CN101830997B - 一种东北铁线莲三萜皂苷对照品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种东北铁线莲三萜皂苷对照品的制备方法，包括如下步骤：(1)东北铁线莲的药材提取；(2)大孔吸附树脂柱色谱分离；(3)制备高效液相色谱分离得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品。高效液相色谱-蒸发光检测器纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法和不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求。而且本发明方法药材提取完全，产率高；有机溶剂用量少，成本低。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种东北铁线莲三萜皂苷对照品的制备方法。
背景技术
毛茛科植物东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的根及根茎，具有祛风湿，通经络，止痛之功能，用于治风湿性关节炎，神经痛，四肢麻木，肢体疼痛，跌打损伤，鱼刺鲠喉，又用于黄疸性肝炎[严仲铠，李万林.中国长白山药用植物彩色图志[M].北京：人民卫生出版社，1997：170-171.]。东北铁线莲收载于《中华人民共和国药典》2010年版威灵仙项下，含量测定项下采用齐墩果酸和常春藤皂苷元为对照品，高效液相色谱法测定含量以控制药材质量。3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(结构式见下)是东北铁线莲中主要三萜皂苷类化学成分，以其原型三萜皂苷评价东北铁线莲药材质量更为合理。但是目前无法从国内外市场购得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品。
2006年中国学者史社坡从东北铁线莲的根及根茎中分离鉴定出3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷[Shi S P，Jiang D，Dong C X，et al.Triterpene saponin fromClematis manshurica[J].J Nat Prod，2006，69：1591-1595.]，采用的方法为东北铁线莲的根及根茎乙醇回流提取，提取液浓缩后分别用乙酸乙酯和正丁醇振摇提取，正丁醇提取物经大孔吸附柱色谱、硅胶柱色谱、ODS柱色谱和高效液相柱色谱，最后得到此种皂苷单体。3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷是以齐墩果酸为苷元的九糖苷，极性大，正丁醇振摇提取提取率低；硅胶柱色谱有机溶剂消耗量大，回收率低，成本高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种东北铁线莲三萜皂苷3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品的制备方法。
本案发明人通过对东北铁线莲三萜皂苷类化学成分进行细致深入的研究，发明了东北铁线莲的根及根茎回流提取，提取物经大孔吸附柱色谱和高效液相柱色谱制备3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，经纯度检测大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求，因而完成了本发明。
本发明提供一种东北铁线莲三萜皂苷3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品的制备方法，该方法包括以下步骤：
a)东北铁线莲的根及根茎粗粉加50～90％乙醇回流提取，滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
b)将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
c)将步骤b)获得的东北铁线莲三萜皂苷提取物经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相：甲醇-水(65∶35，体积比)，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
所述的东北铁线莲的根及根茎粗粉回流提取溶剂优选的浓度为50％～90％乙醇，最佳浓度为70％乙醇。
所述的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂或弱极性大孔吸附树脂。
本发明制备的东北铁线莲三萜皂苷经ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC鉴定为3-O-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖基-(1→4)-β-D-核糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→2)-α-L-阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷；经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法和不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数均大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求。而且本发明方法药材提取完全，产率高；有机溶剂用量少，成本低。
附图说明
图1为本发明制备的三萜皂苷3-O-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖基-(1→4)-β-D-核糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→2)-α-L-阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱条件A纯度检查图
图2为本发明制备的三萜皂苷3-O-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖基-(1→4)-β-D-核糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→2)-α-L-阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱条件B纯度检查图
图3为本发明制备的三萜皂苷3-O-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖基-(1→4)-β-D-核糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→2)-α-L-阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱条件C纯度检查图
图4为本发明制备的三萜皂苷3-O-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖基-(1→4)-β-D-核糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→2)-α-L-阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱峰面积归一化法纯度检查图
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。
具体实施方式
实施例1
