CN104163845B - 具有抗肿瘤活性的化合物、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了对人肝癌HepG2细胞有抑制作用的绞股蓝提取物式(I)和(II)化合物及其制备方法，属于植物化学领域。式(I)和(II)化合物的制备方法如下：将绞股蓝全草经125℃、0.24MPa处理后用乙醇回流提取，提取液减压浓缩得浸膏；浸膏加蒸馏水混悬后，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取；减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；萃取物过HP20树脂后，依次用20％、50％、70％的乙醇对其进行洗脱，70％乙醇洗脱液减压浓缩得洗脱物；洗脱物上硅胶柱色谱，用20：1～10：1(V/V)的二氯甲烷/甲醇洗脱，分段收集洗脱液得到6个组分，组分3用半制备色谱柱(250×10mm，5μm)，流速为3mL/min，53：47(V/V)的乙腈/水洗脱，即得。
Description
技术领域
本发明涉及一种酮类化合物，尤其涉及一种从植物绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)中提取得到的具有抗肿瘤活性的皂苷类化合物；本发明还涉及该皂苷类化合物的制备方法以及该化合物在医药中的应用，属于植物化学领域。
背景技术
绞股蓝为葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属(Gynostemma)绞股蓝Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino的全草，具有清热解毒，止咳祛痰功能。
绞股蓝中最主要的药效成分是皂苷类成分。研究表明，具有C20(21)和C20(22)双键的达木林B和达木林A与侧链C20位连有羟基的绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenosideLI相比，具有更强的抑制癌细胞增殖作用，而它们在绞股蓝中的含量甚微。对于这些有较强活性的稀有皂苷，它们的来源有限而且在植物体内含量较低。如果用传统方法进行分离，不但耗费大量的药用资源，而且得率也很低。因此，对化合物进行合理的成分转化和结构修饰已经成为现代药学研究的热点，可创造更大的经济效益、社会效益和生态效益。
发明内容
本发明人在对绞股蓝热处理产物的有效成分研究中分离得到具有结构式(I)和(II)的新化合物，在现有文献中从未报道，于是对其进一步进行了药理实验，发现对人肝癌HepG2细胞具有抑制作用，从而完成了本发明。
本发明目的之一是提供一种下述式(I)或(II)的化合物：
其中，R1、R2和R3彼此独立选自OH或糖基；
优选的：R1或R3为OH；R2为6″-乙酰糖基；
特别优选的，所述化合物的结构式为式(III)或(IV)所示：
本发明的另外一个目的是提供制备上述式(I)或(II)化合物的方法。
本发明的另外一个目的通过以下技术方案来实现的：
一种制备上述式(I)或(II)化合物的方法，包括：
(1)将植物绞股蓝的干燥全草的粗粉在高温高压下热处理后，用乙醇回流提取，提取液减压回收溶剂，得乙醇提取浸膏；
(2)乙醇提取浸膏加蒸馏水混悬后，用二氯甲烷萃取，再用乙酸乙酯萃取；回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物；
(3)将乙酸乙酯萃取物通过HP20树脂，用20％乙醇、50％乙醇洗脱后，用70％乙醇进行洗脱，70％乙醇洗脱液减压浓缩，得70％乙醇洗脱物；将70％乙醇洗脱物上硅胶柱色谱，用20∶1～10∶1体积比的二氯甲烷/甲醇洗脱，分段收集洗脱液得到6个组分，将其中第3个组分用半制备色谱柱(250×10mm，5μm)，流速为3mL/min，用53∶47体积比的乙腈/水洗脱，即得。
上述制备方法中，步骤(1)中优选将绞股蓝干燥全草的粗粉在125℃、0.24MPa条件下热处理3h，用90％乙醇回流提取3次，3次回流提取的时间依次为2h、2h和1h；合并提取液，提取液减压回收溶剂，得乙醇提取浸膏；
