CN111892639B - 过山蕨中新的环阿尔廷型皂苷类化合物、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及四个新的环阿尔廷型皂苷类化合物的结构、制备方法和在抗肿瘤领域的应用。本发明从铁角蕨科植物过山蕨(Asplenium ruprechtii Sa.Kurata)的地上部分提取、分离和纯化,得到了四个新化合物1‑4。体外抗肿瘤实验表明,新化合物1和2对白血病细胞(HL60)和人肝癌细胞(HepG2)均具有细胞毒活性,提示该化合物可能具有一定的抗肿瘤作用。
Description
所属技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及皂苷类化合物及其制备,具体涉及四个新型环阿尔廷型三萜皂苷类化合物、制备方法及其应用。
背景技术
过山蕨(Asplenium ruprechtii Sa.Kurata)又名过桥草、马蹬草、还阳草。根据分子证据现已归并到铁角蕨属。主产于我国东北、华北、西北、内蒙古山东及江苏北部等地。过山蕨具有活血化瘀,止血,解毒等功效,临床上用于治疗血栓闭塞性脉管炎、子宫出血及神经皮炎等,河南地区用于治疗肝癌及肝硬化等。过山蕨化学成分的现代研究表明其中含有大量的环阿尔廷型三萜皂苷类化合物,如(24R)-3β,7β,24,25,30-五羟基环阿尔廷-24-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、(24R)-3β,7β,24,25,30-五羟基环阿尔廷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-24-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、(24R)-3β,7β,24,25,30-五羟基环阿尔廷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-24-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、(24R)-3β,7β,24,25,30-五羟基环阿尔廷24-O-β-D-吡喃葡萄糖基-30-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等。
环阿尔廷型皂苷类化合物是中药升麻和黄芪的主要成分。近年来的研究表明其有多方面的药理活性。文献报道紫云英属植物Astragalus oleifolius具有止汗、利尿的作用,并对肾炎、糖尿病、白血病、子宫癌有疗效,其主要成分中包括环阿尔廷三萜;紫云英属植物Astragalus spinous在埃及的民间用来治疗高血压、白血病和子宫癌,Astragalusverrucosus的醇提物分别具有免疫增强作用和免疫调节作用,其主要成分中均包括环阿尔廷三萜。但前期从采自东北地区的过山蕨全草70%乙醇提取物中分离得到的环阿尔廷型皂苷的现代药理研究表明对人宫颈癌细胞(Hela)和人黑色素瘤细胞(A375-S2)两种细胞系,在4种浓度下均无细胞毒活性。
随着各种新技术的整合运用、功能开发和方法的建立,使得从天然药物复杂体系中发现具有新颖结构及显著生物活性与功能的微量成分变为可能,继续分离新的环阿尔廷型三萜皂苷,并充分研究这类天然产物的药理活性,实现这类成分在新药研发中的应用也是本领域技术人员正在努力的方向。本发明涉及的四个新型环阿尔廷型皂苷类化合物,不但尚无人从过山蕨中得到,也无人通过分离纯化从其他植物分离得到或通过化学合成的方法制备得到;更无人报道这些化合物或其衍生物的应用。
发明内容
本发明的目的是提供了四个新的环阿尔廷型三萜皂苷、制备方法及其应用。
本发明提供了四个新的环阿尔廷型三萜皂苷,具有如下结构:
本发明还提供了所述新型环阿尔廷型三萜皂苷类化合物的制备方法,该方法包括如下步骤:
(1)过山蕨的地上部分用体积为30%~95%的乙醇提取,减压浓缩回收溶剂得粗提物;
(2)上述步骤(1)所得粗提物经水分散后,醋酸乙酯萃取,得到醋酸乙酯和水相两部位成分;
(3)上述步骤(2)所得水相部位经大孔吸附树脂色谱分离,以不同体积比例的乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱,得到不同极性部位的乙醇或甲醇洗脱物;
(4)上述步骤(3)所得乙醇或甲醇洗脱物经硅胶柱色谱法分离,以乙酸乙酯/乙醇,二氯甲烷/甲醇混合溶剂梯度洗脱,获得不同流分;
