CN102603849A - 一种绞股蓝次生皂苷及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种绞股蓝次生皂苷及其制备方法与应用，涉及一种绞股蓝。绞股蓝次生皂苷的化合物名称为2α，3β，12β，20(S)-四羟基-24-达玛烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷。制备绞股蓝皂苷；用微生物转化绞股蓝皂苷；制备绞股蓝次生皂苷。经化合物的抗癌活性测定，证明绞股蓝次生皂苷可用于制备抗癌活性剂。利用微生物转化法制备绞股蓝次生皂苷，以绞股蓝为原料，在我国种植面积广，廉价易得，资源丰富，是生物药物和保健品开发应用的良好材料；工艺流程较简单，采用大孔吸附树脂为主要制备填料，适合于工艺规模化放大；制备方法相对于化学酸碱裂解法，设备条件要求简单，制备的产物副作用小。

Description

一种绞股蓝次生皂苷及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种绞股蓝，尤其是涉及一种绞股蓝次生皂苷及其制备方法与应用。

背景技术

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Thnmb Mak.)为葫芦科绞股蓝属植物，绞股蓝主要药效成分为绞股蓝皂甙(gypenoside，GYP)，其具有抑制肿瘤、防止衰老、降低血脂、增强免疫、保护心脏和肝脏、降低血糖、镇静止痛及抗溃疡等药理作用。绞股蓝皂甙因具有与人参皂甙类似主骨架的达玛烷型结构，有“南方人参”和“第二人参”的美誉。

近年来，通过对皂苷生理活性的药效学和代谢动力学研究，人们注意到皂苷中的糖链与其生物活性之间有着密切的联系。许多研究证实，糖链在皂苷的生物活性方面起到重要的作用，皂苷糖分子越少，其活性越高。国内外学者对人参皂苷单体与抗肿瘤活性的构效关系研究表明，低糖链的皂苷及苷元具有较强的抗肿瘤作用，其规律如下：原人参二醇型＞原人参三醇型；苷元＞单糖苷＞二糖苷＞三糖苷＞四糖苷，因此目前国际很多学者都致力于开发制备次生皂苷产品。次生皂苷的制备方法有酸碱水解法和生物转化法，酸碱水解化学方法反应剧烈，副产物多，更多还是倾向于条件要求温和的生物转化法，尤其是微生物转化法。

皂苷微生物转化所用的微生物早期主要是肠道厌氧菌，而其他微生物的研究比较少。肠道厌氧菌发酵最初是以人排泄物中的总菌物进行发酵，后来研究筛选单一肠道菌来转化，如采用肠道乳酸菌转化人参二醇型皂苷制备CK，发现运用Bifidobacterium.minimum KK-1和B.choerinum KK-2共发酵转化Rb1时效果最好，但肠道菌多为厌氧菌，培养条件苛刻，培养基成本高。另有研究筛选原始土壤微生物来降解人参皂苷，但酶解能力低下，目的产物收率不高，须通过优化发酵条件和菌种诱变等方法来提高转化能力。

目前，皂苷微生物转化研究较多的是天然人参皂苷和三七皂苷为前提物的微生物转化制备次生皂苷，如中国专利CN101139562公开利用弗氏链霉菌菌株规模化发酵转化各种三七皂苷、制备Compound K提供一株性状稳定、营养要求简单、生长良好的链霉菌菌株，以及实用简便的全自动发酵罐发酵、分离提取工艺。中国专利CN101928671A公开利用一种链格孢属菌及其发酵人参茎叶总皂苷制备人参皂苷Rg3的方法，中国专利CN1793320A公开一株镰刀霉菌及其用于制备人参皂苷Rh2的方法。根据文献和专利检索，尚未见利用微生物转化法制备具有抗癌活性绞股蓝次生皂苷专利报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绞股蓝次生皂苷及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供绞股蓝次生皂苷在制备抗癌活性剂中的应用。

所述绞股蓝次生皂苷的化合物名称为2α，3β，12β，20(S)-四羟基-24-达玛烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构式为：