步骤(2)中优选将乙醇提取浸膏加10倍重量的蒸馏水混悬，用二氯甲烷萃取，再用乙酸乙酯萃取，回收溶剂后得乙酸乙酯萃取物。
本发明式(I)或(II)化合物具有较强的抑制癌细胞增殖活性，具体来说本发明式(I)或(II)化合物对人肝癌HepG2细胞具有明显的抑制作用，其半数抑制率浓度均小于100μg/mL。
附图说明
图1本发明化合物达木林C、达木林D的LC-MS图谱
具体实施方式
实施例1 本发明化合物的制备
绞股蓝全草的干燥粗粉在125℃、0.24MPa条件下热处理3h，用80％乙醇回流提取3次，时间分别为2h、2h和1h。提取液合并后减压回收溶剂，得80％乙醇提取浸膏。取80％乙醇提取浸膏加蒸馏水混悬后，用二氯甲烷萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次。回收溶剂后得乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物通过HP20树脂，用20％乙醇、50％乙醇洗脱后，用70％乙醇进行洗脱，70％乙醇洗脱液减压浓缩，得70％乙醇洗脱物；将70％乙醇洗脱物上硅胶柱色谱，用20∶1～10∶1体积比的二氯甲烷/甲醇洗脱，分段收集洗脱液得到6个组分，将其中第3个组分用半制备色谱柱(250×10mm，5μm)，流速为3mL/min，用53∶47体积比的乙腈/水洗脱，得到2种白色粉末体(命名为达木林D和达木林C)；对所得到的化合物(达木林D和达木林C)的结构鉴定波谱数据见下表1。
表1 分离化合物的1H和13C NMR数据
达木林D在1H-NMR谱的高场区给出8个甲基信号δ0.87(3H，s，H-29)，0.92(3H，s，H-30)，0.98(3H，s，H-19)，1.05(3H，s，H-18)，1.11(3H，s，H-28)，1.63(3H，s，H-27)，1.68(3H，s，H-26)和2.05(3H，s，CH3C＝O)；给出2个糖的端基质子信号δ4.43(1H，J＝7.8Hz，H-1′)，4.72(1H，J＝7.2Hz，H-1″)，根据两个糖的端基质子偶合常数值7.8Hz和7.2Hz，判断2个糖的构型均为β型；给出1个二取代烯氢质子信号δ4.88(1H，bs，H-21a)，4.69(1H，bs，H-21b)及一个三取代烯氢质子信号δ5.16(1H，m，H-24)。在13C-NMR谱中，给出了44个碳信号，其中20、25、24、21位的碳化学位移分别为δ156.1、132.2、125.7、108.5示有4个烯碳存在；结合糖的端基碳信号δ105.0(C-1″)，104.6(C-1′)及骨架碳信号δ96.4(C-3)、82.4(C-2′)、78.7(C-3′)和HMBC谱中H-3与C-1′的相关信号，推测该化合物是在C-3位上连有2个糖，而且第一个糖的C-2′位连有第二个糖。根据HMBC谱中δ172.8(C＝O)与δ4.32(1H，m，H-6″)，4.17(1H，m，H-6″)具有远程耦合关系，推测该化合物的乙酰基连在第二个糖的6″位。达木林D的1H-NMR谱和13C-NMR谱数据与达木林B很相似，除了1H-NMR谱中的δ2.05(3H，s，CH3C＝O)和13C-NMR谱中的δ172.8(C＝O)，20.9(CH 3C＝O)。与达木林B相比，由于乙酰基连在6″位，因此65.0(C-6″)向低场移动，而75.3(C-5″)向高场移动。说明达木林D是单乙酰化的达木林B。因此化合物达木林D鉴定为：2α，3β，12β-三羟基达玛烷-20(21)，24-二烯-3-O-[β-D-葡萄糖(1→2)-β-D-6″-O-乙酰基葡萄糖苷；[2α，3β，12β-trihydroxydammar-20(21)，24-diene-3-O-[β-D-glucopyranoxyl(1→2)-β-D-6″-O-acetylglucopyranoside]。
