CN110642825B

CN110642825B - 一种黄酮类衍生物及其制备方法和在制备免疫增强剂中的应用

Info

Publication number: CN110642825B
Application number: CN201910982587.3A
Authority: CN
Inventors: 张良; 何增国; 邢严; 李文保; 杨萌琳; 汤伟; 管华诗
Original assignee: Ocean University of China; Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Ocean University of China; Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2019-10-16
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-10-16
Also published as: CN110642825A

Abstract

本发明提供了一种黄酮类衍生物及其制备方法和在制备免疫增强剂中的应用，所述黄酮类衍生物具有通式(I)的结构，其合成方法包括：邻苄氧基苯甲酸a或乙酰水杨酸c与苄基保护的化合物b在碱作用下进行缩合反应制得黄酮类衍生物YSW‑01和YSW‑02；黄酮类衍生物YSW‑01和YSW‑02在钯碳催化作用下脱除苄基可制得黄酮衍生物YSW‑TM1和YSW‑TM2。经实验证明，本发明提供的黄酮类衍生物具有促进T细胞增殖的作用，本发明还提供了研究与开发所述化合物在制备免疫增强剂中的应用。

Description

一种黄酮类衍生物及其制备方法和在制备免疫增强剂中的应用

技术领域：

本发明属于药物领域，涉及一种黄酮类衍生物及其制备方法和在制备免疫增强剂中的应用

背景技术：

T细胞是淋巴细胞的主要组成部分，T细胞接触抗原，经双信号刺激活化后，经过克隆扩增分化成效应T细胞，从而发挥细胞免疫功能。因此，增值是T细胞发挥功能的关键环节，在免疫应答中起着至关重要的作用。促进T细胞增殖的免疫增强剂可以为治疗免疫缺陷性疾病及肿瘤免疫提供新的策略。免疫缺陷病导致患者罹患感染性疾病的概率增大，恶性肿瘤的发病率或癌细胞转移/复发率大大增加等。恶性肿瘤患者常存在明显的细胞免疫功能低下，机体处于免疫抑制状态。近年来，免疫增强剂作为恶性肿瘤的辅助治疗在临床上越来越受到广泛的应用。

免疫增强剂通常指的是在单用或与抗原同时使用时可增强机体免疫应答的物质，亦被称为免疫调节剂或免疫刺激剂。免疫增强剂可通过不同的作用途径发挥作用，如增强巨噬细胞的活性、增强抗原物质的免疫原性和稳定性以及促进抗体的合成与分泌等，从而增强机体的特异性和非特异性免疫应答。目前已研究的免疫增强剂种类繁多，主要可分为微生物类、生物因子类、人工合成类、微量元素类以及天然类药物。对其研究主要涉及免疫学、药学等多个学科的内容，是近年来应用医学研究中最活跃的研究领域之一。

黄酮广泛存在自然界的某些植物和浆果中，总数大约有4千多种，其分子结构不尽相同，如芸香苷、橘皮苷、栎素、绿茶多酚、花色糖苷、花色苷酸等都属黄酮。不同分子结构的黄酮可作用于身体不同的器官，如银杏山楂--心血管系统，蓝梅--眼睛，酸果--尿路系统，葡萄--淋巴、肝脏，接骨木果--免疫系统，平时我们可以通过多食葡萄、洋葱、花椰莱、喝红酒、多饮绿茶等方式来获得黄酮，作为身体的一种补充。二十年前，科学家发现具有活化石之称的银杏树中含有相对较多的黄酮，主要从银杏叶中提取黄酮。

黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧化剂，可有效清除体内的氧自由基也可以改善血液循环，可以降低胆固醇，大大降低了心脑血管疾病的发病率，也可改善心脑血管疾病的症状。

目前为止，尚未发现基于黄酮类结构的用于促进T细胞增殖的免疫增强剂的研究专利或其他文献报道。

发明内容

本发明目的是针对现有技术的不足，提供了一种黄酮类衍生物及其制备方法和在制备免疫增强剂中的应用。本发明通过药理学实验证明，上述黄酮类衍生物具有能够显著促进T细胞增殖的作用。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种黄酮类衍生物，其结构通式如式(I)所示：