分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，分子量为800。

所述绞股蓝次生皂苷为绞股蓝皂苷与微生物共培养后的代谢产物。

所述绞股蓝次生皂苷的制备方法包括以下步骤：

1)制备绞股蓝皂苷：所述制备绞股蓝皂苷的具体方法为将绞股蓝粉末用乙醇溶液在水浴锅中提取，将提取液真空浓缩获得绞股蓝乙醇提取物，再用乙醇溶液溶解后，上样于大孔吸附树脂柱，先用乙醇溶液冲洗后，再用乙醇溶液洗脱绞股蓝皂苷，将洗脱液浓缩干燥，获得绞股蓝皂苷；

2)用微生物转化绞股蓝皂苷：所述用微生物转化绞股蓝皂苷的具体方法为将转化培养基装在250ml三角瓶中，装液量50ml，在121℃，灭菌20min；取活化后的微生物转入马铃薯液体培养基培养，培养至长出真菌孢子，按1％～5％接种量接入转化瓶中，在25～37℃，180～300r/min摇床上培养12～72h后，加入2％～20％绞股蓝皂苷底物进行转化，在25～37℃，180～300r/min摇床上培养继续培养1～5d后，收集转化菌液；

3)制备绞股蓝次生皂苷：微生物转化绞股蓝皂苷后，菌液过滤，取上清液，菌体再用水清洗，上清液上样于大孔吸附树脂，先用乙醇溶液冲洗后，用乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥，获得绞股蓝次生皂苷。

在步骤1)中，所述将绞股蓝粉末用乙醇溶液在水浴锅中提取中，所述乙醇溶液的用量按质量比可为绞股蓝粉末的10～30倍；所述水浴锅的温度可为60℃；所述提取可提取2～4次，每次提取时间可为24～72h；所述再用乙醇溶液溶解可用10％～30％乙醇溶液溶解；所述大孔吸附树脂柱可采用HP20大孔吸附树脂柱等；所述先用乙醇溶液冲洗可用10％～30％乙醇溶液冲洗3～5个床体积；所述再用乙醇溶液洗脱绞股蓝皂苷可用40％～80％乙醇溶液洗脱绞股蓝皂苷。

在步骤2)中，所述微生物可采用曲霉属真菌等，所述曲霉属真菌可选自黑曲霉、构巢曲霉、青霉、灰绿曲霉等中的一种；所述转化培养基的组成可为：葡萄糖5～50g/L，蛋白胨1～5g/L，酵母膏1～5g/L，磷酸氢二钾2～10g/L，氯化钙2～8g/L，吐温80(2～5)ml，七水硫酸镁1～5g/L，四水硫酸锰1～5g/L。

在步骤3)中，所述过滤可采用8层纱布过滤；所述清洗可清洗至少2次；所述大孔吸附树脂可采用预处理好的HP20大孔吸附树脂；所述先用乙醇溶液冲洗可用30％～50％乙醇溶液冲洗3～5个床体积；所述用乙醇溶液洗脱可用60％～100％乙醇溶液洗脱。

