CN101914118B

CN101914118B - 海藻糖衍生物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101914118B
Application number: CN2010102467922A
Authority: CN
Inventors: 刘兆鹏; 姜永莉
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Ji'nan Jiangxin Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2010-08-06
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-08-06
Also published as: US20130331346A1; WO2012016367A1; CN101914118A; US8889651B2

Abstract

本发明涉及具有通式(I)的海藻糖衍生物及其制备方法与应用。其中6，6’-双(2，3-二甲氧基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖具有优于天然产物Brartemicin的抗结肠癌26-L5细胞侵袭活性，其IC₅₀为0.10μg/mL(0.15μM)，而在10μg/mL时没有细胞毒性，表现出高选择性的抗肿瘤侵袭活性，用于制备预防和治疗结肠癌等侵袭与转移的药物。

Description

海藻糖衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一类海藻糖衍生物，其制备方法及抗肿瘤侵袭活性与应用，属于化学技术领域。

背景技术

Brartemicin是从放线菌Nonomuraea代谢产物中分离得到的海藻糖衍生物。该化合物具有强的抗结肠癌26-L5细胞侵袭活性(IC₅₀：0.39μM)，而对正常细胞没有毒性，是高选择性抗肿瘤侵袭海藻糖衍生物。

肿瘤侵袭是指恶性肿瘤细胞离开原发肿瘤向周围组织进攻，其标志是肿瘤细胞突破基底膜。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞脱离原发肿瘤，通过各种方式转移到其他组织或器官继续生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发性肿瘤的过程。肿瘤侵袭是肿瘤转移的前奏，肿瘤转移是侵袭的继续和结果，二者密切相关。肿瘤侵袭与转移是恶性肿瘤的基本特征，是临床肿瘤患者(90％以上)死亡的最主要原因。如何防止肿瘤侵袭与转移一直是肿瘤治疗的最大难关。目前采用的大多数抗肿瘤药物主要是抑制肿瘤细胞的增殖和杀伤肿瘤细胞，这对增殖期的肿瘤细胞特别有效，而对许多处于休眠或蛰伏期的肿瘤细胞无效；另外，肿瘤转移细胞增殖率较低，对常规的肿瘤化学疗法也不敏感。因此，研制针对转移过程和微小转移灶的抗肿瘤侵袭与转移药物显得尤为重要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供α，α-D-海藻糖-6，6’-二芳酯衍生物及其制备方法。

本发明还提供该类化合物的活性实验结果及其应用。

基于分子设计的相似性，多样性原则，本发明设计合成了一系列α，α-D-海藻糖-6，6’-二芳酯衍生物，并对其抗肿瘤侵袭活性进行了研究，发现部分海藻糖衍生物具有强的抗肿瘤侵袭活性和高选择性，具有潜在抗肿瘤侵袭与转移应用价值。

术语解释：

光延(Mitsunobu)反应：是日本科学家光延旺洋((Mitsunobu，O)发明的一种双分子亲核取代反应。该反应能将醇通过与三苯基磷和偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)反应转化为多种化合物，比如酯等。

DCC：N，N′-二环己基碳二亚胺。

EDC：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐。

DMAP：4-N，N-二甲基吡啶。

HOBt：1-羟基-苯并三(氮)唑。

本发明的技术方案如下：

海藻糖衍生物，具有通式(I)所示的结构：

其中，R代表苯环上不同位置的取代基，包括单取代、双取代或三取代；R基团取代基包括甲氧基、羟基、氨基、烷基、卤素、硝基或苄氧基。

优选的，通式(I)中的R是2，3-二甲氧基，2-甲氧基，4-羟基，2，6-二氟或2-甲基-6-氨基；双取代或三取代时可以相同，也可以不同。

优选的，上述化合物(I)是下列之一：

6，6’-双(2-甲氧基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖(3a)、

6，6’-双(2-甲基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖(3b)、

6，6’-双(4-甲氧基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖(3c)、

6，6’-双(4-羟基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖(3d)、

6，6’-双(2，3-二甲氧基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖(3e)、

6，6’-双(2，6-二氟苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖(3f)、

6，6’-双(2-甲基-6-氨基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖(3g)、

6，6’-双(3-甲氧基-4-氟苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖(3h)或

6，6’-双(3，4，5-三甲氧基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖(3i)。

本发明的海藻糖衍生物的制备方法，合成路线如下：

上述反应式中R代表的基团同前所述，(I)代表的化合物结构同前所述。

该合成路线以苄基保护的海藻糖衍生物1为原料，通过与不同取代的苯甲酸缩合，制备中间体(II)；最后催化氢化脱去苄基保护，得到海藻糖衍生物(I)。

中间体(II)可采用常规酰氯与醇的反应来制备，即将不同取代的苯甲酸与氯化亚砜、五氯化磷、三氯化磷或草酰氯反应制备成酰氯，再在碱的存在下与化合物1反应，但收率较低(0-60％)。也可利用DCC或EDC缩合试剂，在DMAP或HOBt存在下直接缩合，但收率较低(0-40％)。经研究发现，采用光延(Mitsunobu)反应，可高收率地制备中间体(II)。