(5)上述步骤(4)所得流分经凝胶柱色谱法分离,以甲醇,二氯甲烷/甲醇混合溶剂等度洗脱;
(6)上述步骤(5)所得流分经反相中压柱层析分离,以不同体积比例的乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱,得到若干洗脱部位,经薄层色谱进行检测,显色,合并部分洗脱部位,减压浓缩,得浓缩物备用;
(7)上述步骤(6)中所得浓缩物经高效液相色谱法纯化,以甲醇-水混合溶剂为流动相,得到化合物1-4。
本发明提供的所述新型环阿尔廷型三萜皂苷类化合物1-4的制备方法,所述植物为铁角蕨科植物过山蕨(Asplenium ruprechtii Sa.Kurata)的地上部位。
本发明提供的所述新型环阿尔廷型三萜皂苷类化合物1-4的制备方法,步骤(1)中所述的提取方法为加热回流或超声提取1~3次。所用溶剂为:30%~95%乙醇,优选,所用溶剂是体积为30%~95%乙醇,所述过山蕨的质量与溶剂的体积的比例为1:5~1:20。
本发明所提供的所述新型环阿尔廷型三萜皂苷类化合物1-4的制备方法,步骤(2)中所述的萃取1~5次,所述醋酸乙酯相提取物与溶剂的体积的比例为1:3~1:10,优选比例为1:3~1:5。
本发明所提供的所述新型环阿尔廷型三萜皂苷类化合物1-4的制备方法,步骤(3)中所述大孔吸附树脂色谱,优选AB-8和MCI大孔吸附树脂;乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂,混合溶剂的体积比例为0:100~95:0,优选水、15%、30%、50%、70%和95%的甲醇-水或乙醇-水的混合溶剂。
本发明所提供的所述新型环阿尔廷型三萜皂苷类化合物1-4的制备方法,步骤(4)中所述乙酸乙酯/甲醇混合溶剂的体积比例为100:0~0:100,优选比例为80:1~10:1,二氯甲烷/甲醇体积比例为100:0~0:100,优选10:1~4:1。
本发明所提供的所述新型环阿尔廷型三萜皂苷类化合物1-4的制备方法,步骤(5)中所述二氯甲烷/甲醇体积比例为1:1~1:5,优选1:1~1:2。
本发明所提供的所述新型环阿尔廷型三萜皂苷类化合物1-4的制备方法,步骤(6)中所述乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂,混合溶剂的体积比例为0:100~100:0,优选5:95~100:0。
本发明所提供的所述新型环阿尔廷型三萜皂苷类化合物1-4的制备方法,步骤(7)中所述流动甲醇/水混合溶剂的体积比例为15:85~90:10,优选50:50~90:10。
本发明对新化合物1-4体外抗肿瘤活性进行了初步测试和评价,所选细胞系为白血病细胞(HL60)和人肝癌细胞(HepG2)。
因此,本发明中制备的新化合物1-4可在开发抗肿瘤药物方面应用。
本发明首次提供了以过山蕨全草为原料,富集、制备、鉴定新化合物1-4的方法,并且评价抗肿瘤活性,阐述了其在开发抗肿瘤药物中的应用。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明,但并不因此限制本发明。
实施例1:
(1)过山蕨干燥全草17.4kg,用95%乙醇加热回流提取3次(用量为11L),减压回收提取液的粗提物;
(2)步骤(1)所得95%乙醇粗提物水分散经醋酸乙酯萃取3次(用量为3L),减压回收萃取液得醋酸乙酯相和水相粗提物;
(3)步骤(2)所得水相提取物经大孔树脂吸附,用水、30%、50%和95%乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱;
(4)步骤(3)中所得的30%乙醇洗脱物,经MCI大孔树脂吸附色谱进行分离,用水、15%、30%、70%和95%乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱;
(5)步骤(4)中所得的70%乙醇洗脱物或(3)中所得的50%乙醇洗脱物,经硅胶柱色谱进行分离,经乙酸乙酯/95%乙醇100:0,100:1,100:2,100:5,100:8,100:10,4:1,2:1,1:1混合溶剂梯度洗脱;
(6)步骤(5)所得物再经反相中压柱层析分离,其中填料粒度为20~40μm,用甲醇-水(5/95~100/0,v/v)梯度洗脱(流速为3.0ml/min,温度为室温),得到6个部位(即梯度洗脱得10个瓶,每瓶100mL),经薄层色谱进行检测,显色,合并4~7个部位,60℃以下减压浓缩至干,备用;