经化合物的抗癌活性测定，证明绞股蓝次生皂苷可用于制备抗癌活性剂。

本发明具有如下的突出优点和技术效果：

1)本发明利用微生物转化法制备绞股蓝次生皂苷，以绞股蓝为原料，在我国种植面积广，廉价易得，资源丰富，是生物药物和保健品开发应用的良好材料；

2)工艺流程较简单，采用大孔吸附树脂为主要制备填料，适合于工艺规模化放大；

3)制备方法相对于化学酸碱裂解法，设备条件要求简单，制备的产物副作用小。

附图说明

图1为化合物HPLC图谱。在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为吸光度(mAU)。

图2为化合物¹³C-NMR的结构鉴定图。在图2中，横坐标为化学位移(ppm)，纵坐标为峰强度。

图3为化合物HMBC的结构鉴定图。在图3中，横坐标为化学位移(ppm)，纵坐标为峰强度。

图4为化合物HSQC的结构鉴定图。在图4中，横坐标为化学位移(ppm)，纵坐标为峰强度。

图5为化合物DEPT的结构鉴定图。在图5中，横坐标为化学位移(ppm)，纵坐标为峰强度；曲线a为DEPT图谱，曲线b为氢图谱，曲线c为碳图谱。

图6为黑曲霉制备的次生皂苷对SMMC7721肝癌细胞的抑制作用。在图6中，横坐标为转化产物浓度(μg/ml)，纵坐标为细胞抑制率(％)。

图7为黑曲霉制备的次生皂苷对Bel7402肝癌细胞的抑制作用。在图7中，横坐标为转化产物浓度(μg/ml)，纵坐标为细胞抑制率(％)。

图8为构巢曲霉制备的次生皂苷对SMMC7721肝癌细胞的抑制作用。在图8中，横坐标为转化产物浓度(μg/ml)，纵坐标为细胞抑制率(％)。

图9为构巢曲霉制备的次生皂苷对Bel7402肝癌细胞的抑制作用。在图9中，横坐标为转化产物浓度(μg/ml)，纵坐标为细胞抑制率(％)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步的详细描述。

本发明利用生物转化法制备绞股蓝次生皂苷，主要包括绞股蓝皂苷的制备、微生物转化绞股蓝皂苷和绞股蓝次生皂苷的制备。以下提供黑曲霉和构巢曲霉制备绞股蓝次生皂苷的实施例，同时提供转化产物分离纯化，化合物结构鉴定，以及利用MTT法检测次生皂苷对肝癌细胞的抑制作用来进一步说明本发明，但并不表示本发明只限于该实施例。

本发明所选用的材料为福建南靖种植区的绞股蓝，为公开的生物材料。

主要利用的试剂为乙醇、三氯甲烷、甲醇等，均为分析纯试剂。

一、绞股蓝次生皂苷制备过程如下：

1、绞股蓝皂苷的制备：绞股蓝粉末用30倍量乙醇溶液在60℃水浴锅中提取3次，每次提取时间24h，混合提取液真空浓缩获得绞股蓝乙醇提取物，提取物用30％乙醇溶液溶解，上样于预处理好的HP20大孔吸附树脂柱，先用30％乙醇溶液冲洗3个床体积后，用70％乙醇溶液洗脱绞股蓝皂苷，洗脱液浓缩干燥获得绞股蓝皂苷。

2、微生物转化绞股蓝皂苷：以下为黑曲霉和构巢曲霉转化实施例；

利用黑曲霉转化绞股蓝皂苷：用接种环取活化后的黑曲霉，接入2环含有50ml马铃薯液体培养基的三角瓶中，培养至长出少量真菌孢子。转化培养基50ml装在250ml三角瓶中，在121℃，灭菌20min；按5％接种量接入转化瓶中，在25℃，230r/min摇床上培养48h后，加入5％绞股蓝皂苷底物进行转化，继续在25℃，230r/min摇床上培养培养6d后，收集转化菌液。菌液用8层纱布过滤取上清液，菌体再用100ml水清洗3次，上清液上样于预处理好的HP20大孔吸附树脂，先用30％乙醇溶液冲洗5个床体积后，用100％乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥获得黑曲霉转化绞股蓝皂苷的次生皂苷。

利用构巢曲霉转化绞股蓝皂苷：用接种环取活化后的构巢曲霉，接入2环含有50ml马铃薯液体培养基的三角瓶中，培养至长出少量真菌孢子。转化培养基50ml装在250ml三角瓶中，在121℃，灭菌20min；按2％接种量接入转化瓶中，在25℃，230r/min摇床上培养24h后，加入5％绞股蓝皂苷底物进行转化，继续在25℃，230r/min摇床上培养培养3d后，收集转化菌液。菌液用8层纱布过滤取上清液，菌体再用100ml水清洗3次，上清液上样于预处理好的HP20大孔吸附树脂，先用30％乙醇溶液冲洗5个床体积后，用100％乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥获得构巢曲霉转化绞股蓝皂苷的次生皂苷。

3、绞股蓝次生皂苷的制备：微生物转化绞股蓝皂苷后，菌液用8层纱布过滤取上清液，菌体再用100ml水清洗3次，上清液上样于预处理好的HP20大孔吸附树脂，先用30％乙醇溶液冲洗5个床体积后，用100％乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥获得绞股蓝皂苷的次生皂苷。

二、转化产物分离纯化和结构鉴定过程如下：

1、转化产物分离纯化

转化产物通过硅胶柱分离其中的化合物，常压柱层析采用干法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂系统，最后得到分离的化合物。具体步骤为：转化产物冻干粉末350mg干法拌样(100～200目)，硅胶柱(3×15cm)湿法装柱硅胶(200～300目)，用氯仿-甲醇-水(10∶1∶2)下层为洗脱液，等度洗脱，每份洗脱液为20ml，减压蒸馏浓缩，薄层板检测分离组份，收集获得化合物。

将得到的化合物做薄层层析，经紫外，碘和硫酸-乙醇显色为单一斑点，3种溶剂系统展开均为单一斑点，可初步认定为单一化合物。

2、化合物纯度鉴定

分离的化合物通过高效液相色谱(HPLC)鉴定其纯度，HPLC色谱条件为：色谱柱为AgilentEclipse XDB-C18(150×4.6mm)；柱温：25℃；检测波长：203nm；流速：1.0ml/min；进样量为20μl，流动相为：水(A)/乙腈(B)梯度洗脱，梯度洗脱条件为0～8min：A，80％，B，20％；8～20min：A，65％，B，35％；20～35min：A，30％，B，70％；35～40min：A，30％，B，70％；40～50min：B，100％；50～60min：B，100％；60～70min：A，80％，B，20％。HPLC图谱见图1，由图可知纯化的化合物呈单峰，纯度达98％。

3、化合物结构鉴定

对分离到得化合物做碳谱，氢谱以及二维核磁共振。化合物(2α，3β，12β，20(S)-四羟基-24-达玛烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷)为白色粉末，可溶剂氯仿，甲醇。由核磁共振数据(见图2～6)得出分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，分子量为800，查阅参考文献，然后综合分析得到的数据，并结合文献对照分析化合物的可能结构类型，最后确定化合物结构为：

化合物经过数据库查新为已有文献报道的化合物，但未发现有化合物抗癌活性应用。

三、抗癌活性测定

1、测定方法：肝癌细胞(SMMC7721和Bel7402)经胰酶消化与洗涤后悬浮于含10％胎牛血清的培养基中，经台盼兰染色排除法计数活细胞后，调节细胞悬浮液密度至5×10⁴个/ml。在平底96孔板中，每孔接种100μl肝癌细胞，使的每孔中细胞总数约为5000个，并于37℃、5％CO₂的Thermo细胞培养箱中培养过夜。次日，向每孔加入200μl不同浓度的测定样品作用于肿瘤细胞，以DMSO作为对照，每个浓度设4个重复孔；将加药细胞在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养72h后，吸去培养液，向每孔中加入100μl的1mg/ml MTT溶液，继续在培养箱中培养4～8h；吸去培养液，每孔加入200μl DMSO，置于摇床上以500rpm震荡20min，使生成的甲臢晶体充分溶解在DMSO，最后在492nm处测定光吸收值。

2、绞股蓝次生皂苷抗癌活性测定

根据光吸收值计算药物作用后的细胞相对抑制率。计算公式如下：细胞抑制率＝(OD_{对 照组}-OD_给药组)/OD_对照组×100％，并通过SPSS统计学软件计算抑制50％时药物的溶度IC₅₀值，测定的黑曲霉和构巢曲霉制备的次生皂苷对SMMC7721和Bel7402肝癌细胞的抑制曲线见图7～9，抗癌活性的半抑制率IC50值总结见表1。