本发明的海藻糖衍生物的制备方法，具体步骤如下：

(1)将2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖(化合物1)1个当量溶于适当溶剂中，加入3.0个当量的取代苯甲酸，4.0当量的三苯基磷，滴加2.0个当量的光延试剂，搅拌反应2-12小时，分离纯化得中间体化合物(II)；

(2)将中间体化合物(II)溶入一定的溶剂，加入钯/碳催化剂，氢气流下还原。纯化后即得海藻糖衍生物(I)。

优选的，步骤(1)中所述的取代苯甲酸为：2-甲氧基苯甲酸、邻甲基苯甲酸、4-甲氧基苯甲酸、4-苄氧基苯甲酸、2，3-二甲氧基苯甲酸、2，6-二氟苯甲酸、2-甲基-6-硝基苯甲酸、3-甲氧基-4-氟苯甲酸或3，4，5-三甲氧基苯甲酸。

优选的，步骤(1)中所述的溶剂为四氢呋喃或二氯甲烷，优选四氢呋喃。

优选的，步骤(1)中所述的光延试剂为偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)或偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)，优选偶氮二甲酸二异丙酯。

优选的，步骤(1)中的反应温度为0℃-25℃。

优选的，步骤(2)中所述的溶剂为体积比为1∶1的乙酸乙酯-乙醇的混合溶液；所述的催化剂为10％钯/碳。

含有本发明海藻糖衍生物的药物组合物

一种药物组合物，包含本发明所述的海藻糖衍生物，和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

本发明海藻糖衍生物的应用

本发明所述的海藻糖衍生物的应用，用于制备抗肿瘤侵袭与转移药物，具体地，在制备抗结肠癌26-L5细胞侵袭与转移的药物中的应用。

海藻糖衍生物的抗肿瘤侵袭活性实验：

(1)实验原理：

侵袭及转移是恶性肿瘤的基本特征。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞侵袭基底膜是重要环节。采用常规重组基底膜侵袭实验，以天然产物Brartemicin为阳性对照，测定海藻糖衍生物对结肠癌26-L5细胞侵袭活性的抑制作用。

(2)实验材料：

聚碳酸酯膜8μm(Nucleopore，Pleasanton，CA，USA)；Transwell细胞培养小室(Costar3422，Cambridge，MA，USA)；纤维连接蛋白(FN；Collaborative Research Inc.，Bedford，MA，USA)；基质胶Matrigel(Collaborative Research Inc.，Bedford，MA，USA)；含1％胎牛血清(FCS)RPMI1640培养基(Collaborative Research Inc.，Bedford，MA，USA)；苏木素伊红(HE)染色试剂盒(Collaborative Research Inc.，Bedford，MA，USA)。

(3)实验方法：

Transwell细胞培养小室下层涂抹20μg纤维连接蛋白，上层涂抹5μg基质胶Matrigel。将生长指数期的结肠癌26-L5细胞混悬于含含不同浓度的海藻糖衍生物或不同浓度的Brartemicin的1％胎牛血清(FCS)RPMI1640培养基中。取100μl上述混悬液(2×10⁴cells/chamber)加到小室上层，浸于24孔板的完全培养液中，37℃，5％CO₂孵箱内孵育6～8小时，取出小室，滤膜用甲醇固定，HE染色3分钟，染完色后用棉签擦掉膜上层未穿过的细胞。滤酯膜含颜色的侵袭后的结肠癌26-L5细胞。将酯膜放在载玻片上用二甲苯透化，用中性树脂封片，于400倍显微镜下计数侵袭细胞。每膜计数上下左右中5个不同视野透过细胞数，计算平均值，每组平行3个滤膜。

(4)实验结果：

以天然产物Brartemicin为阳性对照，测定海藻糖衍生物对结肠癌26-L5细胞侵袭活性的抑制作用，活性实验结果如下表1所示：

表1

NA：在10μg/mL时无活性.

值得注意的是所有测试化合物在10μg/mL浓度时均无细胞毒性，化合物3a，3d，3e，3f，3g均表现出强的抗结肠癌26-L5细胞侵袭活性，尤其是化合物3e，IC₅₀为0.10μg/mL(0.15μM)，比天然产物Brartemicin活性更强，具有进一步发展为抗肿瘤侵袭与转移药物的潜力和潜在治疗结肠癌的应用价值。

综上，本发明的海藻糖衍生物，特别是化合物3e，具有强抗结肠癌26-L5细胞侵袭活性，可以作为抗肿瘤侵袭和转移的先导化合物或药物加以利用，具体地说，作为肿瘤侵袭和转移抑制剂用于制备抗肿瘤药物；或者，同其他抗肿瘤药物一起作为组方药物应用，用于预防结肠癌转移和治疗结肠癌等。