(7)步骤(6)甲醇/水80:20流分,经硅胶柱色谱进行分离,经乙酸乙酯/95%乙醇15:1,混合溶剂进行梯度洗脱;
(8)将步骤(7)所得流分进行高效液相分离,示差检测,流速为1mL/min,流动相为甲醇:水=72:28,得到化合物1-4。
化合物1:白色胶状物;[α]D 20+25.94(c 0.53,MeOH);(+)-HRESIMS m/z 1163.5803[M+Na]+(calcd for C54H92O25Na,1163.5820).1HNMR和13C NMR数据见表1、表2。
化合物2:白色胶状物;[α]D 20+38.83(c 0.21,MeOH);(+)-ESIMS m/z 996.7[M+NH4]+;(+)-HRESIMS m/z 979.5465[M+H]+(calcd for C48H81O20,979.5472).1H NMR和13CNMR数据见表1、表2。
化合物3:白色无定型粉末;[α]D 20+12.23(c 0.28,MeOH);(+)-HRESIMS m/z979.5508[M+H]+(calcd for C48H83O20,979.5472).1HNMR和13C NMR数据见表1、表2。
化合物4:白色胶状物;[α]D 20+16.36(c 0.11,MeOH);(+)-HRESIMS m/z 979.5594[M+H]+(calcd for C48H83O20,979.5472).1HNMR和13C NMR数据见表1、表2。
表1化合物1–4的1H NMR数据a
a 1H NMR data(δ)was measured at 600MHz in pyridine-d5.Proton couplingconstants(J)in Hz are given in parentheses.The assignmentswerebasedonDEPT,1H-1H COSY,gHMQC andHMBC experiments;
表2化合物1–4的13C NMR数据a
a 13C NMR data(δ)was measured at 150MHz in pyridine-d5.The assignmentswere based on DEPT,1H-1H COSY,gHMQC and HMBC experiments.
实施例2:
(1)过山蕨干燥全草34.8kg,用70%乙醇加热回流提取3次(用量为11L),减压回收提取液的粗提物;
(2)步骤(1)所得70%乙醇粗提物水分散经醋酸乙酯萃取3次(用量为3L),减压回收萃取液得醋酸乙酯相和水相粗提物;
(3)步骤(2)所得水相提取物经大孔树脂吸附,用水、20%、40%和95%乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱;
(4)步骤(3)中所得的20%乙醇洗脱物,经MCI大孔树脂吸附色谱进行分离,用水、10%、25%、55%和90%乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱;
(5)步骤(4)中所得的55%乙醇洗脱物,经硅胶柱色谱进行分离,经硅胶柱色谱进行分离,经乙酸乙酯/甲醇100:0,100:1,100:2,100:5,100:8,100:10,4:1,2:1,1:1混合溶剂梯度洗脱;
(6)步骤(5)所得物再经反相中压柱层析分离,其中填料粒度为20~40μm,用甲醇-水(5/95~100/0,v/v)梯度洗脱(流速为3.0ml/min,温度为室温),得到6个部位(即梯度洗脱得10个瓶,每瓶100mL),经薄层色谱进行检测,显色,合并4~7个部位,60℃以下减压浓缩至干,备用;
(7)步骤(6)甲醇/水80:20流分,经硅胶柱色谱进行分离,经乙酸乙酯/乙醇15:1,混合溶剂进行梯度洗脱;
(8)将步骤(7)所得流分进行高效液相分离,蒸发光检测,流速为1mL/min,流动相为甲醇:水=65:35,得到化合物1-4。
实施例3:化合物1-4体外抗肿瘤实验测试
1、取对数生长期的白血病HL-60细胞,人肝细胞癌HepG2细胞。
2、HL60细胞以1.0×105mL-1接种于96孔培养板中,每孔100μL;HepG2细胞以3.0×104mL-1接种于96孔培养板中,每孔100μL;
3、置于37℃、5%CO2培养箱中,贴壁细胞HepG2培养12h,悬浮细胞HL60培养1h后,加入含有不同浓度的化合物的培养基100uL,每一样品设4-5个浓度级别,每一化合物设3个复孔,每板设3个复孔的空白对照
