CN110156854A - 一种二氢菲苷类化合物及其提取分离方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二氢菲苷类化合物及其提取分离方法和应用，本发明首次从植物流苏虾脊兰的根茎中分离得到了一种二氢菲苷类化合物，其分子式为C22H26O10。本发明中采用特殊的亲水色谱柱，能将其很好地分离纯化得到，具有方法简便有效，得到的化合物纯度高的特点。本发明能够从流苏虾脊兰干燥根茎中提取分离出二氢菲苷类化合物，该化合物能够有效的降血脂和抗胃溃疡。
Description
技术领域
本发明属于医药及保健食品领域，涉及一种二氢菲苷类化合物及其提取分离方法和应用。
背景技术
随着经济的迅猛发展和人们生活方式的改变，心脑血管疾病和胃溃疡已成为人们身体健康的头号杀手。降低血脂、改善血脂异常在临床治疗中能降低心脑血管病发生率和死亡率。目前临床上治疗高血脂以及胃溃疡的药物存在着一定的副作用等缺点，而天然的植物药以其分布广泛，材料易得且价格低廉，毒副作用小等优势受到人们的重视，具有广阔的应用前景。
兰科(Orchidaceae)虾脊兰属(Calanthe)植物流苏虾脊兰(Calanthe fimbriataFranch)的假鳞茎和全草，别名肉莲环或九子连，产地包括陕西、甘肃、云南、四川、西藏和台湾等省区，在锡金和日本也有该植物的分布。常生长于海拔1500-3500米的山地林下及草坡上。其味淡，微辛、苦，性凉。有小毒。归胃、肝、肺经。具有清热解毒，消肿止痛，散瘀等功效。
目前，国内外对整个虾脊兰属植物的研究主要集中于观赏价值、栽培技术以及育种方法等方面，而对其有效成分及药理活性的研究则少见报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种二氢菲苷类化合物及其提取分离方法和应用，能够从流苏虾脊兰中提取分离出二氢菲苷类化合物，该化合物具有降血脂和胃黏膜保护作用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种二氢菲苷类化合物，该二氢菲苷类化合物的分子式为C22H26O10，结构式如下式：
本发明还公开了上述的二氢菲苷类化合物的提取分离方法，包括以下步骤：
1)取流苏虾脊兰干燥根茎，回流提取若干次，合并提取液，将提取液减压浓缩，得到总浸膏或浓缩液；
2)将总浸膏混悬于水中，得到浸膏液，将浸膏液或浓缩液依次经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取若干次后分离出有机层，减压除去溶剂得到各萃取层；
3)将正丁醇萃取层上样于硅胶柱，以氯仿-甲醇系统作为洗脱液，按体积比(100:0)～(0:100)进行梯度洗脱，对流出液进行检测，将洗脱液体积比为5:1的流份合并，除去溶剂，得到第一次过柱部分；
4)将第一次过柱部分上样于反相硅胶层析柱，以甲醇-水系统作为洗脱液，按体积比(10:90)～(100:0)进行梯度洗脱，将洗脱液体积比为30:70的流份合并，除去溶剂，得到第二次过柱部分；
5)将第二次过柱部分上样于高效液相色谱分离柱，用流动相进行等度洗脱，得到二氢菲苷类化合物。
优选地，步骤1)中，回流提取中采用甲醇、水或体积分数10％～95％的乙醇作为提取剂，流苏虾脊兰干燥根茎与提取剂的料液比为1kg：(1～5)L；回流提取次数为1～6次，每次1～3h。
进一步优选地，当提取剂为甲醇或体积分数10％～95％的乙醇时，将得到的提取液中溶剂回收得到总浸膏；当提取剂为水时，将提取液的体积浓缩至1/10～1/6，得到浓缩液。
优选地，步骤2)中，将总浸膏混悬于水中，总浸膏和水的体积比为1:1～1:4；
萃取时，依次经石油醚和乙酸乙酯萃取后，再经过正丁醇萃取；每次萃取均是等体积萃取；每种溶剂分别萃取1～6次。
优选地，步骤3)中，梯度洗脱后每300～800mL收集一个流份；步骤4)中，梯度洗脱后每100～300mL收集一个流份。
步骤5)中，流动相选择甲醇-水系统或乙腈-水系统，等度洗脱的流速为3～5mL/min。
进一步优选地，甲醇-水系统中甲醇和水的体积比为35：65；乙腈-水系统中乙腈和水的体积比为40:60。
本发明还公开了上述的二氢菲苷类化合物在制备降血脂药物和/或保健食品中的应用。