(1)东北铁线莲的药材提取：取东北铁线莲根及根茎粗粉500g，加50％乙醇回流提取2次，每次2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
(2)大孔吸附树脂柱色谱分离：提取物加水溶解，经大孔吸附树脂D101柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
(3)制备高效液相色谱分离：东北铁线莲三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相：甲醇-水(65∶35，体积比)，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(产率1.12％)。
化合物结构鉴定：
白色粉末，Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应呈阳性，1H-NMR谱和13C-NMR谱显示三萜皂苷类化合物特征，推测化合物为三萜皂苷类化合物。
ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 1807[M+H]+，结合13C-NMR谱和HSQC谱数据推测分子式为C82H134O43。1H-NMR谱显示7个角甲基质子信号δ0.88(3H，s)，0.91(3H，s)，0.91(3H，s)，1.07(3H，s)，1.14(3H，s)，1.25(3H，s)和1.29(3H，s)，与氧相连的次甲基质子信号δ3.29(1H，dd，J＝11.4，4.0Hz)，烯氢质子信号δ5.41(1H，brt)。13C-NMR谱显示82个碳信号，其中30个为三萜皂苷元的碳信号。羰基碳信号δ176.59，烯碳信号δ122.92和144.20，与氧相连的碳信号δ88.84，为齐墩果酸型五环三萜皂苷苷元的特征信号。以上数据与苷元齐墩果酸文献[郭启雷，杨峻山.掌叶覆盆子的化学成分研究.中国中药杂志，2005，30(3)：198-200.]比较，3位碳信号向低场位移10.7ppm，28位碳信号向高场位移3.3ppm，推测化合物为3位和28位均连糖的双糖链齐墩果酸型皂苷。
1H-NMR谱显示9个糖端基质子信号δ4.86(1H，d，J＝6.0Hz)，4.96(1H，d，J＝7.6Hz)，5.00(1H，d，J＝8.0Hz)，5.10(1H，d，J＝7.8Hz)，5.43(1H，d，J＝0.8Hz)，5.85(1H，br s)，5.85(1H，br s)，6.23(1H，d，J＝8.3Hz)和6.24(1H，br s)，3个鼠李糖特征甲基质子信号δ1.54(1H，d，J＝6.0Hz)，1.59(1H，d，J＝6.0Hz)和1.70(1H，d，J＝6.2Hz)；13C-NMR谱显示9个糖端基碳信号δ95.71，101.53，102.80，102.80，103.21，104.69，104.88，104.98和105.23，3个鼠李糖特征碳信号δ18.51，18.56和18.66。化合物经酸水解后HPLC法鉴定结构中存在D-葡萄糖，D-核糖，L-阿拉伯糖和L-鼠李糖。1H-NMR谱显示葡萄糖端基质子偶合常数分别为J＝7.6Hz，J＝7.8Hz，J＝8.0Hz和J＝8.3Hz，推测葡萄糖均为β构型；13C-NMR谱显示鼠李糖5位碳信号分别为δ69.92，69.92和70.37，推测鼠李糖均为α构型，阿拉伯糖端基质子偶合常数J＝6.0Hz，推测阿拉伯糖为α构型；13C-NMR谱显示核糖端基碳信号为δ104.69，推测核糖为β构型。
HMBC谱显示阿拉伯糖端基质子δ4.86与苷元3位碳δ88.84，鼠李糖端基质子δ6.24与阿拉伯糖2位碳δ75.59，核糖端基质子δ5.85与鼠李糖3位碳δ82.03，葡萄糖端基质子δ4.96与核糖4位碳δ76.59，葡萄糖′端基质子δ5.10与葡萄糖4位碳δ81.94，鼠李糖′端基质子δ5.42与葡萄糖′6位碳δ68.64远程相关信号，推测结构中存在3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基；葡萄糖″端基质子δ6.23与苷元28位碳δ176.59，葡萄糖″′端基质子δ5.00与葡萄糖″6位碳δ69.30，鼠李糖″端基质子δ5.85与葡萄糖″′4位碳δ78.42远程相关信号，推测结构中存在28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖基。综合分析数据并和文献[Mimaki Y，Yokosuka A，Hamanaka M，et al.Triterpene saponins from the roots ofClematis chinensis[J].J Nat Prod，2004，67：1511-1516.]对照，鉴定化合物结构为3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化合物结构鉴定数据：
1H-NMR(C6D5N，500MHz)δ6.24(1H，br s，H-Rha-1)，6.23(1H，d，J＝8.3Hz，H-Glu″-1)，5.85(2H，br s，H-Rib-1，Rha″)，5.43(1H，d，J＝0.8Hz，H-Rha′-1)，5.41(1H，br t，H-12)，5.10(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glu′-1)，5.00(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glu″′-1)，4.96(1H，d，J＝7.6Hz，H-Glu-1)，4.86(1H，d，J＝6.0Hz，H-Ara-1)，3.29(1H，dd，J＝11.4，4.0Hz，H-3)，1.70(1H，d，J＝6.2Hz，H-Rha″-6)，1.59(1H，d，J＝6.0Hz，H-Rha′-6)，1.54(1H，d，J＝6.0Hz，H-Rha)，1.29(3H，s，H-23)，1.25(3H，s，H-27)，1.14(3H，s，H-24)，1.07(3H，s，H-26)，0.91(6H，s，H-29，30)，0.88(3H，s，H-25)。13C-NMR(C6D5N，125MHz)δ176.59(C-28)，144.20(C-13)，122.92(C-12)，105.23(C-Ara-1)，104.98(C-Glc′-1)，104.88(C-Glc″′-1)，104.69(C-Rib-1)，103.21(C-Glc-1)，102.80(C-Rha′-1，Rha″-1)，101.53(C-Rha-1)，95.71(C-Glc″-1)，88.84(C-3)，82.03(C-Rha-3)，81.94(C-Glc-4)，78.78(C-Glc″-3)，78.42(C-Glc″′-4)，78.25(C-Glc′-3)，78.10(C-Glc″-5)，77.20(C-Glc″′-5)，76.82(C-Glc′-5)，76.67(C-Glc-5)，76.59(C-Glc″′-3)，76.59(C-Rib-4)，76.42(C-Glc-3)，75.59(C-Ara-2)，75.39(C-Glc″′-2)，74.89(C-Glc′-2)，74.59(C-Ara-3)，74.19(C-Glc-2)，74.12(C-Rha′-4)，74.04(C-Rha″-4)，73.93(C-Glc″-2)，72.82(C-Rha′-3)，72.67(C-Rha″-3)，72.60(C-Rha″-2)，72.53(C-Rib-2)，71.97(C-Rha-2，Glc′-4)，71.81(C-Rha′-2)，70.95(C-Glc″-4)，70.37(C-Rha″-5)，69.92(C-Rib-3，Rha-5，Rha′-5)，69.92(C-)，69.30(C-Ara-4，Glc″-6)，68.64(C-Glc′-6)，65.58(C-Ara-5)，61.96(C-Glc-6)，61.78(C-Rib-5)，61.39(C-Glc″′-6)，56.12(C-5)，48.16(C-9)，47.12(C-17)，46.33(C-19)，42.21(C-14)，41.74(C-18)，39.97(C-8)，39.65(C-4)，39.05(C-1)，37.12(C-10)，34.09(C-21)，33.20(C-7，29)，32.60(C-22)，30.82(C-20)，28.34(C-15)，28.26(C-23)，26.72(C-2)，26.14(C-27)，23.87(C-11)，23.77(C-30)，23.46(C-16)，18.66(C-Rha′-6)，18.56(C-6，Rha″-6)，18.51(C-Rha-6)，17.55(C-26)，17.18(C-24)，15.73(C-25)。ESI-MS m/z 926[(M-23)/2]。