式中：

R¹、R²、R³和R⁴均选自氢或苄基；

R⁵＝氢或苄基；

R⁶＝氢、苄基或乙酰基。

进一步的：所述黄酮类衍生物为衍生物YSW-01、YSW-02、YSW-TM1、YSW-TM2，其结构式如下：

本发明还提供了所述的黄酮类衍生物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)邻苄氧基苯甲酸a或乙酰水杨酸c与苄基保护的黄酮类化合物b在碱作用下进行缩合反应，反应完全后经过抽滤、柱层析纯化制得黄酮类衍生物YSW-01、YSW-02；

(2)所述黄酮类衍生物YSW-01和YSW-02溶于溶剂中，在钯碳催化作用下发生脱除反应脱除苄基，制得黄酮类衍生物YSW-TM1和YSW-TM2。

进一步的：所述碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、三乙胺、二异丙基乙胺或4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。

进一步的：所述碱选用4-二甲氨基吡啶。

进一步的：所述步骤(1)缩合反应的温度为20℃-30℃，反应时间为10-18h。

进一步的：所述步骤(2)脱除反应的温度为25℃-30℃，反应时间为8-16h。

本发明还提供了所述的黄酮类衍生物在制备促进T细胞增殖药物中的应用。

本发明还提供了所述的黄酮类衍生物在制备免疫增强剂中的应用。

所述YSW-TM1和YSW-TM2能够促进脾细胞的增殖，且存在剂量依赖性。

本发明技术方案的优点和技术效果是：本发明提供的所述黄酮类衍生物具有通式(I)的结构，其合成方法包括：邻苄氧基苯甲酸a或乙酰水杨酸c与苄基保护的化合物b在碱作用下进行缩合反应制得YSW-01和YSW-02；YSW-01和YSW-02在钯碳催化作用下脱除苄基可制得YSW-TM1和YSW-TM2。

附图说明：

图1是本发明所述黄酮类衍生物YSW-01的核磁共振氢谱；

图2是本发明所述黄酮类衍生物YSW-TM1的核磁共振氢谱；

图3是本发明所述黄酮类衍生物YSW-TM1的核磁共振碳谱。

具体实施方式：

下述实施方式更好地说明本发明内容。但本发明不限于下述实施例。

实施例1：黄酮类衍生物YSW-01的合成路线如下：

黄酮类衍生物b(678mg，1mmol)，邻苄氧基苯甲酸a(273.6mg，1.2mmol)，DMAP(183mg，1.5mmol)加入100ml单口瓶中，加入25mlDMF，体系呈悬浮状态，最后加入EDCI(287mg，1.5mmol)，1-2小时后体系慢慢地溶清，室温搅拌过夜14h，TLC检测反应，原料基本反应完全后，将体系倒入水中，析出黄色固体，抽滤，柱层析纯化，加入石油醚，超声，室温打浆，过滤得黄色固体600mg，收率67.5％。

¹H NMR(500MHz，dmso-d₆)δ12.11(s，1H)，8.19(d，J＝7.8Hz，1H)，7.69(d，J＝8.6Hz，1H)，7.51(d，J＝7.5Hz，2H)，7.46-7.20(m，26H)，7.16(t，J＝7.6Hz，1H)，6.98(s，1H)，6.61(d，J＝1.7Hz，1H)，5.30(s，2H)，5.23(s，2H)，4.99(s，4H)，4.96(s，2H)，如图1所示。

实施例2：黄酮类衍生物YSW-TM1的合成路线如下：

将实施例1制得的所述YSW-01(600mg，0.675mmol)溶于20ml左右MeOH中，加入100mg的10％Pd/C，室温双层氢气球反应过夜，TLC(PE∶EA＝3∶1)检测原料消失，LCMS检测生成主产物，少量硅藻土过滤去Pd-C，得红色溶液，蒸干溶剂，得黄色油状物，柱层析纯化得黄色固体200mg，收率67.8％，LCMS检测ESI(-)[M-H]＝437。