4、培养24h后取板备测。将备测孔依次加入CCK8溶液20μL,入孵箱继续培养2h,在BIORAD 550型酶标仪上测定450nm处的光密度值。按下列公式计算肿瘤细胞生成抑制率,再以药物浓度对肿瘤细胞生成抑制率作图得到计量曲线,从曲线上读取药物的半数抑制浓度(IC50)值。
肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验孔测定值/对照孔测定值)×100%
表3化合物1-4体外抗肿瘤活性实验结果
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围。
Claims (11)
2.如权利要求1所述环阿尔廷型皂苷衍生物的制备方法,其特征在于:
(1) 过山蕨的地上部分用体积为30%~95%的乙醇提取,减压浓缩回收溶剂得粗提物;
(2) 上述步骤(1)所得粗提物经水分散后,醋酸乙酯萃取,得到醋酸乙酯和水相两部位成分;
(3) 上述步骤(2)所得水相部位经大孔吸附树脂色谱分离,以不同体积比例的乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱,得到不同极性部位的乙醇或甲醇洗脱物;
(4) 上述步骤(3)所得乙醇或甲醇洗脱物经硅胶柱色谱法分离,以乙酸乙酯/乙醇,二氯甲烷/甲醇混合溶剂梯度洗脱,获得不同流分;
(5) 上述步骤(4)所得流分经凝胶柱色谱法分离,以甲醇,二氯甲烷/甲醇混合溶剂等度洗脱;
(6) 上述步骤(5)所得流分经反相中压柱层析分离,以不同体积比例的乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱,得到若干洗脱部位,经薄层色谱进行检测,显色,合并部分洗脱部位,减压浓缩,得浓缩物备用;
(7) 上述步骤(6)中所得浓缩物经高效液相色谱法纯化,以甲醇-水混合溶剂为流动相,得到化合物1-2。
3.按照权利要求2所述的环阿尔廷型皂苷类化合物的制备方法,其特征在于:所述植物来源为铁角蕨科植物过山蕨(Asplenium ruprechtii Sa. Kurata)的地上部位。
4.按照权利要求2所述的环阿尔廷型皂苷类化合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中的提取方法为加热回流或超声提取1~3次,所用溶剂为:30%~95%乙醇,所述过山蕨的质量与溶剂的体积的比例为1:5~1:20。
5.按照权利要求2所述的环阿尔廷型皂苷类化合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中的萃取1~5次,所述步骤(2)中由步骤(1)所得粗提物经水分散后的体积与醋酸乙酯的体积的比例为1:3~1:10。
6.按照权利要求2所述的环阿尔廷型皂苷类化合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中大孔吸附树脂色谱,选自AB-8和MCI大孔吸附树脂;乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂,混合溶剂的体积比例为0:100~95:0。
7.按照权利要求2所述的环阿尔廷型皂苷类化合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)中乙酸乙酯/甲醇混合溶剂的体积比例为100:0~0:100,二氯甲烷/甲醇体积比例为100:0~0:100。
8.按照权利要求2所述的环阿尔廷型皂苷类化合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(5)中二氯甲烷/甲醇体积比例为1:1~1:5。
9.按照权利要求2所述的环阿尔廷型皂苷类化合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(6)中乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂,混合溶剂的体积比例为0:100~100:0。
10.按照权利要求2所述的环阿尔廷型皂苷类化合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(7)中流动相甲醇/水混合溶剂的体积比例为15:85~90:10。
11.权利要求1所述环阿尔廷型皂苷类化合物1-2在制备抗肿瘤药物中的应用。
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