘酚,呈淡黄色粉末，约237mg，收率：79％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ13.65(s,1H),7.81 (d,J＝8.1Hz,1H),7.53(t,J＝8.1Hz,1H),6.96(s,1H),6.94(d,J＝8. 1Hz,1H),4.04(s,3H),3.95(s,3H),2.70(s,3H)。将中间体2-乙酰基-4,8- 二甲氧基-1-萘酚(230mg，0.93mmol)溶解于二氯甲烷-乙腈混合液(V/V,1∶3)中，加入2.5倍当量的硝酸铈铵的水溶液(硝酸铈铵在水溶液中的浓度为20％,w/v)，10℃下搅拌0.5h后，乙酸乙酯萃取。有机层经水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，快速柱层析，得到2-乙酰基-8-甲氧基-1,4-萘醌(Ⅲ-1)，呈亮黄色粉末，共182毫克，总收率85％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.76–7.69(m,2 H),7.37(dd,J＝5.9,3.7Hz,1H),7.02(s,1H),4.04(s,4H),2.61(s,3 H).

实施例3

本实施例涉及一种具有结构式(Ⅳ)的2-羟基-1,4-萘醌(Ⅳ-1)的制备方法，包括以下步骤：

将1，4-萘醌(3.16g，20mmol)溶于乙酸酐(20mL)中，滴加4滴浓硫酸。将混合物在冰水浴下搅拌反应8小时。将反应液抽滤，滤饼经石油醚及少量预冷的无水乙醇洗涤，得灰白色粉末约4.72克。将该粉末溶于甲醇中，在冰水浴下加入0.5克的甲醇钠，混合物在冰水浴中搅拌反应4小时后，抽滤，收集红色滤饼并用少量甲醇洗涤。将上述滤饼溶于90℃的水中，趁热抽滤；滤液冷却后用浓盐酸酸化，产物析出；抽滤、水洗及减压干燥，得2-羟基-1,4-萘醌(Ⅳ-1)约2.51g，呈淡黄色粉末状结晶，总收率约70％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.69(s,1H),8.03–7.90(m,2H),7. 82(dtd,J＝17.6,7.4,1.5Hz,2H),6.17(s,1H).

实施例4

本实施例涉及一种具有结构式(Ⅴ)的1,4-萘醌(Ⅴ-1)的制备方法，包括以下步骤：

将1-萘胺(3.6g，25mmol)溶于冰乙酸(50mL)中，在低温下滴加质量分数为45％的硫酸(10mL)。加入完毕后，反应液升温至80℃，缓慢滴加浓度分数为5％的H₂O₂溶液(160mL)。滴加完毕后，80℃继续反应3h。反应完毕后，将反应液倒入冰水中，二氯甲烷(50mL*3)萃取。有机层经水、饱和食盐水清洗后，减压浓缩至干。采用硅胶柱层析方法(流动相：乙酸乙酯-石油醚体积比为1：5)进行纯化，得化合物Ⅱ-2约1. 5g，呈淡黄色结晶，收率39％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.09(ddd,J＝ 5.8,3.3,0.9Hz,2H),7.76(ddd,J＝5.8,3.3,0.9Hz,2H),6.98(d,J＝ 0.8Hz,2H)。

实施例5

本实施例涉及2019-nCoV新型冠状病毒的3CL蛋白水解酶抑制活性测定方法，包括以下步骤：

采用文献报道的荧光共振能量转移方法(Jin et al.2020.Structure of Mprofrom SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors.Nature,582：289–293)，进行化合物的酶抑制活性测定。以市售荧光标记的多肽MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH₂为底物(GLBiochem,Shanghai)，通过酶动力学方法测定3CL酶的催化活性及初始速度。在化合物的酶抑制活性测定中，孵育体系含有2019-nCoV的3CL蛋白酶(0.2μM)，荧光标记多肽(20μM)及系列浓度的待测化合物(0-20μM)。通过酶标仪测定孵育2-3分钟时体系的荧光强度，激发波长及检测波长分别为320nm及405nm。根据加入抑制剂后酶催化底物水解的初始速度变化率，计算不同浓度下待测物的酶抑制率。所有实验均重复3 次，并通过Prism5软件计算待测物抑制酶的IC₅₀值。我们测定了实施例1-4所述化合物对新型冠状病毒3CL蛋白酶的抑制活性。在酶抑制活性实验中，我们选用紫草素作为阳性对照药物。测定结果如表1所示。

表1实施例1-4所述化合物对新型冠状病毒3CL酶的抑制活性

测定结果显示，阳性对照物紫草素在10μM的浓度下，其酶抑制率为51.4％。在1μM的浓度下，1,4-萘醌(Ⅴ-1)及2-乙酰基-8-甲氧基-1,4-萘醌(Ⅲ-1)的酶抑制率均达到90％以上，抑制活性远高于紫草素。