¹H NMR(500MHz，dmso-d₆)δ12.14(s，1H)，11.03(s，1H)，10.19(s，1H)，9.37(s，2H)，9.07(s，1H)，8.03(dd，J＝7.9，1.4Hz，1H)，7.67-7.56(m，1H)，7.09-7.00(m，2H)，6.95(s，2H)，6.49(d，J＝1.9Hz，1H)，6.27(d，J＝1.9Hz，1H)。

¹³C NMR(126MHz，dmso)δ175.09，165.29，165.16，161.53，160.80，157.10，156.97，146.49(2C)，137.93，136.88，131.77，130.09，120.05，118.86，118.17，112.87，107.91(2C)，103.86，99.60，94.50，如图2和图3所示。

实施例3：黄酮类衍生物YSW-02的合成路线如下：

黄酮类衍生物b(678mg，1mmol)，乙酰水杨酸c(216mg，1.2mmol)，DMAP(183mg，1.5mmol)加入100ml单口瓶中，加入25mlDMF，体系呈悬浮状态，最后加入EDCI(287mg，1.5mmol)，1-2小时后体系慢慢地溶清，室温搅拌过夜14h，TLC检测反应，原料基本反应完全后，将体系倒入水中，析出黄色固体，抽滤，柱层析纯化，得黄色固体500mg，收率59.5％。

¹H NMR(500MHz，dmso-d₆)δ12.12(s，1H)，8.18(d，J＝7.8Hz，1H)，7.68(d，J＝8.6Hz，1H)，7.50(d，J＝7.5Hz，2H)，7.46-7.20(m，21H)，7.16(t，J＝7.6Hz，1H)，6.98(s，1H)，6.61(d，J＝1.7Hz，1H)，5.30(s，2H)，5.23(s，2H)，4.99(s，2H)，4.96(s，2H)，2.30(s，3H)。

实施例4：黄酮类衍生物YSW-TM2的合成路线如下：

将实施例3制得的所述YSW-02(500mg，0.6mmol)溶于20ml左右MeOH中，加入100mg的10％Pd/C，室温双层氢气球反应过夜，TLC检测原料消失，LCMS检测生成主产物，少量硅藻土过滤去Pd-C，得红色溶液，蒸干溶剂，得黄色油状物，柱层析纯化得黄色固体150mg，收率52.6％，LCMS检测ESI(-)[M-H]＝479。

¹H NMR(500MHz，dmso-d₆)δ12.13(s，1H)，10.18(s，1H)，9.36(s，2H)，9.06(s，1H)，8.02(dd，J＝7.9，1.4Hz，1H)，7.66-7.55(m，1H)，7.08-7.01(m，2H)，6.94(s，2H)，6.48(d，J＝1.9Hz，1H)，6.26(d，J＝1.9Hz，1H)，2.3(s，3H)。

实施例5：黄酮类衍生物脾淋巴细胞活性测定实验

1、实验目的：测试送检化合物YSW-TM1，YSW-TM2，ASPL，YMS对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

2、实验方法：

脱颈椎处死小鼠，酒精浸泡5min，无菌分离小鼠脾脏，研磨后分离并培养小鼠脾淋巴细胞。台盼蓝染色计数后，用培养基调成细胞浓度，接种细胞至96孔板，每孔细胞数为60万，3个平行孔。分别用待测样品或者脂多糖(LPS，10μg/ml)、刀豆蛋白A(ConA，5μg/ml)处理44小时，每孔加入MTT继续孵育培养4小时，然后加入三联液，过夜孵育后用酶联免疫检测仪分别测定570nm波长的吸光度A值。

