CN103276037B - 一种从赭色小莫勒菌中提取白僵菌交酯ⅰ的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从赭色小莫勒菌中提取白僵菌交酯Ⅰ的方法，包括：1)活化菌株；2)初级培养；3)次级培养；4)减压抽滤得到菌丝体，菌丝体恒温干燥；5)研磨，过筛；6)多次进行200~300目硅胶柱层析，得到的流分无水硫酸钠干燥。过滤浓缩后所得黄色产物，用氯仿-甲醇(V∶V＝1∶1)重结晶，得到白色固体，经HR、EI-MS、NMR、HMBC、NOESY、HSQC谱图分析证明白僵菌交酯Ⅰ首次在该菌种代谢物中提取到。

Description

一种从赭色小莫勒菌中提取白僵菌交酯Ⅰ的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从赭色小莫勒菌中提取白僵菌交酯Ⅰ的方法。
背景技术
赭色小莫勒菌(Moelleriellaochracea)是虫生真菌的重要成员，由于它能引起粉虱和介壳类昆虫群体性流行病的发生，这使得它有可能成为有用的生物防治剂。随着研究的深入，近年来人们发现莫勒菌的代谢产物具有抗菌、抗肿瘤和抗疟原虫等生物活性，这预示该菌在生物农药或医药上存在很大应用价值。
由于人们在现代社会患癌症的概率较大，因此，寻找不同来源的抗癌药物已经越来越得到人们的关注。虫生真菌的代谢产物中含有多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇等多种具有杀虫、抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性物质，因此，充分开发利用虫生真菌，将有利于人类医疗水平的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从赭色小莫勒菌中提取白僵菌交酯Ⅰ的方法，以促进其药理学的研究和作为先导化合物的开发和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
从赭色小莫勒菌中提取白僵菌交酯Ⅰ的方法包括以下步骤：
1）将赭色小莫勒菌（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009.28(1): 148-150）活化后，取菌块接种PDB培养基中，在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、25℃条件下连续培养28天即次级培养。
2）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在40℃下恒温干燥后研磨成粉状，过筛，用乙酸乙酯浸泡，超声，重复3次。合并浸泡液，旋蒸得菌丝体浸膏。
3）将菌丝体浸膏上200~300目硅胶柱，进行粗分。先用石油醚洗脱，之后换石油醚：二氯甲烷体积比=5:1洗脱，收集该部位洗脱液，旋蒸浓缩。
4）将步骤3）中得到的浓缩物继续上200~300目硅胶柱，以石油醚：丙酮体积比=20:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=10:1部位洗脱液，旋蒸浓缩。
5）将步骤4）中得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱，先以石油醚洗脱，之后换石油醚：丙酮体积比=8:1梯度洗脱，最后以乙酸乙酯：丙酮体积比=5:1梯度洗脱，收集乙酸乙酯：丙酮体积比=1:1部位洗脱液，旋蒸浓缩，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后所得黄色产物，用氯仿-甲醇(V∶V＝1∶1)重结晶，得到白色固体，经HREIMS、NMR、HMBC谱图分析证明为白僵菌交酯Ⅰ。
所述PDB培养基的制备为：马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min，6层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。高压灭菌121℃，20min。
所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5×0.5cm，接种量为4块。
所述步骤2）中要用3倍体积乙酸乙酯浸泡24小时，超声1小时。
所述步骤5）中重结晶具体操作为：无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后所得黄色产物，用氯仿溶解，待晶体析出后，再用甲醇洗去杂质，析出弃掉，剩余的晶体再用甲醇氯仿体积比（1：1）溶解后重结晶，直至获得单一的白僵菌交酯Ⅰ。
本发明的显著优点在于：本发明以繁殖快、周期短的真菌为材料，成本低，操作简单，重复性好，无需昂贵的仪器，通过多次进行硅胶柱层析，提取到白僵菌交酯Ⅰ。
附图说明
图1是化合物的TLC。
图2是化合物的的1H NMR谱。
图3是化合物的13C NMR谱。
图4是化合物的EI-MS谱。
图5是化合物的13C NMR谱(下)和DEPT 135谱(上)。
图6是化合物的HSQC谱。
图7是化合物的HMBC谱。
图8是化合物的NOESY谱。
图9是化合物的结构。
具体实施方式
实施例1：
白僵菌交酯Ⅰ的制备
1）将赭色小莫勒菌（本实验室野外采集，分离纯化并保存菌株）活化后，以0.5×0.5cm（4块）接种于 PDB培养基（马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min，6层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，高压灭菌121℃，20min。）中，在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、25℃条件下连续培养28天即次级培养；
2）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在40℃下恒温干燥后研磨成粉状，过筛，用3倍乙酸乙酯浸泡，超声，重复3次。合并浸泡液，旋蒸得菌丝体浸膏。 
3）将菌丝体浸膏上200~300目硅胶柱，进行粗分。先用石油醚洗脱，之后换石油醚:二氯甲烷体积比=5:1洗脱，收集该部位洗脱液，旋蒸浓缩。
4）将3）中得到的浓缩物继续上200~300目硅胶柱，以石油醚：丙酮体积比=20:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=10:1部位洗脱液，旋蒸浓缩。
5）将4）中得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱，先以石油醚洗脱，之后换石油醚：丙酮体积比=8:1梯度洗脱，最后以乙酸乙酯：丙酮甲烷体积比=5:1梯度洗脱，收集乙酸乙酯：丙酮体积比=1:1部位洗脱液，旋蒸浓缩，无水硫酸钠干燥.过滤浓缩后所得黄色产物，用氯仿-甲醇(V∶V＝1∶1)重结晶，得到白色固体，经HREI-MS、NMR、HMBC谱图分析证明为白僵菌交酯Ⅰ。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种从赭色小莫勒菌中提取白僵菌交酯Ⅰ的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将赭色小莫勒菌活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、25℃条件下连续培养28天即次级培养；
2）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在40℃下恒温干燥后研磨成粉状，过筛，用乙酸乙酯浸泡，超声，重复3次，合并浸泡液，旋蒸得菌丝体浸膏；
3）将菌丝体浸膏上200~300目硅胶柱，进行粗分，先用石油醚洗脱，之后换石油醚：二氯甲烷体积比=5:1洗脱，收集该部位洗脱液，旋蒸浓缩；
4）将步骤3）中得到的浓缩物继续上200~300目硅胶柱，以石油醚：丙酮体积比=20:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=10:1部位洗脱液，旋蒸浓缩；
5）将步骤4）中得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱，先以石油醚洗脱，之后换石油醚：丙酮体积比=8：1梯度洗脱，最后以乙酸乙酯：丙酮体积比=5:1梯度洗脱，收集乙酸乙酯：丙酮体积比=1:1部位洗脱液，旋蒸浓缩，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后所得黄色产物，用氯仿：甲醇体积比＝1∶1重结晶，得到白色固体。
2.根据权利要求1所述的从赭色小莫勒菌中提取白僵菌交酯Ⅰ的方法，其特征在于：所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5×0.5cm，接种量为4块。
3.根据权利要求1所述的从赭色小莫勒菌中提取白僵菌交酯Ⅰ的方法，其特征在于：所述步骤2）中要用3倍体积乙酸乙酯浸泡24小时，超声1小时。
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