实施例6

本实施例涉及实施例1-4所述化合物对宿主正常细胞HSF细胞的生长抑制活性测定。

取生长状态良好的HSF细胞，胰酶消化后用完全培养基调整细胞悬液至合适的浓度，以5000个细胞/孔接种于96孔板内，静置于培养箱中培养24h，待细胞贴壁后每孔加入含待测化合物的完全培养基(100μL)，各组均设三个复孔。每块96孔板上设置调零孔(只加化合物与培养基，不含细胞)与空白对照孔(只含有细胞与培养基，不加化合物)。在培养箱中培养72小时后，加入MTT溶液20μL/孔，避光培养4h后终止培养，吸去孔内液体，加入100μL/孔的二甲基亚砜，于摇床上低速振荡10min，待孔内结晶物充分溶解后，于490nm波长处检测各孔的吸光度(OD值)，按下列公式计算细胞生长抑制率：生长抑制率(％)＝(1–给药组OD值/对照组OD值)×100％。根据不同浓度下的细胞生长抑制率，使用Prism5软件计算IC₅₀值。

表2 1,4-萘醌类化合物对HSF细胞的细胞毒作用

*：乙酰基胡桃醌为中国发明专利ZL 202010133985.0中所述化合物Ⅱ-3。

测定结果表明,天然萘醌类化合物紫草素和胡桃醌对人正常细胞HSF具有极强的生长抑制作用(IC₅₀<4μM)。中国发明专利(ZL 202010133985.0，一种抗新型冠状病毒的萘醌类化合物及其医药用途)所述化合物乙酰基胡桃醌也显示了较强的细胞生长抑制作用，IC₅₀值为7.3μM。实施例1-4所述化合物，与阳性对照药物紫草素、胡桃醌及乙酰基胡桃醌相比，对宿主正常细胞HSF细胞的毒性显著降低(IC₅₀>25μM)。

实施例7

本实施例涉及实施例2所述化合物(Ⅲ-1)及实施例4所述化合物(Ⅴ-1)的体外抗新型冠状病毒活性测定。

采用qRT-PCR方法，以Vero E6细胞作为宿主细胞，进行待测化合物的体外抗病毒活性测试。将生长状态良好的Vero E6细胞计数，以1×10⁴个每孔接种到96孔板中，并在37℃细胞培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。用候选药物(10μM)预处理细胞 1h，随后加入2019-nCoV病毒(MOI参数设定为0.01)，以细胞感染2h。除去含有病毒及待测药物的上清培养基，用新配制的含待测药物的培养基进一步培养Vero E6细胞。在细胞感染病毒72小时后，各孔收集上清液，使用试剂盒(Qiagen,Germany)从上清培养液中提取病毒RNA，通过qRT-PCR分析检测上清液中的病毒拷贝数，采用标准曲线法计算抑制率。使用Prism5软件计算半数有效浓度(EC₅₀)。结果表明(图1)，化合物Ⅲ-1及Ⅴ-1均显示了较强的体外抗病毒活性，其中化合物Ⅲ-1在体外抗新型冠状病毒的EC₅₀值仅为4.55μM，与文献(Jin etal.2020.Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of itsinhibitors.Nature,582：289–293)所报道的农药中间体依布硒的EC₅₀值接近(EC₅₀＝4.67μM)。化合物Ⅴ-1也显示了较强的抗新型冠状病毒活性，其EC₅₀值接近10μM。

综上，本发明所述萘醌类化合物较阳性对照物紫草素显示了更强的3CL蛋白水解酶抑制活性，对人正常细胞的毒性低，具有抗新型冠状病毒活性，有良好的应用前景。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种基于甲萘醌结构的萘醌类化合物，其特征在于，所述萘醌类化合物的结构如式(Ⅰ)所示：

其中，R为氢原子、甲基、乙酰基或羟基，R₁为氢、甲氧基、苄氧基或苯甲酰氧基团。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述萘醌类化合物结构如式(Ⅱ)所示：

其中，R₁为氢或甲氧基。

3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述萘醌类化合物结构如式(Ⅲ)所示：

所述R₁为氢或甲氧基。

4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述萘醌类化合物结构如式(Ⅳ)所示：

其中，R₁为氢或甲氧基。

5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述萘醌类化合物结构如式(Ⅴ)所示：

其中，R₁为氢、苄氧基或苯甲酰氧基团。

6.一种如权利要求1所述的基于甲萘醌结构的萘醌类化合物，在制备抑制新型冠状病毒2019-nCoV 3CL蛋白水解酶的药物中的用途。

7.一种如权利要求1所述的基于甲萘醌结构的萘醌类化合物，在制备抗新型冠状病毒2019-nCoV药物中的用途。

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