CN104910247B - 一种百两金皂苷b对照品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明以制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的含甲醇或乙醇或乙腈的水溶液为洗脱体系，目标峰洗脱液直接减压浓缩干燥即可获得纯度大于98％的百两金皂苷B化学对照品。其制备过程包括如下步骤：(1)百两金药材的提取；(2)大孔吸附树脂柱分离；(3)制备型高效液相色谱分离纯化，最终得到百两金皂苷B化学对照品；该对照品采用薄层色谱多个展开系统及显色方法检查均为一个色谱斑点，进一步采用高效液相色谱‑蒸发光散射检测法(HPLC‑ELSD)检查，其目标峰用峰面积归一化法计算，质量浓度大于98％；变换不同色谱柱及多个流动相系统，测定结果均一致。说明制备的百两金皂苷B符合中药定量分析用化学对照品的要求。本制备方法纯度高、色泽好、成品收率较高，可以规模化生产。

Description

一种百两金皂苷B对照品的制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及药品的质量控制方法，具体是指百两金皂苷B原料或其制剂的分析检测方法。

背景技术

百两金(Ardisia crispa(Thunb.)DC.A.)是紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛属(Ardisia Sw.)常绿灌木植物，以全株入药，具有清咽利喉、散淤消肿、舒筋活血、祛痰止咳和提脓生肌的功效，、我国民间多用于治疗咽喉痛、扁桃体炎、肾炎水肿、跌打损伤、风湿疼痛、白浊、骨结核、劳伤咳血、痈疔和毒蛇咬伤等。现代药理研究表明，本药材具有细胞毒活性和抗肿瘤作用，同时具有抗炎、抑菌、收缩子宫、抗氧化等活性作用。百两金皂苷B(ardisiacrispin B)是该药材主要活性成分之一，其化学结构式如下：

目前对百两金等同属植物的研究热点主要集中在化学成分、药理作用和临床应用等方面，也有人建立了百两金药材中岩白菜素和百两金皂苷A含量测定的方法(侯金玲等.HPLC-ESLD测定瑶药竹叶风中岩白菜素和百两金皂苷A含量的方法研究[J]广西医科大学学报2014，31(1)：50-54)，但由于缺乏对照品，一直未见百两金皂苷B的定量分析方法。

百两金皂苷B的化学名称为西克拉敏A 3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷，是存在于紫金牛科紫金牛属植物百两金、朱砂根、红毛走马胎等多种植物中的有效成分，在深入研究开发该活性成分的过程中，需要将其提取制备成含量大于90％的中药1类新药原料，并进而制备成制剂。这就需要首先分离得到百两金皂苷B单体，并按照对照品研究技术指导原则进行纯化及结构鉴定。本发明采用制备高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-ELSD)建立起百两金皂苷B化学对照品的制备方法，为进一步的深入研究和新药开发提供新的参考。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种百两金皂苷B化学对照品的制备方法。

本案发明人通过对百两金皂苷B化学成分进行文献查阅和实验研究，发明了百两金药材回流提取、大孔吸附树脂分离纯化，高效液相色谱制备百两金皂苷B的方法，经薄层色谱多个展开及显色系统分离均显示一个斑点，采用HPLC-ELSD峰面积归一化法计算，其质量浓度大于98％，符合中药定量分析用化学对照品纯度的质量要求，因而完成了本发明。

本发明的技术方案是以制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的含乙醇或乙腈水溶液为洗脱体系，获得纯度大于98％的百两金皂苷B化学对照品；具体步骤为：

1)取百两金药材，粉碎成颗粒，加60％～80％的乙醇回流提取，滤过，减压回收醇得提取液；

2)将提取液上大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用用浓度低于20％的乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩干燥得浸膏粉；

3)将2)的浸膏粉用制备液相的流动相溶解使成为过饱和溶液，离心，取上清液，用制备型高效液相色谱分离纯化；色谱条件：以反相化学键合相C₈或C₁₈为填充剂，甲醇-水或乙腈-水为流动相，在线紫外监测，波长为205nm～210nm，收集目标峰直接浓缩干燥，或用甲醇重结晶即可得到纯度大于98％的百两金皂苷B。