本发明还公开了上述的二氢菲苷类化合物在制备胃黏膜保护药物和/或保健食品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次从植物流苏虾脊兰的根茎中分离得到了一种二氢菲苷类化合物，其分子式为C22H26O10。本发明中采用特殊的亲水色谱柱，能够从植物流苏虾脊兰的根茎中有效分离出二氢菲苷类化合物，提取分离方法简便有效，得到的化合物纯度高。
本发明中的二氢菲苷类化合物具有降血脂作用，经试验证明，对橄榄油诱导的高血脂小鼠具有一定的降血脂作用，该化合物具有高效、低毒的特点，有望开发成新的降血脂药物，或者用于制备具有预防和治疗高血脂的保健食品。
本发明中的二氢菲苷类化合物具有胃黏膜保护作用，经试验证明，对乙醇诱导的小鼠胃溃疡具有一定的抵抗作用，该化合物具有高效、低毒的特点，有望开发成新的抗胃溃疡药物，或者用于制备具有预防和治疗胃溃疡的保健食品。
附图说明
图1为本发明化合物的1H-NMR图谱；
图2为本发明化合物的13C-NMR图谱；
图3为本发明化合物的DEPT图谱；
图4为本发明化合物的1H-1H COSY图谱；
图5为本发明化合物的HSQC图谱；
图6为本发明化合物的HMBC图谱；
图7为本发明化合物的NOESY图谱；
图8为本发明化合物的HR-ESI-MS图谱。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明公开的从流苏虾脊兰提取二氢菲苷类化合物的方法，包括以下步骤：
1)取一定质量(kg)的流苏虾脊兰干燥根茎，用体积为流苏虾脊兰干燥根质量1～5倍量的甲醇、体积分数为10～95％的乙醇或水(L)在各自沸点附近加热回流提取1～6次，每次1～3小时，当提取剂为甲醇或体积分数10～95％的乙醇时，合并提取液减压回收除去溶剂，得到总浸膏，当提取剂为水时，合并提取液并将其体积浓缩至六分之一到十分之一，得到浓缩液；
2)将总浸膏混悬于水中，总浸膏和水的体积比为1:1～1:4，得到浸膏液，浸膏液或浓缩液分别依次用等体积的有机溶剂萃取，其中，第一次萃取时用石油醚对浸膏液或浓缩液进行等体积萃取，之后每次萃取均是分离出上一次萃取后的有机层，将剩余的水层用有机溶剂等体积进行下一次萃取；每种溶剂各萃取1～6次，合并萃取液，常压或减压蒸馏除去有机溶剂，分别得到各萃取层和水层。有机溶剂包括石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等，且萃取次序为先用极性小的溶剂，再用极性大的有机溶剂，石油醚和乙酸乙酯可以省去。
3)取正丁醇萃取层，通过采用柱层析纯化等分离方法，得到本发明的二氢菲苷类化合物。
柱层析包括以下三个阶段：
第一阶段：将正丁醇萃取层上样于硅胶柱，以氯仿-甲醇系统作为洗脱液，按体积比(100:0)～(0:100)进行梯度洗脱，每300～800mL收集一个流份，对流出液进行TLC检测，合并相同流份，共得到15个流份，分别命名为FrB1-FrB15，常压或减压蒸干溶剂，取其中的FrB7流份，即洗脱液体积比为5:1的流份，作为第一次过柱部分；
第二阶段：将第一次过柱部分，上样于反相硅胶层析柱，以甲醇-水系统作为洗脱液，按体积比(10:90)～(100:0)进行梯度洗脱，每100～300mL收集一个流份，对流出液进行TLC检测，合并相同流份，减压除去溶剂，得到10个流份，分别命名为FrB7.1-FrB7.10，将FrB7.6流份，即洗脱液体积比为30:70的流份，作为第二次过柱部分；
第三阶段：将第二次过柱部分，上样于高效液相色谱分离柱，分离得到二氢菲苷类化合物。
其中，高效液相色谱分离柱为江苏汉邦的Megres C18柱，高效液相色谱分离是用示差折光检测器，以甲醇-水系统或乙腈-水系统作为流动相，按3～5mL/min进行等度洗脱。甲醇-水系统中甲醇和水的体积比为35:65；乙腈-水系统中乙腈和水的体积比为40：60。
上述方法制备得到的二氢菲苷类化合物，其结构式如下：
本发明中的二氢菲苷类化合物在制备降血脂药物和/或保健食品中的应用：在对流苏虾脊兰进行化学成分和药理活性的研究中发现，从中分离得到的二氢菲苷类化合物具有降血脂作用，经试验证明，对橄榄油诱导的高血脂小鼠具有一定的降血脂作用，因此，有望将其开发成具有降血脂作用的药物和/或保健食品。