高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检测：
溶液的制备
精密称取3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷适量，加60％甲醇制成1.442mg·mL-1的溶液。
色谱条件
色谱条件A 色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：甲醇-水(60∶40)；流速：1.0mL·min-1；ELSD条件：漂移管温度：95℃，载气流速：2.8L·min-1。
色谱条件B色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：甲醇-水(60∶40)；流速：1.0mL·min-1；ELSD条件：漂移管温度：95℃，载气流速：2.8L·min-1。
色谱条件C色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-水(28∶72)；流速：1.0mL·min-1；ELSD条件：漂移管温度：110℃，载气流速：3.2L·min-1。
方法与结果
精密吸取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰，色谱峰保留时间分别为：31.938min、34.814min和19.051min，色谱图见附图1～附图3。
HPLC-ELSD峰面积归一化法纯度检测：
溶液的制备
精密称取3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷适量，加60％甲醇制成5.768mg·mL-1的溶液。
色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：甲醇-水(60∶40)；流速：1.0mL·min-1；ELSD条件：漂移管温度：95℃，载气流速：2.8L·min-1。
方法与结果
精密吸取溶液20μL，注入液相色谱仪，记录时间比主色谱峰保留时间延长1倍的色谱图。测定各杂质峰面积和色谱图总色谱峰面积，计算各杂质峰面积之和占总色谱峰面积的百分数。结果表明，3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量分数为99.134％，色谱图见图4。
HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法纯度检测
溶液的制备
精密称取3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷适量，加60％甲醇制成5.768mg·mL-1的溶液。
自身对照溶液的制备
精密吸取上述溶液0.5mL，分别置5mL量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀。
色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：甲醇-水(60∶40)；流速：1.0mL·min-1；ELSD条件：漂移管温度：95℃，载气流速：2.8L·min-1。
方法与结果
精密吸取自身对照溶液20μL，注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主色谱峰的峰高达满量程的10％以上，精密吸取溶液和自身对照溶液20μL，注入液相色谱仪，记录时间比主色谱峰保留时间延长1倍的色谱图。测定溶液各杂质峰面积和自身对照溶液主色谱峰面积，各杂质峰面积之和与主色谱峰面积比较计算杂质含量。结果表明，3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量分数为98.826％。
实施例2
(1)东北铁线莲的药材提取：取东北铁线莲根及根茎粗粉500g，加70％乙醇回流提取2次，每次2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
(2)大孔吸附树脂柱色谱分离：提取物加水溶解，经大孔吸附树脂D101柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
(3)制备高效液相色谱分离：东北铁线莲三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相：甲醇-水(65∶35，体积比)，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(产率1.28％)。
经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定质量分数为99.691％；以HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数为99.414％。
实施例3
(1)东北铁线莲的药材提取：取东北铁线莲根及根茎粗粉500g，加90％乙醇回流提取2次，每次2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
(2)大孔吸附树脂柱色谱分离：提取物加水溶解，经大孔吸附树脂D101柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
(3)制备高效液相色谱分离：东北铁线莲三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相：甲醇-水(65∶35，体积比)，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(产率1.06％)。
经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定质量分数为98.945％；以HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数为98.373％。
实施例4
(1)东北铁线莲的药材提取：取东北铁线莲根及根茎粗粉500g，加50％乙醇回流提取2次，每次2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
(2)大孔吸附树脂柱色谱分离：提取物加水溶解，经大孔吸附树脂AB-8柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
(3)制备高效液相色谱分离：东北铁线莲三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相：甲醇-水(65∶35，体积比)，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(产率0.99％)。
经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定质量分数为99.372％；以HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数为98.459％。
实施例5