根据前述的制备方法，其中，所述的回流提取溶剂为60％～80％乙醇，加入量为10倍量药材，回流提取3次，每次1.5～2小时。

根据前述的制备方法，其中，所述的大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂。

根据前述的制备方法，其中，所述的百两金皂苷B洗脱液收集后，减压浓缩，温度控制在55～65℃；干燥采用低温干燥或低温冷冻干燥。

根据前述的制备方法，其中，所述的制备HPLC洗脱体系的乙醇与水体积比为62∶38～72∶28；乙腈与水的体积比为30∶70～40∶60。

根据前述的制备方法，其中，所述的HPLC的流动相中甲醇与水的体积比为62∶38～72∶28；乙腈与水的体积比为30∶70～40∶60，优选甲醇-水的体积比为60∶40，乙腈-水的体积比为35∶65，考虑安全性，优选甲醇-水系统为HPLC制备用流动相。

本发明制备的百两金皂苷B经高分辨质谱(HR-FAB-MS)给出精确分子量为1074，其碳、氢核磁共振信号根据gCOSY，HMQC，HMBC所显示的相关关系得到了归属，结构鉴定为西克拉敏A 3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

本发明制备的百两金皂苷B经高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果均为一个色谱峰，以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定，其质量分数均大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求。

而且本发明药材提取完全，所需有机溶剂少，溶剂无毒无污染。

附图说明

图1为百两金皂苷B的制备HPLC-UV色谱图

图2为百两金皂苷B的HPLC-ELSD纯度检测色谱图

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明，依据现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。

仪器、试药与样品

高效液相色谱仪(美国安捷伦1100系列)，包括在线真空脱气机(G1322A)，四元梯度泵(G1311A)，自动进样器(G1313A)，柱温箱(G1316A)，DAD检测器(G1314A)，Chemstation色谱工作站；Alltech ELSD 2000型蒸发光散射检测器；制备型高效液相色谱仪(美国贝克曼库尔特BECHMAN 125P型)，包含SYSTEM GOLD 125P Solvent Module和166p Detector等；Milli-Q超纯水器(美国Milipore公司)；Microfuge 18台式离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；KQ-500DE超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司，功率300W，频率40kHz)；BP-210D型电子分析天平(德国赛多利斯，十万分之一)；过滤装置(Autoscience)及微孔滤膜(0.45μm)。分析色谱柱：Waters Symmetry C₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；Phenomenex Gemini C₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；Alltech Altimma C₁₈(250mm×4.5mm，5μm)；制备色谱柱：BECHMAN ULTRAPREP C18(21.1mm×150mm，10μm)；保护拄：phenomnex C₁₈。

实施例1

1.对照品的制备

1)取百两金药材，粉碎成颗粒，加10倍量的60％乙醇回流提取2小时，重复提取3次，滤过，合并滤液并减压回收乙醇得百两金提取物；

2)将提取液上D141大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用用浓度低于20％的乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩干燥得百两金浸膏粉；

3)将2)的浸膏粉用制备液相的流动相溶解使成为过饱和溶液，离心，取上清液，用制备型高效液相色谱分离纯化；色谱条件：以反相化学键合相C₈或C₁₈为填充剂，甲醇-水或乙腈-水为流动相，在线紫外监测，波长为205nm，色谱图见图1，收集目标峰直接浓缩干燥，或用甲醇重结晶即可得到纯度大于98％的百两金皂苷B(产率1.64％)。

2.对照品的结构鉴定

上述百两金皂苷B为白色粉末，熔点：263-265℃。[α]²⁵ _D＝-23.5(MeOH，0.24)。

百两金皂苷B的高分辨质谱(HR-FAB-MS)给出精确分子量：m/z 1097.5432[M+Na]，对应分子式为：C₅₃H₈₆O₂₂Na(分子量计算值为：1097.5509)。

百两金皂苷B的¹³C-NMR谱给出53个碳信号，其中30个信号为苷元碳信号，23个信号为糖残基碳信号。30个苷元信号中有6个为角甲基碳信号(DEPT谱信号)：δ16.1(C，25-C)，16.2(C，24-C)，18.0(C，26-C)，19.3(C，27-C)，24.0(C，29-C)和27.7(C，23-C)；1个醛基碳信号：δ207.9(C，30-C)；1个环醚亚甲基碳信号：δ75.8(CH₂，28-C)。¹H-NMR谱也显示了6个角甲基氢信号：δ0.72(3H，s)，0.80(3H，s)，1.06(3H，s)，1.17(3H，s)，0.91(3H，s)和0.94(3H，s)；1个醛基氢信号：δ9.75(1H，s)。上述¹H，¹³C-NMR谱数据为该化合物苷元的特征信号；将百两金皂苷B的¹H-，¹³C-NMR谱数据与文献对照，并结合百两金皂苷B的个gCOSY，HMQC，HMBC，NOESY等二维核磁共振谱分析，最终确定其苷元为西克拉敏A(cyclamine A)；

百两金皂苷B的¹H-，¹³C-NMR谱还显示了4个糖残基的端基碳、氢信号：δ100.1(鼠李糖，C-1)，101.9(葡萄糖-1，C-1)，103.0(阿拉伯糖，C-1)，103.6(葡萄糖-2，C-1)和δ5.09(1H，br.s，鼠李糖，H-1)，4.44(1H，d，J＝8.4Hz，葡萄糖-1，H-1)，4.46(1H，d，J＝7.6Hz，阿拉伯糖，H-1)，4.38(1H，J＝7.6Hz，葡萄糖-2，H-1)说明该化合物中含有4个糖残基。百两金皂苷B酸水解后，与D-葡萄糖，L-阿拉伯糖及L-鼠李糖共薄层层析分析，在D-葡萄糖，L-阿拉伯糖和L-鼠李糖相应的位置显示了相应的斑点，说明该化合物中的糖残基种类为D-葡萄糖，L-阿拉伯糖和L-鼠李糖。结合糖残基的¹H-，¹³C-NMR谱数据，确定该化合物中D-葡萄糖，L-阿拉伯糖和L-鼠李糖的数量比为2∶1∶1。糖残基连接位置的确定是根据百两金皂苷B的HMBC谱所显示的相关关系：δ4.46(1H，d，J＝7.6Hz，阿拉伯糖，H-1)与δ87.9(苷元C-3)；4.44(1H，d，J＝8.4Hz，葡萄糖-1，H-1)与δ79.0(阿拉伯糖，C-2)；δ4.38(1H，J＝7.6Hz，葡萄糖-2，H-1)与δ74.0(阿拉伯糖，C-4)；δ5.09(1H，br.s，鼠李糖，H-1)与δ74.9(葡萄糖-2，C-2)。

百两金皂苷B的碳、氢核磁共振信号根据gCOSY，HMQC，HMBC所显示的相关关系得到了归属。百两金皂苷B的¹H，¹³C-NMR谱数据见附表所示。该化合物为西克拉敏A 3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷；英文名：cyclamiretin A 3-O-α-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-]-α-L-arabinopyranoside。其对照品结构鉴定的数据见附表。

3.高效液相色谱-蒸发光散射检测器纯度检测

制备的百两金皂苷B经薄层色谱多个展开及显色系统均显示一个斑点，故用HPLC-ELSD进行纯度检查如下：

溶液制备：精密称取百两金皂苷B适量，加50％乙醇制成0.5～5mg·mL^-1的溶液。

色谱条件A：色谱柱：Alltech Altimma C₁₈(250mm×4.5mm，5μm)；流动相：甲醇-水(65∶35)；柱温：30，；流速：0.8ml·min^-1；漂移管温度为95℃；气体流速为2.0L·min^-1。

色谱条件B：色谱柱：Phenomenex Gemini C₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；流动相：乙腈-水(35∶65)；柱温：30，；流速：0.8ml·min^-1；漂移管温度为95℃；气体流速为2.0L·min^-1。

色谱条件C：色谱柱：Waters Symmetry C₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；流动相：甲醇-水(65∶35)；柱温：30，；流速：0.8ml·min^-1；漂移管温度为95℃；气体流速为2.0L·min^-1。

方法与结果：精密吸取10～20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，百两金皂苷B为一个色谱峰，改变色谱柱和流动相测定，均未出现异常峰。

另取高浓度百两金皂苷B：精密注入液相色谱仪10μL，记录时间比主峰保留时间延长1倍以上。测定各杂质峰面积和色谱图总色谱峰，计算各杂质峰面积之和占总色谱峰面积的百分数。结果百两金皂苷B的质量分数为99.56％(见图2)。

实施例2

1百两金提取工艺对提取率的影响

1)提取方式对提取率的影响

取粉碎成颗粒的百两金药粉6份，每份50.00g，分为三组。分别加入10倍量的80％乙醇，浸泡30分钟后一份室温超声提取60min；一份回流提取60min；另一份再加入10倍量的80％乙醇渗漉提取。提取液分别200目筛过滤，滤液减压浓缩。水浴蒸干浓缩液。干膏置于70℃烘箱减压干燥8小时，测定百两金皂苷B含量，结果见表1。

表1提取方式比较

2)提取溶剂对百两金皂苷B提取率的影响

取粉碎成颗粒的百两金药粉5份，每份50.00g，分别加入10倍量的水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇，浸泡30分钟后回流提取2h。提取液分别200目筛过滤，滤液减压浓缩。水浴蒸干浓缩液。干膏置于70℃减压烘箱干燥8小时。测定百两金皂苷B含量，结果随着溶剂中乙醇浓度的增加，提取率逐渐增加至最大值(见表2)。

表2提取溶剂浓度比较

3)溶剂量对百两金皂苷B提取率的影响

取粉碎成颗粒的百两金药粉6份，每份50.00g，分为三组。分别加入10倍量、8倍量、6倍量的60％乙醇，浸泡30分钟后回流提取2小时。提取液分别200目筛过滤，滤液减压浓缩至50ml，离心(3000r/min)处理20分钟，上清液水浴蒸干，置于70℃烘箱减压干燥8小时，分别测定百两金皂苷B含量，结果10倍量最佳(见表3)。

表3提取溶剂用量比较

4)提取时间对百两金皂苷B提取率的影响

取粉碎成颗粒的百两金药粉6份，每份50.00g，分为三组。各加入10倍量的60％乙醇，浸泡30分钟后分别回流提取1、1.5、2小时。提取液200目筛过滤后分别滤液减压浓缩至50ml，离心(3000r/min)处理20分钟，上清液水浴蒸干，置于70℃烘箱减压干燥8小时，分别测定百两金皂苷B含量，结果随着提取时间延长，提取率增加(见表4)。

表4提取时间比较

2百两金皂苷B对照品的制备

1)取粉碎成颗粒的百两金药材，加10倍量的60％的乙醇回流提取2小时，重复提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液并减压回收乙醇得百两金提取物；

2)将提取液上D101大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用浓度低于20％的乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩干燥得百两金浸膏；

3)将2)得到的百两金皂苷B粗品用制备高效液相色谱分离纯化(见图1)。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水(60∶40)为流动相，检测波长205nm，收集目标峰并浓缩干燥得百两金皂苷B(产率1.64％)。

经HPLC-ELSD纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定，均未出现异常峰；用峰面积归一化法测定质量分数为99.21％。

附表

化合物BLJZG的¹H-NMR数据

附表

化合物BLJZG的¹³C-NMR数据

Claims (2)

1.一种百两金皂苷B化学对照品的分离制备方法，其特征在于：以制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的甲醇水溶液为洗脱体系，获得纯度大于98％的百两金皂苷B化学对照品；具体步骤为：

1)取百两金药材，粉碎成颗粒，加60％～80％的乙醇回流提取，过滤，减压回收醇得提取液；

2)将提取液上大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用浓度低于20％的乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩干燥得浸膏；

3)将2)的浸膏用制备液相的流动相溶解使成为过饱和溶液，离心，取上清液，用制备型高效液相色谱分离纯化；色谱条件：以反相化学键合相C₁₈为填充剂，甲醇水溶液为流动相，在线紫外监测，波长为205nm，收集目标峰直接浓缩干燥，即得到纯度大于98％的百两金皂苷B；

其中，所述的回流提取溶剂加入量为10倍药材量，回流提取3次，每次2小时；

其中，所述的大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂；

其中，所述的制备型高效液相色谱洗脱体系甲醇与水的体积比为62∶38～72∶28。

2.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于所述的百两金皂苷B洗脱液收集后，减压浓缩，温度控制在55～65℃；干燥采用低温冷冻干燥。