具体实施方式

为了更详细地说明本方明，给出下述制备实例。但本发明的范围并不局限于此。

实施例2中的10％钯/碳是指：催化剂钯/碳中钯的质量百分比。

实施例1：中间体化合物(II)的制备

将2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖(300mg，0.34mmol)溶于10ml干燥四氢呋喃(THF)中，冷却至0℃，氮气保护下依次加入2-甲氧基苯甲酸(155mg，1.02mmol)、三苯基磷(300mg，1.33mmol)，偶氮二甲酸二异丙酯(300μl，0.68mmol)，搅拌反应2小时。加入10ml冰水，用乙酸乙酯提取。经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯15～3∶1)，得6，6’-双(2-甲氧基苯甲酰基)-2，2’，3，3’，4，4’-α，α-D-海藻糖2a 324mg，收率82.8％。

同法制得2b-2i，所不同的是加入的取代苯甲酸依次为：邻甲基苯甲酸、4-甲氧基苯甲酸、4-苄氧基苯甲酸、2，3-二甲氧基苯甲酸、2，6-二氟苯甲酸、2-甲基-6-硝基苯甲酸、3-甲氧基-4-氟苯甲酸或3，4，5-三甲氧基苯甲酸。

6，6’-双(2-甲基苯甲酰基)-2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖2b 308mg，收率81.0％。

6，6’-双(4-甲氧基苯甲酰基)-2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖2c 320mg，收率81.8％。

6，6’-双(4-苄氧基苯甲酰基)-2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖2d 301mg，收率68.0％。

6，6’-双(2，3-二甲氧基苯甲酰基)-2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖2e 280mg，收率68.0％。

6，6’-双(2，6-二氟苯甲酰基)-2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖2f 328mg，收率83.0％。

6，6’-双(2-甲基-6-硝基苯甲酰基)-2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖2g 315mg，收率76.7％。

6，6’-双(3-甲氧基-4-氟苯甲酰基)-2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖2h 315mg，收率68.0％。

6，6’-双(3，4，5-三甲氧基苯甲酰基)-2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖2i 280mg，收率68.8％。

实施例2：海藻糖衍生物(I)的制备

6，6’-双(2-甲氧基苯甲酰基)-2，2’，3，3’，4，4’-六苄氧基-α，α-D-海藻糖2a(190mg，0.165mmol)溶于5ml无水乙醇-乙酸乙酯(1∶1)，加入10％Pd/C 120mg，于一定氢气压力下搅拌反应24小时。过滤后浓缩有机液。经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇15～6∶1)，得6，6’-双(2-甲氧基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖3a 70mg，收率66.8％。ESI-MS m/z 633.4(M+Na)⁺。

使用中间体2b-2i，同法制得3b-3i：

6，6’-双(2-甲基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖3b，收率63.3％。ESI-MS m/z 610.4(M+Na)。

6，6’-双(4-甲氧基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖3c，收率69.5％。ESI-MS m/z 633.4(M+Na)⁺。

6，6’-双(4-羟基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖3d，收率64.7％。ESI-MS m/z 605.3(M+Na)⁺。

6，6’-双(2，3-二甲氧基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖3e，收率60.2％。ESI-MS m/z 693.4(M+Na)⁺。

6，6’-双(2，6-二氟苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖3f，收率66.36。ESI-MS m/z 645.3(M+Na)⁺。

6，6’-双(2-甲基-6-氨基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖3g，收率35.8％。ESI-MS m/z 631.3(M+Na)⁺。

6，6’-双(3-甲氧基-4-氟苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖3h，收率82.2％。ESI-MS m/z 669.3(M+Na)⁺。

6，6’-双(3，4，5-三甲氧基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖3i，收率58.7％。ESI-MS m/z 753.5(M+Na)⁺。

Claims

1.海藻糖衍生物如下：

6，6’-双(2，3-二甲氧基苯甲酰基)-α，α-D-海藻糖(3e)。

2.权利要求1所述的海藻糖衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：合成路线：

R＝2，3-二甲氧基。

具体操作步骤如下：

(1)将化合物(1)1个当量溶于适当溶剂中，加入3.0个当量的取代苯甲酸，4.0当量的三苯基磷，滴加2.0个当量的光延试剂，搅拌反应2-12小时，分离纯化得中间体化合物(II)；

(2)将中间体化合物(II)溶入一定的溶剂，加入钯/碳催化剂，氢气流下还原；纯化后即得海藻糖衍生物(I)。

3.权利要求2所述海藻糖衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的溶剂为四氢呋喃或二氯甲烷。

4.权利要求2所述海藻糖衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的光延试剂为偶氮二甲酸二异丙酯。

5.权利要求2所述海藻糖衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的溶剂为体积比为1∶1的乙酸乙酯-乙醇的混合溶液，所述的催化剂为10％钯/碳。

6.权利要求1所述的海藻糖衍生物在制备抗结肠癌26-L5细胞侵袭与转移的药物中的应用。

7.一种抗结肠癌26-L5细胞侵袭与转移的药物组合物，包括权利要求1所述的海藻糖衍生物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。