本发明中的二氢菲苷类化合物在制备胃黏膜保护药物和/或保健食品中的应用：经试验证明，对乙醇诱导的小鼠胃溃疡具有一定的抵抗作用，该化合物具有高效、低毒的特点，因此有望开发成新的抗胃溃疡药物，或者用于制备具有预防和治疗胃溃疡的保健食品。
实施例1
一种二氢菲苷类化合物的提取分离方法，包括以下步骤：
1)取流苏虾脊兰干燥根茎10kg，用体积量为流苏虾脊兰干燥根茎质量5倍的甲醇加热回流提取4次，每次3小时，合并提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
2)将总浸膏混悬于4倍量水中，用石油醚等体积萃取4次，然后经乙酸乙酯和正丁醇等体积萃取4次，萃取层减压除去溶剂后分别得到石油醚层，乙酸乙酯层，正丁醇层。
3)取正丁醇萃取层70g，首先通过采用硅胶柱色谱，氯仿/甲醇按体积比(v/v)为100:0～0:100进行梯度洗脱，每500mL收集一个流份，经TLC检识合并相同流份后共得到15个流份(FrB1-FrB15)。
4)其中第7个流份FrB7经反相硅胶柱色谱分离，用MeOH/H2O按体积比(v/v)为10:90～100:0进行梯度洗脱，每200mL收集一个流份，经TLC检识合并相同流份后得到10个流份(FrB7.1-FrB7.10)。
5)然后FrB7.6用半制备高效液相色谱纯化，采用Megres C18柱，流动相是甲醇-水溶液(35:65,v/v)，流速为3.0mL/min，得到该化合物(tR＝24min)。
本发明通过理化常数和现代波谱学技术手段(HR-ESI-MS，1D-NMR，2D-NMR)鉴定化合物的结构，该化合物为：(2S,3R,4S,5S,6R)-2-((4,6-dihydroxy-5,7-dimethoxy-9,10-dihydrophenanthren-1-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol。
上述化合物的结构鉴定相关图谱参见图1～图8。
该化合物为无色油状物，其HR-ESIMS显示准分子离子峰为[M+H]+at m/z451.15931(calcd451.15987)，因此确定分子式为C22H26O10。酸水解后用GC分析发现所连的糖为β-D构型葡萄糖，在13C-NMR中有12个芳香碳表明分子中有两个苯环且通过1H-NMR表明一个为四取代一个为五取代且二者相连，另外在DEPT谱中可看到δC30.93,24.03为两个仲碳且通过δH 2.57和δH 2.85在1H-1H COSY中相关表明这两个仲碳相连，再加上在HMBC中H-1和C-10相关，H-7和C-9相关表明该苷元为二氢菲。在NOESY中，H-7和H-1′相关表明H-7和葡萄糖相邻，H-1和H-10、2-OCH3相关表明2-OCH3和H-1相邻。在HMBC中，H-1′和C-8相关，2-OCH3和C-2相关，4-OCH3和C-4相关；C-1和C-2,C-3,C-4,C-4a及C-10a相关；C-6和C-8、C-4b及C-8a相关；C-7和C-9、C-5、C-8a及C-4b相关，因此，该结构最终被确定为：
(2S,3R,4S,5S,6R)-2-((4,6-dihydroxy-5,7-dimethoxy-9,10-dihydrophenanthren-1-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol
是一个未见文献报道的新化合物。化合物结构式如下：
核磁数据见表1。
表1本发明中化合物的1H NMR和13C NMR数据
实施例2
一种二氢菲苷类化合物的提取分离方法，包括以下步骤：
1)取流苏虾脊兰干燥根茎10kg，用体积量为流苏虾脊兰干燥根茎质量3倍的95％乙醇加热回流提取5次，每次2小时，合并提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
2)将总浸膏混悬于3倍量水中，用石油醚等体积萃取4次，然后经氯仿，乙酸乙酯和正丁醇等体积萃取4次，萃取层减压除去溶剂后分别得到石油醚层，氯仿层，乙酸乙酯层，正丁醇层。
3)取正丁醇萃取层70g，首先通过采用硅胶柱色谱，氯仿/甲醇按体积比(v/v)为100:0～0:100进行梯度洗脱，每400mL收集一个流份，经TLC检识合并相同流份后共得到15个流份(FrB1-FrB15)。
