CN103755774B - 短葶山麦冬偏诺型甾体皂苷类化合物的分离鉴定及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从短葶山麦冬地下部位分离出的五个偏诺型甾体皂苷类化合物，由短葶山麦冬地下部位经粗提、大孔树脂吸附、反复萃取、硅胶柱层析、Sephadex LH‑20柱层析、高效液相色谱仪分离所得，并采用1D和2D‑NMR技术鉴定其结构，活性实验证明5个化合物具有抗肿瘤作用。

Description

短葶山麦冬偏诺型甾体皂苷类化合物的分离鉴定及用途

技术领域

本发明涉及从短葶山麦冬地下部位中提取分离的一组五个偏诺型甾体皂苷类化合物、制备方法及在抗肿瘤方面的用途。

背景技术

短葶山麦冬为百合科(Lilaceae)山麦冬属(Liriope)植物短葶山麦冬Liriopemuscari(Decne)Baily的干燥块根，是《中国药典》一部“山麦冬”项下收载的常用中药。具有养阴润肺，益胃生津的功效，可用于肺燥干咳，阴虚痨嗽，喉痹咽痛，津伤口渴，内热消渴，心烦失眠，肠燥便秘”，广泛用于心血管系统、呼吸系统疾病及糖尿病等疾病的治疗。药理实验表明，短葶山麦冬药材可以显著延长小鼠存活时间、极显著增加小鼠的脾脏重量、显著增强小鼠的碳粒廓清作用。前期研究表明，短葶山麦冬中主要含甾体皂苷类、萜类、酰胺生物碱类、脂肪酸类等化合物，其中甾体皂苷是其主要生物活性成分。药理作用表明，短葶山麦冬药材中分离所得的甾体皂苷类化合物DT-13为其主要活性成分，其能抑制肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等肿瘤的生长和转移，并发现其通过与蛋白NMMHC IIA结合，调节肿瘤转移过程中的多种关键分子，进而抑制肿瘤。长期以来，在市场上，尤其是在福建省泉州市、惠安、仙游等地作为麦冬Ophiopogon japonicus的替代品使用。国内外学者对该植物化学成分研究报道甚少，仅有的文献大部分集中在我们研究小组对其成分的研究上[(1)余伯阳，徐国钧，平井康昭，等.湖北麦冬与短葶山麦冬的化学成分研究(II)[J].中国药科大学学报，1988，19：296.(2)程志红，吴弢，余伯阳，等.短葶山麦冬化学成分的研究[J].中草药，2005，36(6)：823-826.(3)Tian，Y.Q.；Kou，J.P.；Li，L.Z.；Yu，B.Y.Anti-inflammatory effects ofaqueous extract from Radix Liriope muscari and its major active fraction andcomponent.Chin.J.Nat.Med.2011，9，222-226.(4)Yu，B.Y.；Hirai.Y.；Shoji.J.；Xu，G.J.Comparative studies on the constituents of ophiopogonis tuber and itscongeners.VI.Studies on the constituents of the subterranean part of Liriopespicata var.prolifera and L.muscari，Chem.Pharm.Bull.1990，38，1931-1935.(5)Yu，B.Y.；Qiu S.X；Zaw，KY.；Xu.G.J.；Hirai Yusuaki；Shoji Junzo，et al.Steroidalglycosides from the subterranean parts of Liriope spicatavar.prolifera.Phytochemistry 1996，43，201-206.(6)Cheng，Z.H.；Wu，T.；Annie BlighSW，Bashall Alan.；Yu，B.Y.；cis-eudesmanesesquiterpene glycosides from Liriopemuscari and Ophiopogonjaponicus.J.Nat.Prod.2004，67，1761-3.(7)Cheng，Z.H.；Wu，T.；Yu，B.Y.Studies on Chemical constituents of Liriope muscari(in Chinese)，Zhong.Cao.Yao.2005，36，823-826.(8)Cheng，Z.H.；Wu，T.；Yu，B.Y.Two new steroidalglycosides from Liriope muscari.Chin.Chem.Lett.2006，17，31-34.(9)Jiang，T.；Qin，L.P.Research on the chemical constituents and pharmacological activities ofLiriope Lour，J.Chin.Intergr.Med.2007，5，465-469.(10)Jiang，Z.Ch.；Hua，h.；Li，Liu.L.；Qin，M.J.A new eudesmane sesquiterpene glycosides from Liriopemuscari.Asia.N.P.R.2012，14，491-495.(11)Li，W.J.；Cheng，X.L.；Liu，J.；Lin，R.Ch.；Wang，G.Li.Phenolic Compounds and Antioxidant Activities of Liriope muscari，Molecules.2012，17，1797-1808.(12)Xu，Q.；Wang，R.；Yu，B.Y.Effects of ruscogeninfucopyranoside on the delayed type hypersensitivity and inflammatoryreactions，J.Chin.Pharm.Univ.1993，24，98-101.(13)Yu，B.Y.；Yin，X.；Rong，Z.Y.；Yang，T.M.；Zhang，C.H.；Xu，G.J.Biological activities of ruscogenin 1-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)][β-D-xylopyranosyl(1→3)]-β-D-fucopyranoside fromtuberous roots of Liriope muscari(Decne.)Baily，J.Chin.Pharm.Univ.1994，25，286-288.(14)Wu，F.H.；Cao，J.S.；Jiang，J.Y.；Yu，B.Y.；Xu，Q.Ruscogenin glycoside(Lm-3)isolated from Liriope muscari improves liver injury by dysfunctioning liver-infiltrating lymphocytes，J.Pharm.Pharmacol.2000，53，681-688.(15)Liu，J.L.；Chen，T.；Yu，B.Y.；Xu，Q.Ruscogenin glycoside(Lm-3)isolated from Liriope muscariinhibits lymphocyte adhesion to extracellular matrix，J.Pharm.Pharmacol.2002，54，959-966.(16)Tao，J.；Wang，H.Y.；Zhou，H.；Li，S.N.The saponin monomer of dwarflilyturf tuber，Lm-3，reduces L-type calcium currents during hypoxia in adultrat ventricular myocytes，Life.Sci.2005，77，3021-3030.(17)Tao，J.；Wang，H.Y.；Chen，J.D.；Xu，H.E.；Li，S.N.Effects of saponin monomer 13of dwarf lilyturf tuberon L-type calcium currents in adult rat ventricular myocytes，Am.J.Chin.Med.2005，33，797-806.(18)Sun，L.；Lin，S.S.；Zhao，R.P.；Yu，B.Y.；Yuan，S.T.；Zhang，L.Y.The saponin monomer of dwarf lilyturf tuber，DT-13，reduceshuman breast cancer cell adhesion and migration during hypoxia via regulationof tissue factor，Biol.Pharm.Bull.2010，33，1192-1198.(19)Sun，L.；Lin，S.S.；Yu，B.Y.；Yuan，S.T.；Zhang，L.Y.High-throughput screening modelfor tissue factorinhibitor and effect of DT-13on anti-tumor metastasis，Chin.J.Nat.Med.2010，8，466-470.(20)Ma，S.T.；Kou，J.P.；Yu，B.Y.Safety evaluation of steroidal saponinDT-13isolated from the tuber of Liriope muscari(Decne.)Baily，Food.Chem.Toxicol.2011，doi：10.1016/j.fct.2011.06.022.]