(1)东北铁线莲的药材提取：取东北铁线莲根及根茎粗粉500g，加70％乙醇回流提取2次，每次2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
(2)大孔吸附树脂柱色谱分离：提取物加水溶解，经大孔吸附树脂AB-8柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
(3)制备高效液相色谱分离：东北铁线莲三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相：甲醇-水(65∶35，体积比)，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(产率1.09％)。
经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定质量分数为99.475％；以HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数为99.026％。
实施例6
(1)东北铁线莲的药材提取：取东北铁线莲根及根茎粗粉500g，加90％乙醇回流提取2次，每次2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
(2)大孔吸附树脂柱色谱分离：提取物加水溶解，经大孔吸附树脂AB-8柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
(3)制备高效液相色谱分离：东北铁线莲三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相：甲醇-水(65∶35，体积比)，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(产率1.02％)。
经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定质量分数为98.836％；以HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数为98.552％。
实施例7
(1)东北铁线莲的药材提取：取东北铁线莲根及根茎粗粉500g，加50％乙醇回流提取2次，每次2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
(2)大孔吸附树脂柱色谱分离：提取物加水溶解，经大孔吸附树脂HPD100柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
(3)制备高效液相色谱分离：东北铁线莲三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相：甲醇-水(65∶35，体积比)，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(产率1.13％)。
经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定质量分数为98.453％；以HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数为98.316％。
实施例8
(1)东北铁线莲的药材提取：取东北铁线莲根及根茎粗粉500g，加70％乙醇回流提取2次，每次2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
(2)大孔吸附树脂柱色谱分离：提取物加水溶解，经大孔吸附树脂HPD100柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
(3)制备高效液相色谱分离：东北铁线莲三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相：甲醇-水(65∶35，体积比)，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(产率1.21％)。
经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定质量分数为98.884％；以HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数为98.457％。
实施例9
(1)东北铁线莲的药材提取：取东北铁线莲根及根茎粗粉500g，加90％乙醇回流提取2次，每次2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
(2)大孔吸附树脂柱色谱分离：提取物加水溶解，经大孔吸附树脂HPD100柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
(3)制备高效液相色谱分离：东北铁线莲三萜皂苷提取物加甲醇溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相：甲醇-水(65∶35，体积比)，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(产率1.09％)。
经高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰；以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定质量分数为98.549％；以HPLC-ELSD不加校正因子的主成分自身对照法测定质量分数为98.112％。
Claims (3)
1.一种东北铁线莲三萜皂苷3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃 葡萄糖苷对照品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a)东北铁线莲的根及根茎粗粉加50～90％乙醇回流提取，滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物；
b)将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得东北铁线莲三萜皂苷提取物；
c)将步骤b)获得的东北铁线莲三萜皂苷提取物经制备高效液相色谱，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相为65％体积甲醇和35％体积水，同步采用示差折光检测器监视流出曲线以指导产品收集，收集液经浓缩干燥后得3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的一种东北铁线莲三萜皂苷3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品的制备方法，其特征在于所述的回流提取溶剂浓度为70％乙醇。
3.根据权利要求1所述的一种东北铁线莲三萜皂苷3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂或弱极性大孔吸附树脂。
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| Yoshihiro Mimaki et al.Triterpene saponins and lignans from the roots of pulsatilla chinensis and their cytotoxic activity against HL-60 cells.《Journal of natural products》.1999,第62卷(第9期), * |
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Granted publication date: 20121212 Termination date: 20160507 |