4)其中第7个流份FrB7经反相硅胶柱色谱分离，用MeOH/H2O按体积比(v/v)为10:90～100:0进行梯度洗脱，每300mL收集一个流份，经TLC检识合并相同流份后得到10个流份(FrB7.1-FrB7.10)。
5)然后FrB7.6用半制备高效液相色谱纯化，采用Megres C18柱，流动相是甲醇-水溶液(35:65,v/v)，流速为3.0mL/min，得到该化合物(tR＝24min)。
实施例3
一种二氢菲苷类化合物的提取分离方法，包括以下步骤：
1)取流苏虾脊兰干燥根茎10kg，用体积量为流苏虾脊兰干燥根茎质量8倍的水加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
2)将总浸膏混悬于1倍量水中，用乙酸乙酯等体积萃取4次，然后再用正丁醇等体积萃取4次，萃取层减压除去溶剂后分别得到乙酸乙酯层，正丁醇层。
3)取正丁醇萃取层70g，首先通过采用硅胶柱色谱，氯仿/甲醇按体积比(v/v)为100:0～0:100进行梯度洗脱，每600mL收集一个流份，经TLC检识合并相同流份后共得到15个流份(FrB1-FrB15)。
4)其中第7个流份FrB7经反相硅胶柱色谱分离，用MeOH/H2O按体积比(v/v)为10:90～100:0进行梯度洗脱，每200mL收集一个流份，经TLC检识合并相同流份后得到10个流份(FrB7.1-FrB7.10)。
5)然后FrB7.6用半制备高效液相色谱纯化，采用Megres C18柱，流动相是乙腈-水溶液(40:60,v/v)，流速为3.0mL/min，得到该化合物(tR＝25min)。
实施例4
一种二氢菲苷类化合物的提取分离方法，包括以下步骤：
1)取流苏虾脊兰干燥根茎10kg，用体积量为流苏虾脊兰干燥根茎质量4倍的10％乙醇加热回流提取4次，每次2小时，合并提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
2)将总浸膏混悬于4倍量水中，用乙酸乙酯等体积萃取3次，然后再用正丁醇等体积萃取3次，萃取层减压除去溶剂后分别得到乙酸乙酯层，正丁醇层。
3)取正丁醇萃取层70g，首先通过采用硅胶柱色谱，氯仿/甲醇按体积比(v/v)为100:0～0:100进行梯度洗脱，每500mL收集一个流份，经TLC检识合并相同流份后共得到15个流份(FrB1-FrB15)。
4)其中第7个流份FrB7经反相硅胶柱色谱分离，用MeOH/H2O按体积比(v/v)为10:90～100:0进行梯度洗脱，每300mL收集一个流份，经TLC检识合并相同流份后得到10个流份(FrB7.1-FrB7.10)。
5)然后FrB7.6用半制备高效液相色谱纯化，采用Megres C18柱，流动相是甲醇-水溶液(35:65,v/v)，流速为3.0mL/min，得到该化合物(tR＝24min)。
对上述化合物进行药理药效试验，结果如下：
1、小鼠橄榄油负荷试验
实验方法：
将禁食12h，禁水1h的小鼠随机分别为模型组，阳性药组，样品组分为样品低剂量组(50mg/kg)，样品高剂量组(100mg/kg)，测其给药前0h的血脂值，之后，模型组灌胃给予5％阿拉伯胶，阳性药组灌胃给予奥利司他(125mg/kg)，样品组灌胃给予相应的样品，30min后，灌胃给橄榄油(10mL/kg)，分别于2h，4h眼眶静脉采血，离心取血清，采用试剂盒测定血浆中甘油三酯的浓度。
实验结果如表2所示：
表2本发明化合物对橄榄油诱导的高血脂小鼠的降血脂作用
结果分析：表2的数据表明，奥利司他组与低剂量组(50mg/kg)、高剂量(100mg/kg)组于2h，4h与模型组相比小鼠甘油三酯浓度均显著性降低，且高剂量组效果要优于阳性药组，因此说明该化合物具有降低橄榄油负荷小鼠血浆中甘油三酯浓度的作用。
2、胃黏膜保护实验
实验方法：将体重为20～25g左右的健康昆明雄性小鼠随机分成6组，每组8只，即空白对照组，模型对照组，阳性对照组，化合物低、中、高剂量组。化合物的低、中、高剂量组各灌胃给药20,40和80mg/kg,阳性对照组灌胃给予奥美拉唑20mg/kg,空白组和模型组给予等体积生理盐水。给药1h后灌胃给予70％乙醇0.1ml，空白组给予等量的生理盐水。1h后颈椎脱臼法将小鼠处死后剖腹快速取出胃，然后用10％的甲醛固定10～15min，沿大弯剪开用生理盐水冲洗干净后展平并将水分吸干。利用游标卡尺对小鼠的溃疡面积进行精密计算：按Guth标准展开溃疡指数及抑制率的计算。