3、实验材料：

KM小鼠，清洁级，20～22g，雄性，济南朋悦实验动物繁殖有限公司。许可证号：SCXK鲁20140007，实验动物质量合格证编号37009200000833，动物饲养于SPF级动物房。胎牛血清(批号1414426)、1640-RPMI培养基(批号15091806)，美国GIBCO公司；PBS缓冲液(批号1131027)，北京索莱宝科技有限公司；刀豆蛋白A(ConA)，美国Sigma公司。

4、实验仪器：

CO₂培养箱(Heracell 150i)，美国Thermo公司；十万分之一天平(MS105DU)，瑞士梅特勒公司；超净台(SW-CJ-2F)，苏州净化设备有限公司；倒置显微镜(BX53)，日本奥林帕斯公司；酶标仪(VersaMax)，美国MD公司；离心机Thermo21R，美国Thermo公司；

5、数据统计：

增殖率％＝(A_实验-A_对照)/A_对照×100；采用SPSS13.0统计学软件进行单因素方差分析，比较各实验组与对照组差异。数据以(x±s)表示，P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示有显著性统计学差异。

6、实验结果：

表1：化合物对脾细胞、LPS或ConA诱导的脾细胞增值的影响

*代表P＜0.05，**P＜0.01，代表与相应对照组对比的结果。

附测试化合物结构：

免疫细胞是免疫系统的重要组成部分，其数量和活性是机体免疫能力的重要指标。T、B淋巴细胞又称免疫活性淋巴细胞，主要存在脾脏和淋巴结等外周淋巴器官中，属于特异性免疫应答的基础。T淋巴细胞主要介导细胞免疫应答，B淋巴细胞能分泌多种抗体，是体液免疫的主要细胞。ConA是T细胞的促有丝分裂剂，LPS是B细胞的促有丝分裂剂，一般认为能够加强ConA或LPS促脾细胞增殖的药物可能是T、B细胞功能的促进剂，相反为抑制剂。

YSW-TM1药物本身能够促进脾细胞的增殖，且存在剂量依赖性，在100、50、20μM时，有显著性差异(**P＜0.01，*P＜0.05)。YSW-TM1与ConA共同作用于脾淋巴细胞时，在100、50μM时，有显著性差异(**P＜0.01，*P＜0.05)，但增值率不如单药刺激脾细胞增殖效果好。YSW-TM2药物本身能够促进脾细胞的增殖，且存在剂量依赖性，在50、20μM时，有显著性差异(**P＜0.01，*P＜0.05)。YSW-TM2与ConA共同作用于脾淋巴细胞时，在50、20μM时，有显著性差异(**P＜0.01，*P＜0.05)，但增值率不如单药刺激脾细胞增殖效果好。YMS药物本身在100μM时，单独给药时有抑制脾细胞增殖的效果，与ConA共同作用于脾淋巴细胞时，有促进作用但无显著性。ASPL无论是单独给药还是联合ConA或LPS都是抑制脾细胞增殖。

实验结果显示，YSW-TM1和YSW-TM2在促进小鼠T细胞增殖中可能起着重要作用，这为治疗免疫缺陷性疾病及肿瘤免疫疗法提供了非常新颖的策略。

以上实施例仅说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种黄酮类衍生物，其特征在于：所述黄酮类衍生物为衍生物YSW-TM1、YSW-TM2，其结构式如下：

。

2.权利要求1所述的黄酮类衍生物的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的黄酮类衍生物的制备方法，其特征在于：所述碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、三乙胺、二异丙基乙胺或4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的黄酮类衍生物的制备方法，其特征在于：所述碱选用4-二甲氨基吡啶。

5.根据权利要求2所述的黄酮类衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)缩合反应的温度为20℃-30℃，反应时间为10-18h。

6.根据权利要求2所述的黄酮类衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)脱除反应的温度为25℃-30℃，反应时间为8-16h。

7.根据权利要求1所述的黄酮类衍生物在制备促进T细胞增殖的药物中的应用。

8.根据权利要求1所述的黄酮类衍生物在制备免疫增强剂中的应用，其特征在于：所述YSW-TM1和YSW-TM2能够促进脾细胞的增殖，且存在剂量依赖性。