表1绞股蓝次生皂苷抗癌活性

备注：HZ：黑曲霉制备的次生皂苷；GZ：构巢曲霉制备的次生皂苷

3、化合物的抗癌活性测定

根据上述测定方法，将不同浓度的化合物(0，6.25，12.5，25，50，100μg/ml)作用于SMCC7721肝癌细胞72h后，MTT法测定化合物对肝癌细胞抑制率，结果表明该化合物对肝癌细胞SMMC7721的半抑制率IC50为91.66μg/ml。

Claims (10)

1.一种绞股蓝次生皂苷，其特征在于其化合物名称为2α，3β，12β，20(S)-四羟基-24-达玛烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构式为：

分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，分子量为800。

2.如权利要求1所述的一种绞股蓝次生皂苷的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备绞股蓝皂苷：所述制备绞股蓝皂苷的具体方法为将绞股蓝粉末用乙醇溶液在水浴锅中提取，将提取液真空浓缩获得绞股蓝乙醇提取物，再用乙醇溶液溶解后，上样于大孔吸附树脂柱，先用乙醇溶液冲洗后，再用乙醇溶液洗脱绞股蓝皂苷，将洗脱液浓缩干燥，获得绞股蓝皂苷；

2)用微生物转化绞股蓝皂苷：所述用微生物转化绞股蓝皂苷的具体方法为将转化培养基装在250ml三角瓶中，装液量50ml，在121℃，灭菌20min；取活化后的微生物转入马铃薯液体培养基培养，培养至长出真菌孢子，按1％～5％接种量接入转化瓶中，在25～37℃，180～300r/min摇床上培养12～72h后，加入2％～20％绞股蓝皂苷底物进行转化，在25～37℃，180～300r/min摇床上培养继续培养1～5d后，收集转化菌液；

3)制备绞股蓝次生皂苷：微生物转化绞股蓝皂苷后，菌液过滤，取上清液，菌体再用水清洗，上清液上样于大孔吸附树脂，先用乙醇溶液冲洗后，用乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥，获得绞股蓝次生皂苷。

3.如权利要求2所述的一种绞股蓝次生皂苷的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述将绞股蓝粉末用乙醇溶液在水浴锅中提取时，所述乙醇溶液的用量按质量比为绞股蓝粉末的10～30倍。

4.如权利要求2所述的一种绞股蓝次生皂苷的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述水浴锅的温度为60℃；所述提取提取2～4次，每次提取时间为24～72h。

5.如权利要求2所述的一种绞股蓝次生皂苷的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述再用乙醇溶液溶解是用10％～30％乙醇溶液溶解；所述大孔吸附树脂柱可采用HP20大孔吸附树脂柱。

6.如权利要求2所述的一种绞股蓝次生皂苷的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述先用乙醇溶液冲洗是用10％～30％乙醇溶液冲洗3～5个床体积；所述再用乙醇溶液洗脱绞股蓝皂苷可用40％～80％乙醇溶液洗脱绞股蓝皂苷。

7.如权利要求2所述的一种绞股蓝次生皂苷的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述微生物采用曲霉属真菌，所述曲霉属真菌可选自黑曲霉、构巢曲霉、青霉、灰绿曲霉中的一种。

8.如权利要求2所述的一种绞股蓝次生皂苷的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述转化培养基的组成为：葡萄糖5～50g/L，蛋白胨1～5g/L，酵母膏1～5g/L，磷酸氢二钾2～10g/L，氯化钙2～8g/L，吐温80(2～5)ml，七水硫酸镁1～5g/L，四水硫酸锰1～5g/L。

9.如权利要求2所述的一种绞股蓝次生皂苷的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述过滤是采用8层纱布过滤；所述清洗是清洗至少2次；所述大孔吸附树脂可采用预处理好的HP20大孔吸附树脂；所述先用乙醇溶液冲洗可用30％～50％乙醇溶液冲洗3～5个床体积；所述用乙醇溶液洗脱可用60％～100％乙醇溶液洗脱。

10.如权利要求1所述的一种绞股蓝次生皂苷在制备抗癌活性剂中的应用。

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