溃疡抑制率＝(平均模型组UI-平均实验组UI)/平均模型组UI×100％
实验结果如表3所示：
表3本发明化合物对乙醇诱导的小鼠胃溃疡的抑制作用
结果分析：表3的数据表明，本发明中的化合物具有一定的抗胃溃疡作用，对乙醇诱导的小鼠胃溃疡具有一定的抵抗作用，剂量在40和80mg/kg时效果非常明显，说明本发明中的二氢菲苷类化合物具有一定的抗胃溃疡作用。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种二氢菲苷类化合物，其特征在于，该二氢菲苷类化合物的分子式为C22H26O10，结构式如下式：
2.权利要求1所述的二氢菲苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取流苏虾脊兰干燥根茎，回流提取若干次，合并提取液，将提取液减压浓缩，得到总浸膏或浓缩液；
2)将总浸膏混悬于水中，得到浸膏液，将浸膏液或浓缩液依次经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取若干次后分离出有机层，减压除去溶剂分别得到石油醚萃取层、乙酸乙酯萃取层和正丁醇萃取层；
3)将正丁醇萃取层上样于硅胶柱，以氯仿-甲醇系统作为洗脱液，按体积比(100:0)～(0:100)进行梯度洗脱，对流出液进行检测，将洗脱液体积比为5:1的流份合并，除去溶剂，得到第一次过柱部分；
4)将第一次过柱部分上样于反相硅胶层析柱，以甲醇-水系统作为洗脱液，按体积比(10:90)～(100:0)进行梯度洗脱，将洗脱液体积比为30:70的流份合并，除去溶剂，得到第二次过柱部分；
5)将第二次过柱部分上样于高效液相色谱分离柱，用流动相进行等度洗脱，得到二氢菲苷类化合物。
3.根据权利要求2所述的二氢菲苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤1)中，回流提取中采用甲醇、水或体积分数10％～95％的乙醇作为提取剂，流苏虾脊兰干燥根茎与提取剂的料液比为1kg：(1～5)L；回流提取次数为1～6次，每次1～3h。
4.根据权利要求3所述的二氢菲苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，当提取剂为甲醇或体积分数10％～95％的乙醇时，将得到的提取液中溶剂回收得到总浸膏；当提取剂为水时，将提取液的体积浓缩至1/10～1/6，得到浓缩液。
5.根据权利要求2所述的二氢菲苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤2)中，将总浸膏混悬于水中，总浸膏和水的体积比为1:1～1:4；
萃取时，依次经石油醚和乙酸乙酯萃取后，再经过正丁醇萃取；每次萃取均是等体积萃取；每种溶剂分别萃取1～6次。
6.根据权利要求2所述的二氢菲苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤3)中，梯度洗脱后每300～800mL收集一个流份；步骤4)中，梯度洗脱后每100～300mL收集一个流份。
7.根据权利要求2所述的二氢菲苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤5)中，流动相选择甲醇-水系统或乙腈-水系统，等度洗脱的流速为3～5mL/min。
8.根据权利要求7所述的二氢菲苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，甲醇-水系统中甲醇和水的体积比为35：65；乙腈-水系统中乙腈和水的体积比为40:60。
9.权利要求1所述的二氢菲苷类化合物在制备降血脂药物和/或保健食品中的应用。
10.权利要求1所述的二氢菲苷类化合物在制备胃黏膜保护药物和/或保健食品中的应用。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190823 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |