CN103408612A

CN103408612A - 菲及二氢菲类化合物及其应用

Info

Publication number: CN103408612A
Application number: CN2013101278626A
Authority: CN
Inventors: 张国林; 王飞; 淳泽; 林�源
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-04-12
Also published as: CN103408612B

Abstract

菲类或二氢菲类化合物效地抑制炎症因子的产生，并且可以抑制NF-κB、MAPKs信号通路，这类化合物或其医药上可以接受的盐、溶剂合物、包合物或者前药均可用作为治疗炎症药而应用，可以作为治疗NF-κB、MAPKs信号通路相关疾病的药物而应用。

Description

菲及二氢菲类化合物及其应用

技术领域

本发明涉及新颖的药学上有用的菲类及二氢菲类化合物，以及这些化合物在制备治疗炎症以及NF-κB，MAPKs信号通路相关疾病的药物中的应用。

背景技术

炎症是机体对内源性或外源性损伤因子产生的正常防御的反应过程，主要是由活化的免疫细胞所介导。在正常的生理情况下炎症反应对机体是有利的，能够杀伤，杀死入侵的病原微生物，排除外源性刺激，促进受损组织修复，愈合等；但是机体自生的调节能力失调时，将会导致炎症反应的失控，会导致许多疾病，如关节炎，感染性休克，二型糖尿病，支气管哮喘以及老年性痴呆等。早期炎症反应会导致受损组织毛细血管通透性增高，前炎症因子（IL-1，IL-6，TNF-α，组胺）的释放。在炎症反应网络，NO在炎症级联反应中起到关键的调节作用，尤其在炎症反应的发生和信号传导方面。

目前炎症治疗药物主要有两类：一类是甾体抗炎药，即肾上腺皮质所分泌的糖皮质激素氢化可的松及其人工合成的衍生物。另一类是非甾体抗炎药，即医疗实践中所指的解热镇痛抗炎药如阿司匹林、保泰松等。但是，现有的抗炎药物存在特异性较差，且毒副作用较大等缺点。例如：糖皮质激素长期大剂量使用，容易引起代谢紊乱，皮质功能亢进综合征，满月脸、水牛背、高血压、多毛、糖尿、皮肤变薄等，同时会降低自身免疫力；非甾体类抗炎药物对对胃肠道的副作用较大，其主要表现为胃、十二指肠溃疡引起上消化道出血。

体内的NO由一氧化氮合酶(Nitric oxide synthases,NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)产生。已知的NOS有不同基因编码的3种同工酶,即神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)。诱导型NO合酶iNOS在一些外来刺激激活，如内毒素(LPS)、干扰素类、细菌、病毒，前炎症因子（TNF-α，IL-1，IL-6）都可激活iNOS。

NO在体内发挥双重作用是免疫系统发挥作用不可缺少的调节因子，而且过度产生会导致组织损伤。在炎症部位，NO作用于血管平滑肌细胞,升高其cGMP水平,使血管舒张,通透性增高,以利于炎症介质和致痛物质到达作部位。NO在高浓度状态下，激活NF-κB,诱导促炎症细胞因子TNF-α、IL-1产生，导致iNOS的激活,促进机体产生更多的NO，从而导致NO自身的表达得以持续，使炎症反应更持久，更剧烈。在多种炎症性或免疫性的动物试验模型中，NO浓度显著增高，抑制NO合成可使炎症症状得到改善。

内毒素，是一种由脂多糖(LPS)、蛋白质和磷脂组成的复合体。脂多糖(LPS)是内毒素的活性成分，而蛋白质和磷脂与内毒素的活性无关。脂多糖(LPS)的组成结构因菌株不同而产生差异,尤其是在脂多糖的多糖抗原部分。内毒素的致炎的机制是一种多途径、多介质共同参与,并引发机体多器官系统反应及导致机体损伤的复杂过程。主要是通过LPS激活受体TLR4，TLR4可活化接头蛋白MyD88，活化的MyD88与丝/苏氨酸蛋白激酶IRAK相互作用，使IRAK自主磷酸化。游离的IRAK与另一衔接分子肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF 6)结合形成复合物，激活NF-κB，启动靶基因的转录。TRAF6还可与ECSIT相互作用，依次激活MAPKKK、MAPKK、ERK、p38和JNK/SAPK，最后导致转录因子AP-1家族成员Jun和Fos的活化。NF-κB和AP-1的活化均可导致炎症因子如TNF-α、IL-1、NO、PAF、PGs和粘附分子等的大量表达。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供通式为Ⅰ的菲类衍生物和通式为Ⅱ的二氢菲类衍生物，以抑制炎症因子及NF-κB，MAPKs信号通路。所述化合物具有制备治疗炎症以及与NF-κB，MAPKs信号通路相关疾病的药物中的应用。

具体地是提供有关下面通式（Ⅰ）和通式为（Ⅱ）的化合物或其医药上可以接受的盐。

其中，R⁸，R⁹和R¹⁰各自独立地选自糖基、OH、甲氧基、乙酰基、卤素、甲基、乙基、氰基、硝基、氨基、卤代C_1-8烷基；

条件是，R⁸，R⁹和R¹⁰中至少有一个为糖基；

其中所述的糖基优选为D/L-葡萄糖，D/L-鼠李糖，D/L-芹菜糖，D/L- 果糖，D/L-木糖；去甲基葡萄糖，去甲基鼠李糖，去甲基芹菜糖，去甲基果糖，去甲基木糖；卤代葡萄糖，卤代鼠李糖，卤代芹菜糖，卤代果糖，卤代木糖；乙酰化葡萄糖，乙酰化鼠李糖，乙酰化芹菜糖，乙酰化果糖，乙酰化木糖；氨基葡萄糖，氨基鼠李糖，氨基芹菜糖，氨基果糖或氨基木糖。

其中，R¹，R²，R⁴，R⁵，R⁶和R⁷各自独立地选自：-H、-OH、甲氧基、乙酰基、卤素、甲基、乙基、氰基、硝基、氨基、卤代C_1-8烷基、糖基；

R³选自：-OH、甲氧基、乙酰基、卤素、甲基、乙基、氰基、硝基、氨基、卤代C_1-8烷基、糖基。

前面所述的糖基优选为D/L-葡萄糖，D/L-鼠李糖，D/L-芹菜糖，D/L-果糖，D/L-木糖；去甲基葡萄糖，去甲基鼠李糖，去甲基芹菜糖，去甲基果糖，去甲基木糖；卤代葡萄糖，卤代鼠李糖，卤代芹菜糖，卤代果糖，卤代木糖；乙酰化葡萄糖，乙酰化鼠李糖，乙酰化芹菜糖，乙酰化果糖，乙酰化木糖；氨基葡萄糖，氨基鼠李糖，氨基芹菜糖，氨基果糖或氨基木糖。

通式Ⅱ中二氢菲C-9、C-10的构型可以独立的选自R和/或S构型。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述通式I或通式Ⅱ的化合物及其医药上可以接受的盐以及药用载体或稀释剂。

本发明还提供了上述通式Ⅰ或通式Ⅱ的化合物及其医药上可以接受的盐在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中，在所述的疾病中抑制炎症因子（包括一氧化氮（NO）、INF-α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6）活性是需要的和/或必须的。

其中，上述用途中所述的疾病是炎症和/或与NF-κB信号通路和/或MAPKs信号通路相关的疾病。

具体地，所述的炎症疾病是具有炎性成分的疾病。例如：炎性肠病、过敏性肠综合症、偏头痛、头痛、病毒感染、细菌感染、真菌感染、病痛、动脉粥样硬化、关节炎、骨关节炎、幼年型关节炎、类风湿性关节炎、发热、脊柱炎、红斑狼疮、血管炎、胰腺炎、肾炎、结膜炎、虹膜炎、巩膜炎、葡萄膜炎等。

本发明通过具体实验证明了本发明化合物可以有效地抑制脂多糖（LPS）诱导小鼠RAW246.7巨噬细胞产生一氧化氮（NO），并且本发明化合物呈现浓度依赖性，显示良好的剂量关系，可以用于治疗炎症的药物，具有潜在的临床使用价值。

本发明通过研究LPS诱导炎症信号通路的研究，发现本发明化合物可以显著地抑制iNOS蛋白的表达和IκB，p38，JNK蛋白的磷酸化水平，说明菲类及二氢菲类化合物可以通过抑制NF-κB和MAPKs信号通路，从而抑制炎症的发生。进一步说明本发明所示的菲类及二氢菲类衍生物可作为于制备治疗炎症的药物以及与NF-κB、MAPKs信号通路相关疾病的药物。

参照以下详细的实例更详细地阐述本发明而并非用以限制本发明的具体例，这将更有利于了解本发明。

附图说明

图1：化合物1和4对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生iNOS蛋白的影响。在图中BAY（10μM）作为阳性药物。

图2：A：化合物1和4对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞p38（10μM），在图中SB203580作为抑制p38蛋白磷酸化阳性药物。B：化合物1和4对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞JNK蛋白磷酸化的影响，SP600125（20μM）作为抑制JNK蛋白磷酸化阳性药物。

图3：化合物1和4对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞IκBα蛋白磷酸化的影响。在图中BAY（10μM）作为阳性药物。

具体实施方式

下面通过具体实施例来帮助具体理解本发明，以下都只是举例说明，但不是仅有的。其他任何类似本发明原理下所做的修改与修饰、替代、组合、简化均应为本发明的简单置换，均在本发明的保护范围内。

本发明化合物可以从生物资源获得或者通过有机合成获得，代表性示例的化合物（1-8）作为天然产物中获取，代表性示例的化合物（9-33）通过有机合成获取。

实施例1：化合物的提取分离以及结构鉴定

1.1 仪器、试剂及填料

UV1902型紫外分光光度计；旋光测定使用Perkin-Elmer 341旋光测定仪；Perkin-Elmer FT-IR红外分光光度计，KBr压片；圆二色谱（CD）使用JASCO J-810型测定；核磁共振实验采用Bruker Avance 600核磁共振仪；质谱使用Bruker Daltonics Bio-TOF-Q型测定；高效液相色谱： Agilent 1260 HPLC，制备柱使用Kromasil 100-10-C18。

甲醇（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；氯仿（分析纯）：重庆吉元化学有限公司；乙酸乙酯（分析纯）：天津津康德科技有限公司；正丁醇（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；石油醚（分析纯）：天津康德科技有限公司；硅胶（200-300目）：青岛海洋化工；Sephadex LH-20：Pharmacia Biotech(Sweden)。

1.2 化合物的分离和纯化

空气干燥叠鞘石斛（Dendrobium denneanum）茎（15kg），简单粉碎，95%的乙醇70L，室温提取3次，每次6天，减压蒸馏的得到1.1kg乙醇提取物。然后将其悬混于4L水中，依次分别用石油醚6L，萃取4次，；乙酸乙酯6L，萃取4次；正丁醇6L，萃取4次；得到乙酸乙酯萃取浸膏150g。该浸膏通过硅胶色谱，以氯仿/甲醇梯度洗脱，得到7个馏分（Fr.1-Fr.7）。

第3个馏分（Fr.3）用LH-20，氯仿/甲醇（1：1）洗脱，等到3个馏分（Fr.3.1-Fr.3.3）；Fr.3.2通过硅胶色谱，氯仿/甲醇（25：1）洗脱，得到6个馏分（Fr.3.2.1-Fr.3.2.6）;Fr.3.2.2通过HPLC（MeOH/H₂O,1:1）制备得到化合物6（1.5mg）。

第6个馏分(Fr.6)用LH-20，氯仿/甲醇（1：1）洗脱，得到2个馏分（Fr.6.1-Fr.6.2）；Fr.6.2通过硅胶色谱，氯仿/甲醇（7：1）洗脱，得到8个馏分（Fr.6.2.1-Fr.6.2.8）;Fr.6.2.4通过HPLC（CH₃CN/H₂O，17:83）制备得到化合物4（21mg）和化合物5（17mg）。Fr.6.2.6通过C18色谱，使用MeOH/H₂O（45:55）洗脱，得到6个馏分（Fr.6.2.6.1- Fr.6.2.6.6）,Fr.6.2.6.2通过HPLC（CH₃CN/H₂O，1:3）制备得到化合物1（18mg）。Fr.6.2.7通过C18色谱，使用MeOH/H₂O（35:65）洗脱，得到3个馏分（Fr.6.2.7.1-Fr.6.2.7.3）,Fr.6.2.7.2通过HPLC（MeOH/H₂O,35:65）制备得到化合物7（42mg）。

第7个馏分(Fr.7)用LH-20，氯仿/甲醇（1：1）洗脱，得到4个馏分（Fr.7.1-Fr.7.4）；Fr.7.2通过C18色谱，使用MeOH/H₂O（35:65）洗脱，得到3个馏分（Fr.7.2.1-Fr.7.2.3）；Fr.7.2.3通过HPLC（CH₃CN/H₂O，1:2）制备得到化合物2（17mg）和化合物3（3.5mg）；Fr.7.3通过硅胶色谱，氯仿/甲醇（12：1）洗脱，得到3个馏分(Fr.7.3.1-Fr.7.3.3),Fr.7.3.1通过HPLC（MeOH/H₂O,1:4）制备得到化合物8（35mg）。

1.3 化合物结构鉴定

化合物1：

无色胶状固体，[α]²⁵ _D-52(c0.8,MeOH)；HR-ESI-MS([M+Na]⁺)谱中准分子离子峰m/z 425.1208，确定该化合物分子量为402，分子式为C₂₁H₂₂O₈。它紫外光谱在214.5,254.0,283.5和313.5nm有明显的紫外吸收，同已知的菲类化合物相比，确定化合物1为菲类化合物。¹H NMR（表1）有5个芳香质子[δ7.44(t,J=7.6Hz,H-7),7.40(d,J=7.6Hz,H-8),7.13(dd,J=7.6,1.4Hz,H-6)，7.54(d,J=8.8Hz，H-10)和7.62(d,J=8.8Hz，H-9)]，推测化合物1是个3取代的菲。含有一个甲氧基（δ_H 4.1,δ_C 59.1）,NOESY谱相关信号H-1/H-10和　OCH₃和H-3说明甲氧基与C-4相连。化合物1水解以后水相得到D- 吡喃葡萄糖，结合结合δ_H 5.11（d,J=7.3HZ,H-1′）和δ_C 102.7(C-1′)确定分子中有β-D-吡喃葡萄糖；HMBC谱远程相关信号：H-1′和C-2(δ157.9)，确定糖连接在C-2。红外光谱3427cm^-1提示化合物1含有羟基，结合分子式为C₂₁H₂₂O₈，表明存在1个羟基取代；HMBC谱远程相关信号：H-9/C-8和H-8/C-9的，确定羟基在C-5。

糖的鉴定方法：取1mg化合物1在dioxane(1mL)和10%H₂SO₄(1mL溶液中95℃酸水解3h，再用0.2M Ba(OH)₂中和，再用氯仿萃取3次，将水相过滤除去沉淀。再将水相减压蒸馏，得到糖。糖再通过醋酸酐(0.5mL)吡啶(0.25mL)在95℃反应12h，再通过氯仿萃取，再将氯仿部分减压蒸馏，得到乙酰化的糖。乙酰化的糖通过GC-MS与乙酰化的D-葡萄糖分析，证明此糖为葡萄糖。通过klyne规则鉴定糖的构型，证明此糖为D-葡萄糖。

综上所述，确认化合物1为2，5-二羟基-4-甲氧基菲2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。经系统文献查阅化合物1为一个未见报道的新化合物（具体核磁数据见表1）。