达木林C在1H-NMR谱的高场区给出9个甲基信号δ0.87(3H，s，H-29)，0.92(3H，s，H-30)，0.98(3H，s，H-19)，1.03(3H，s，H-18)，1.11(3H，s，H-28)，1.62(3H，s，H-27)，1.63(3H，s，H-21)，1.67(3H，s，H-26)和2.05(3H，s，CH3C＝O)；给出2个糖的端基质子信号δ4.44(1H，J＝7.8Hz，H-1′)，4.73(1H，J＝7.2Hz，H-1″)，根据两个糖的端基质子偶合常数值7.8Hz和7.2Hz，判断2个糖的构型均为β型；给出2个三取代烯氢质子信号δ5.08(1H，m，H-24)，5.26(1H，m，H-22)。在13C-NMR谱中，给出了44个碳信号，其中20、25、22、24位的碳化学位移分别为δ140.3，132.1，124.6，124.2示有4个烯碳存在；糖的端基碳信号δ105.0(C-1″)，104.7(C-1′)及骨架碳信号δ96.5(C-3)，82.4(C-2′)，78.7(C-3′)和HMBC谱中H-3与C-1′的相关信号，推测该化合物是在C-3位上连有2个糖，而且第一个糖的C-2′位连有第二个糖。根据HMBC谱中δ172.8(C＝O)与δ4.31(1H，m，H-6″)，4.16(1H，m，H-6″)具有远程耦合关系，推测该化合物的乙酰基连在第二个糖的6″位。达木林C的1H-NMR谱和13C-NMR谱数据与达木林A很相似，除了1H-NMR谱中的δ2.05(3H，s，CH3C＝O)和13C-NMR谱中的δ172.8(C＝O)，20.9(CH 3C＝O)。与达木林A相比，由于乙酰基连在6″位，因此65.0(C-6″)向低场移动，而75.3(C-5″)向高场移动。说明达木林C是单乙酰化的达木林A。因此化合物达木林C鉴定为：2α，3β，12β-三羟基达玛烷-20(22)，24-二烯-3-O-[β-D-葡萄糖(1→2)-β-D-6″-O-乙酰基葡萄糖苷；[2α，3β，12β-trihydroxydammar-20(22)，24-diene-3-O-[β-D-glucopyranoxyl(1→2)-β-D-6″-O-acetylglucopyranoside]。
试验例1 本发明化合物达木林D(damulin D)和达木林C(damulin C)的抗肿瘤的活性实验
1)实验材料
细胞：人肝癌细胞(HepG2 cell)。
2)实验方法
HepG2活性测定采用CCK-8法。
3)供试化合物：实施例1所制备的化合物(达木林C和达木林D)。
4)实验结果
表2 本发明化合物(达木林C和达木林D，damulin C and damulin D)的抗肿瘤活性测定结果
注：+表示有效；-表示无效。
实验结果表明：本发明式(I)和(II)化合物具有较强的抗肿瘤活性。
Claims (2)
1.一种制备如下式(III)和式(IV)化合物的方法，包括：
(1)将绞股蓝干燥全草的粗粉在125℃、0.24MPa的条件下高温高压处理3小时后，用80％乙醇回流提取3次，3次回流提取的时间依次为2h、2h和1h；合并提取液，提取液减压回收溶剂，得乙醇提取浸膏；
(2)乙醇提取浸膏加蒸馏水混悬后，用二氯甲烷萃取后，再用乙酸乙酯萃取；减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物；
(3)将乙酸乙酯萃取物通过HP20树脂，用20％乙醇、50％乙醇洗脱后，用70％乙醇进行洗脱，70％乙醇洗脱液减压浓缩，得70％乙醇洗脱物；
(4)将70％乙醇洗脱物上硅胶柱色谱，用20∶1～10∶1体积比的二氯甲烷/甲醇洗脱，分段收集洗脱液得到6个组分，将其中第3个组分用半制备色谱柱(250×10mm，5μm)，流速为3mL/min，用53∶47体积比的乙腈/水洗脱，即得。
2.按权利要求1的方法，其特征在于：步骤(2)中将乙醇提取浸膏加10倍重量的蒸馏水混悬，用二氯甲烷萃取，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部分回收溶剂后得乙酸乙酯萃取物。
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