化合物2：

淡黄色胶状固体，[α]²⁵ _D-133(c 0.2,MeOH)；HR-ESI-MS([M+Na]⁺)给出准分子离子峰m/z 557.1629，确定该化合物分子量为534，分子式为C₂₆H₃₀O₁₂。它紫外光谱在214.5,254.0,283.5和313.5nm有明显的紫外吸收，同已知的菲类化合物相比，确定化合物2为菲类化合物。对比化合物2和化合物1的NMR谱（表1），化合物2比化合物1多了一个糖。HMBC谱远程相关信号：H-1″/C-6′相关信号确定这是一个二糖。糖的鉴定方法与化合物1相同，确定是D-葡萄糖和D-芹菜糖。因此，化合物为2为2，5-二羟基-4-甲氧基菲2-氧-β-D-呋喃芹菜糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。经系统文献查阅化合物2为一个未见报道的新化合物（具体核磁数据见表1）。

化合物3：

淡黄色胶状固体，[α]²⁵ _D-144(c 0.5,MeOH);HR-ESI-MS([M+Na]⁺)给出准分子离子峰m/z 571.1794，确定该化合物分子量为548，分子式为C₂₇H₃₂O₁₂。它紫外光谱在214.5,254.0,283.5和313.5nm有明显的紫外吸收，同已知的菲类化合物相比，确定化合物2为菲类化合物。对比化合物2和化合物1的NMR谱（表1），发现化合物3比化合物1多了一个糖。HMBC谱远程相关：H-1″/C-6′相关信号确定这是一个二糖。糖的鉴定方法与化合物1相同，确定是D-葡萄糖和L-鼠李糖。因此，化合物为3为2，5-二羟基-4-甲氧基菲2-氧-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。经系统文献查阅化合物3为一个未见报道的新化合物（具体核磁数据见表1）。

表1 化合物1-3的¹H和¹³C NMR(600 and 150MHz,MeOH-d₄)数据

化合物4：

淡黄色固体，[α]²⁵ _D+69(c 0.1,MeOH);HR-ESI-MS([M+Na]⁺)给出准分子离子峰m/z 297.0736，确定该化合物分子量为274，分子式为C₁₅H₁₄O₅。它紫外光谱11.0,274.5和307.0nm有明显的紫外吸收，同已知的二氢菲类化合物相比，确定化合物4为二氢菲类化合物。在¹HNMR（表2）可以确定有2对耦合的芳环质子δ 6.35(d,J=2.5Hz,H-1),6.30(d,J=2.5Hz,H-3),6.56(d,J=2.4Hz,H-6)和6.82(d,J=2.4Hz,H-8)；两个亚甲基质子δ 2.76(dd,J=13.8,3.9Hz,H-10),2.68(dd,J=13.8,11.0Hz,H-10)；一个次甲基质子δ 4.47(dd,J=11.0,3.9Hz)。含有一个甲氧基（δ_H 3.90,δ_C 58.0）；NOESY相关信号：H-10/H-1,H-8/H-9,OCH₃/H-6表明-OCH₃在C-5。通过红外光谱3420cm^-1和连氧的碳原子（δ 158.4,154.2,158.8,70.1）表明存在4个-OH。HMBC远程相关谱：H-1/C-2,C-3,C-4a;H-3/C-4,C-4a;H-6/C-4b,C-5,C-7;H-8/C-4b,C-6,C-7;H-10/C-4a,C-8a,C-10a表明4个-OH在C-2,C-4, C-7和C-9。对比化合物4和已知化合物(9S)-羟基-9,10-二氢菲的CD谱，有相同的负Cotton效应（234nm）和正Cotton效应（268nm）。综上所述，化合物4为5-甲氧基-2，4，7，9S-四羟基-9，10-二氢菲。经系统文献查阅化合物4为一个未见报道的新化合物（具体核磁数据见表2）。

化合物5：淡黄色固体，[α]²⁵ _D+62(c 0.15,MeOH);HR-ESI-MS([M+Na]⁺)给出准分子离子峰m/z 297.0736，确定该化合物分子量为274，分子式为C₁₅H₁₄O₅。它紫外光谱211.5,274.5和306.0有明显的紫外吸收，同已知的二氢菲类化合物相比，确定化合物5为二氢菲类化合物。对比化合物5和化合物4的NMR谱（表2），发现化合物5是化合物4同分异构体。NOESY相关信号：H-10/H-1,H-8/H-9,OCH₃/H-3表明-OCH₃在C-4。HMBC远程相关谱：H-1/C-2,C-3,C-4a;H-3/C-4,C-4a;H-6/C-4b,C-5,C-7;H-8/C-4b,C-6,C-7;H-10/C-4a,C-8a,C-10a表明4个-OH在C-2,C-5,C-7和C-9。综上所述，化合物5为4-甲氧基-2，5，7，9S-四羟基-9，10-二氢菲。经系统文献查阅化合物5为一个未见报道的新化合物（具体核磁数据见表2）。

化合物6：淡黄色固体，[α]²⁵ _D+80(c 1.5,MeOH);HR-ESI-MS([M+Na]⁺)给出准分子离子峰m/z 281.0784，确定该化合物分子量为258，分子式为C₁₅H₁₄O₄。它紫外光谱212.0,272.5和303.0有明显的紫外吸收，同已知的二氢菲类化合物相比，确定化合物5为二氢菲类化合物。含有一个甲氧基（δ_H 3.93,δ_C 57.9）；NOESY相关信号：H-10/H-1,H-8/H-9,OCH₃/H-6表明-OCH₃在C-5。通过红外光谱3434cm^-1提示化合物6含有羟基，结合分子式为C₁₅H₁₄O₄，确定还有3个-OH；HMBC远程相关谱：H-1/C-2,C-3,C-4a;H-2/C-4,C-10a;H-6/C-4b,C-5,C-7;H-8/C-4b, C-6;H-10/C-4a,C-8a,C-10a表明3个-OH在C-4,C-7和C-9。因此，化合物6为5-甲氧基-4，7，9S-三羟基-9，10-二氢菲。经系统文献查阅化合物6为一个未见报道的新化合物（具体核磁数据见表2）。

表2 化合物4-6的¹H和¹³C NMR(600 and 150MHz,MeOH-d₄)数据

化合物7：淡黄色固体，[α]²⁵ _D-60(c 0.9,MeOH);HR-ESI-MS([M+Na]⁺)给出准分子离子峰m/z 443.1318，确定该化合物分子量为429，分子式为C₂₁H₂₄O₉。它紫外光谱211.0,270.0和302.0有明显的紫外吸收，同已知的二氢菲类化合物相比，确定化合物6为二氢菲类化合物。¹HNMR（表3）可以确定有两个次甲基质子δ 2.85(dd,J=14.3,4.0Hz,H-10),2.79(dd,J=14.3,9.6Hz,H-10),一个甲氧基δ 3.96(s)和1个次甲基质子δ 4.57(brs)。NOESY谱相关信号H-1/H-10和　OCH₃ 和H-3说明甲氧基与C-4相连。化合物7水解以后水相得到D-吡喃葡萄糖，结合δ_H 5.07（d,J=7.2HZ,H-1′）和δ_C 102.5(C-1′)确定分子中有β-D-吡喃葡萄糖；HMBC谱远程相关信号：H-1′和C-2(δ 159.3)，确定糖连接在C-2。通过红外光谱3398cm^-1提示化合物7含有羟基，结合分子式为C₂₁H₂₄O₉，确定还有2个-OH；HMBC远程相关谱：H-1/C-2,C-3;H-3/C-4;H-6/C-4b,C-5;H-8/C-4b,C-6;H-10/C-4a,C-8a,C-10a表明2个-OH在C-5,C-9。

糖的鉴定方法：取3mg化合物7在dioxane(3mL)和10%H₂SO₄(3mL)溶液中95℃酸水解3h，再用0.2M Ba(OH)₂中和，再用氯仿萃取3次，将水相过滤除去沉淀。再将水相减压蒸馏，得到糖,测定其旋光[α]²⁵ _D +51.1(c 0.3,H₂O)。。糖再通过醋酸酐(1.5mL)吡啶(0.75mL)在95℃反应12h，再通过氯仿萃取，再将氯仿部分减压蒸馏，得到乙酰化的糖。乙酰化的糖通过GC-MS与乙酰化的D-葡萄糖分析，证明此糖为D-葡萄糖。

综上所述，化合物7为4-甲氧基-2，5，9S-三羟基-9，10-二氢菲2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。经系统文献查阅化合物7为一个未见报道的新化合物（具体核磁数据见表3）。

化合物8：淡黄色固体，[α]²⁵ _D-46(c 0.3,MeOH);HR-ESI-MS([M+Na]⁺)给出准分子离子峰m/z 429.1156，确定该化合物分子量为406，分子式为C₂₀H₂₂O₉。它紫外光谱211.0,270.0和302.0有明显的紫外吸收，同已知的二氢菲类化合物相比，确定化合物6为二氢菲类化合物。化合物8的¹H NMR and ¹³C NMR（表3）和化合物7相似，只是化合物8没有甲氧基。HMBC远程相关谱：H-1′/C-5表明糖连接在C-5。通过分子式C₂₀H₂₂O₉和红外光谱3420cm^-1，我们可以确认还有3个-OH，NOESY信号： H-1/H-10;H-8/H-9和HMBC信号：H-1/C-2,C-3;H-3/C-4;H-6/C-4b,C-5;H-8/C-4b,C-6;H-10/C-4a,C-8a,C-10a表明3个-OH在C-2,C-4和C-9。

糖的鉴定方法和化合物7相同。综上所述，化合物8为1，2，5，9S-四羟基-9，10-二氢菲2-氧-β-D-葡萄糖苷。经系统文献查阅化合物8为一个未见报道的新化合物（具体核磁数据见表3）。

表3 化合物7，8的¹H和¹³C NMR(600 and 150MHz,MeOH-d₄)数据

某些本发明从天然产物中分离得到的代表性实例化合物如下：

化合物1，化合物1为2，5-二羟基-4-甲氧基菲2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子量402，分子式C₂₁H₂₂O₈，结构式：

化合物2，化合物2为2，5-二羟基-4-甲氧基菲2-氧-β-D-呋喃芹菜糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子量534，分子式C₂₆H₃₀O₁₂，结构式：

化合物3，化合物3为2，5-二羟基-4-甲氧基菲2-氧-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子量548，分子式C₂₇H₃₂O₁₂，结构式：

化合物4，化合物4为5-甲氧基-2，4，7，9S-四羟基-9，10-二氢菲，分子量274，分子式C₁₅H₁₄O₅，结构式：

化合物5，化合物5为4-甲氧基-2，5，7，9S-四羟基-9，10-二氢菲，分子量274，分子式C₁₅H₁₄O₅，结构式：

化合物6，化合物6为5-甲氧基-4，7，9S-三羟基-9，10-二氢菲，分子量258，分子式C₁₅H₁₄O₄，结构式：

化合物7，化合物7为4-甲氧基-2，5，9R-三羟基-9，10-二氢菲2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子量420，分子式C₂₁H₂₄O₉，结构式：

化合物8，化合物8为1，2，5，9R-四羟基-9，10-二氢菲2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子量406，分子式C₂₀H₂₂O₉，结构式：

实施例2：本发明化合物的合成制备

本发明通式化合物I可以根据以下流程图1来制备，其中取代基R⁸、R⁹、R¹⁰如前面对通式I化合物中的取代基定义。

向50mL两颈瓶中加入化合物A（3.5mmol）和化合物B（7mmol），接上回流冷凝装置，抽气，氮气保护。经针头注射加入乙酸酐（20mL）和三乙胺（5mL）之后，混合物在回流条件下反应6小时。反应结束后，将反应液缓慢倒入装有大量冰水的烧杯中，保持搅拌，此时有固体析出。混合物经过滤之后，得到的固体于乙醇中重结晶，得到化合物C。

向50mL圆底烧瓶中加入化合物C（5.56mmol）、铜粉（28.8mmol）和喹啉（20mL），将混合物置于200摄氏度下反应2小时。反应体系冷却之后，加入乙酸乙酯。铜粉经硅藻土过滤除去之后，滤液用盐酸（1mol/L）处理，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层依次用饱和碳酸钠溶液、水、饱和食盐水清洗。有机层经硫酸镁干燥之后，旋蒸出去溶剂，得到的粗产品经硅胶柱色谱（石油醚/乙酸乙酯体系）分离纯化，得到化合物D。

向100mL两颈瓶中加入化合物D（0.16mmol）、碘（0.16mmol）、环氧丙烷（90mmol）和环己烷（500mL），通入无水氮气，持续20分钟。溶液用500W汞灯照射约三天，直到反应完毕。反应液一次用15%的硫代硫酸钠、水和饱和食盐水清洗，分离出有机层，并用硫酸镁干燥。旋蒸除去溶剂，得到的粗产品经硅胶柱色谱（石油醚/乙酸乙酯体系）纯化，得到化合物Ⅰ。

本发明通式化合物II可以根据以下流程图2来制备，其中取代基R¹-R⁷如前面对通式II化合物中的取代基定义。

向50mL两颈瓶中加入化合物J（3.5mmol）和化合物K（7mmol），接上回流冷凝装置，抽气，氮气保护。经针头注射加入乙酸酐（20mL）和三乙胺（5mL）之后，混合物在回流条件下反应6小时。反应结束后，将反应液缓慢倒入装有大量冰水的烧杯中，保持搅拌，此时有固体析出。混合物经过滤之后，得到的固体于乙醇中重结晶，得到化合物L。

向50mL圆底烧瓶中加入化合物L（5.56mmol）、铜粉（28.8mmol）和喹啉（20mL），将混合物置于200摄氏度下反应2小时。反应体系冷却之后，加入乙酸乙酯。铜粉经硅藻土过滤除去之后，滤液用盐酸（1mol/L）处理，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层依次用饱和碳酸钠溶液、水、饱和食盐水清洗。有机层经硫酸镁干燥之后，旋蒸出去溶剂，得到的粗产品经硅胶柱色谱（石油醚/乙酸乙酯体系）分离纯化，得到化合物M。

向100mL两颈瓶中加入化合物M（0.16mmol）、碘（0.16mmol）、环氧丙烷（90mmol）和环己烷（500mL），通入无水氮气，持续20分钟。溶液用500W汞灯照射约三天，直到反应完毕。反应液一次用15%的硫代硫酸钠、水和饱和食盐水清洗，分离出有机层，并用硫酸镁干燥。旋蒸除去溶剂，得到的粗产品经硅胶柱色谱（石油醚/乙酸乙酯体系）纯化，得到化合物N。

向10mL圆底烧瓶中加入化合物N（1.7mmol）、铜铬氧化物（15mg）和环己烷（3mL），抽气。接上氢气球，从20摄氏度开始，搅拌下加温至150摄氏度，反应2小时。反应结束后，催化剂经过滤除去，再旋蒸除去环己烷，产品经硅胶柱色谱（石油醚/乙酸乙酯体系）纯化之后，得到化合物Ⅱ。

已经或可以通过本文描述的方法制备的某些示例化合物列于下表4。

表4 根据流程图1制备得到的本发明的示例化合物

实施例3：本发明化合物的抑制NO产生的活性作用。

3.1 材料

化合物（1-33）；小鼠RAW264.7巨噬细胞；内毒素（LPS 1μg/mL）；BAY（10μM，阳性对照）NO检测试剂盒（Beyotime,Haimen,China）；

3.2 主要仪器

荧光酶标仪（Thermo Scienti fic,Waltham,MA,USA）

3.3 方法

3.3.1 LPS刺激RAW264.7巨噬细胞生成NO的测定

接种RAW264.7巨噬细胞于96-孔板，每孔接种1×10⁴细胞，待接种细胞贴壁以后，加入待测化合物（1-8）抚育2h，然后加入LPS（终浓度为1μg/mL），培养24h。最后取96孔板培养基，用NO试剂盒进行检测，NO的含量通过测定其OD₅₅₀来表示。每次实验取3个复孔，重复3次实验。

3.3.2 NO抑制率的计算

NO的抑制率（%），根据以下公式进行计算：

%抑制率=(A-B)/(A-C)×100

A:LPS(＋),化合物(－);B::LPS(＋),化合物(＋);C:LPS(－),化合物(－).

3.3.3 统计方法

所有的统计方法均使用GraphPad Prism 5.01软件进行处理。数据以平均数±标准误差表示，数据使用单因素方差分析（ANOVA）。p<0.05

3.4 结果

33个化合物对抑制LPS刺激RAW264.7巨噬细胞生成NO活性有所不同（表5）

表5 化合物（1-33）对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞生成NO的影响

n=3，

p＜0.05

实施例4：本发明化合物的毒性测定

4.1 材料

化合物（1-33）；小鼠RAW264.7巨噬细胞；Alamar-Blue试剂

4.2 主要仪器

荧光酶标仪（Thermo Scienti fic,Waltham,MA,USA）

4.3 方法

4.3.1 化合物（1-33）对RAW264.7巨噬细胞增值的影响

接种RAW264.7巨噬细胞于96-孔板，每孔接种1×10⁴细胞，待接种细胞贴壁以后，加入待测化合物（1-8）抚育24h，。然后每个每孔加入Am-Blue细胞增殖与活性检测试剂(SunBio^TM)10μL并于培养箱中孵育2～6小时。当培养基的颜色由靛青蓝变成粉红色后用荧光酶标仪测定各孔相对荧光单位(RFU值)，激发光波长560nm，发射光波长590nm。每次实验取3个复孔，重复3次实验。

4.3.2 统计方法

4.4 结果

34种化合物对RAW264.7巨噬细胞增值没有显著的抑制作用（表6）。

表6 化合物（1-33）RAW264.7巨噬细胞增值的影响

n=3，

p＜0.05

实施例5：本发明化合物对LPS介导的炎症信号通路相关蛋白的影响

5.1 材料

化合物1，化合物4，；小鼠RAW264.7巨噬细胞；BAY（10μM，NF-κB抑制剂）；SB203580（10μM，磷酸化p38

增强化学发光检测系统（Amersham Bioscience,Piscataway,NJ,USA）

5.3 方法

5.3.1 Western Immunoblotting检测

接种RAW264.7巨噬细胞于6孔板，过夜培养，加入不同浓度的化合物1和化合物4（1,10,50μM）抚育2h，然后加入LPS分别刺激45min（phospho-p38），30min（phospho-IκBα and phospho-JNK），18h（iNOS）。去掉6孔板中的培养基，加入细胞裂解液，蛋白酶和磷酸酶抑制剂，获得细胞总蛋白。蛋白含量采用BCA方法进行定量。

取等量的细胞裂解液（50μg）加入loading buffer，沸煮5分钟，再进行SDS-PAGE（10%）凝胶电泳。电泳以后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜，用5％牛血清白蛋白封闭2h；再加入相应的抗体（anti-phospho-p38 MAPK,anti-p38 MAPK,anti-GAPDH，anti-iNOS,anti-phospho-JNK,anti-JNK,anti-phospho-IκBα）4℃抚育过夜。然后将膜与辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，再用增强化学发光检测系统成像。每条蛋白带的信号强度使用计算机图像分析系统处理（Quantity One,Bio-Rad,Hercules,CA,USA）。

5.3.2 BCA蛋白定量方法

(1)BCA工作液配制。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

(2)蛋白标准工作液配置：根据样品数量配置相应体积的蛋白标准工作液。将蛋白质标准储备液用双蒸水5倍稀释，配成1mg/mL的工作液。

(3)标准曲线绘制。取一块酶标板，按以下表7数据加入试剂：

表7 蛋白质标准曲线

(4)振荡混匀后，37℃放置30分钟。

(5)用酶标仪测定A562，以不含BCA的光吸收值为空白对照。

(6)以蛋白含量(g)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。

(7)样品测定：取待测蛋白样品（细胞裂解液）4μL用去离子水补足20μL，加入200μL BCA工作液，混匀后37℃放置30分钟，然后以0号孔为对照，测定样品吸收值A562。

(8)根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。

(9)计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量除以样品体积4μL即可得到待测样品的实际浓度(μg/μL)。

5.4 结果

(1)化合物1和化合物4可以明显的抑制一氧化氮合成酶（iNOS）的表达，并且有明显的浓度依赖关系（图1）。结果表明化合物1和化合物4是通过抑制iNOS的表达，来抑制LPS诱导RAW264.7细胞NO的生成。

(2)化合物1和化合物4可以明显的抑制p38和JNK蛋白的磷酸化水平（图2）。结果表明化合物1和化合物4通过抑制p38和JNK蛋白的磷酸化水平，来负调控iNOS的表达。

(3)化合物1和化合物4可以明显的抑制IκBα蛋白的磷酸化水平（图3）。结果表明化合物1和化合物4通过抑制IκBα蛋白的磷酸化水平，进而抑制NF-κB的产生，从而负调控iNOS的表达。

Claims

1.一类抑制细胞炎症因子产生和NF-κB、MAPKs信号通路的化合物或其医药上可以接受的盐，其特征在于，该类化合物的结构为如下通式（Ⅰ）所示：

条件是，R⁸，R⁹和R¹⁰中至少有一个为糖基。

2.一类抑制细胞炎症因子产生和NF-κB、MAPKs信号通路的化合物或其医药上可以接受的盐，其特征在于，该类化合物的结构为如下通式（Ⅱ）所示：

R³选自：-OH、甲氧基、乙酰基、卤素、甲基、乙基、氰基、硝基、氨基、卤代C_1-8烷基、糖基；

并且该通式（Ⅱ）化合物中的母核二氢菲C-9、C-10的构型可以独立的选自R和/或S构型。

3.根据权利要求1或2所述的化合物或其医药上可以接受的盐，其特征在于，通式（Ⅰ）或（Ⅱ）中所述的糖基为D/L-葡萄糖，D/L-鼠李糖，D/L-芹菜糖，D/L-果糖，D/L-木糖；去甲基葡萄糖，去甲基鼠李糖，去甲基芹菜糖，去甲基果糖，去甲基木糖；卤代葡萄糖，卤代鼠李糖，卤代芹菜糖，卤代果糖，卤代木糖；乙酰化葡萄糖，乙酰化鼠李糖，乙酰化芹菜糖，乙酰化果糖，乙酰化木糖；氨基葡萄糖，氨基鼠李糖，氨基芹菜糖，氨基果糖或氨基木糖。

4.根据权利要求1或2的化合物或其医药上可以接受的盐，其特征在于，所述化合物为：

2，5-二羟基-4-甲氧基菲2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；

2，5-二羟基-4-甲氧基菲2-氧-β-D-呋喃芹菜糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

2，5-二羟基-4-甲氧基菲2-氧-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

5-甲氧基-2，4，79S-四羟基-9，10-二氢菲；

4-甲氧基-2，5，79S-四羟基-9，10-二氢菲；

5-甲氧基-4，7，9S-三羟基-9，10-二氢菲；

4-甲氧基-2，5，9R-三羟基-9，10-二氢菲2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；

1，2，5，9R-四羟基-9，10-二氢菲2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；

4，5-二羟基-2-甲氧基菲3-氧-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

2，4，5-三羟基2-氧-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

2，4，5-三羟基4-氧-α-L-吡喃鼠李糖苷；

2，4，5-三羟基2-氧-α-L-吡喃鼠李糖苷；

2，5-二羟基-4-溴2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；

2-羟基-4，5-二溴2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；

2，4-二羟基-5-溴2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；

2，4-二羟基-5-氰基2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；

2-羟基-4，5-二乙酰基2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；

2-二羟基-4-氯-5-甲氧基2-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；

2，9-二羟基-4，7-二乙酰基二氢菲；

2，7-二甲氧基-3，4-二乙酰基-9-羟基二氢菲；

2，7-二乙酰基-4-溴-9-羟基二氢菲；

2，4-二甲氧基-7-氯-9羟基二氢菲；

2，4，10-三甲氧基-7-溴-9-羟基二氢菲；

2，7-二乙酰基-4-溴二氢菲；

2，4，7-三甲氧基-6-氰基-9-羟基二氢菲；

2，4-二甲氧基-6-氰基-9-羟基二氢菲；

2，4，7，10-四甲氧基-9-羟基二氢菲；

2，4，10-三甲氧基-7，9-二羟基二氢菲；

2，7-二乙酰基-4-溴-9-羟基二氢菲；

4，7-二乙酰基-9-羟基-10-氰基二氢菲；

2，4,7-三乙酰基-9-羟基-10氰基二氢菲；

2，4，9,10-四甲氧基-7-羟基二氢菲；

2，4,10-三甲氧基-7-硝基-9-羟基二氢菲。

5.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的化合物或其医药上可接受的盐以及药用载体或稀释剂。

6.权利要求1-3中任一项定义的化合物其医药上可以接受的盐在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其特征在于，在所述的疾病中抑制炎症因子活性是需要的和/或必须的，其中所述的抑制炎症因子包括一氧化氮（NO）、INF-α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6。

7.权利要求1-3中任一项定义的化合物其医药上可以接受的盐在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其特征在于，在所述的疾病中抑制NF-κB信号通路和/或MAPKs信号通路是活性需要的和/或必须的。

8.权利要求1-3中任一项定义的化合物其医药上可以接受的盐在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其特征在于，所述的疾病是炎症和/或与NF-κB信号通路和/或MAPKs信号通路相关的疾病。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中的炎症为具有炎性成分的疾病。

10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，其中的具有炎性成分的疾病为炎性肠病、过敏性肠综合症、偏头痛、头痛、病毒感染、细菌感染、真菌感染、病痛、动脉粥样硬化、关节炎、骨关节炎、幼年型关节炎、类风湿性关节炎、发热、脊柱炎、红斑狼疮、血管炎、胰腺炎、肾炎、结膜炎、虹膜炎、巩膜炎或葡萄膜炎。