发明内容

1、本发明的目的是提供从短葶山麦冬地下部位中分离出的5个偏诺型甾体皂苷类化合物，由短葶山麦冬地下部位经粗提、大孔树脂吸附、反复萃取、硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析、高效液相色谱仪分离，活性研究证明该组化合物具有抗肿瘤作用。本发明提供的一组化合物是从短葶山麦冬地下部位中经粗提、大孔树脂吸附、反复萃取、硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、高效液相色谱仪分离所得的5个含有偏诺型甾体皂苷元母核类化合物，其母核结构如下：

化合物化学名称分别为：化合物1、25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-[α-L-吡喃木糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基，化合物2、25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[2，4-O-二乙酰基-β-D-吡喃鼠李糖基-(1→3)]-β-D-吡喃木糖基，化合物3、25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-4-O-乙酰基-α-D-葡萄糖基，化合物4、25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[3，4-O-二乙酰基-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃岩藻糖基，化合物5、25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[4-O-乙酰基-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃岩藻糖基。经过波谱解析和化学的方法确定了化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5的结构，分别为：

2、上述五个化合物包含如下步骤制备所得：

(1)称取粉碎的短葶山麦冬地下部位，加入一定体积的乙醇，搅匀，回流提取，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，备用。

(2)将药液直接进行预处理过的大孔树脂吸附，并用水，乙醇洗脱除杂和洗脱，收集合并洗脱液，减压回收乙醇，备用。

(3)将(2)中所得药液依次用乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，将萃取液分别浓缩至浸膏，分别获得乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

(4)将正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱进行检测，显色，合并相同部分，浓缩至干，备用。

(5)将硅胶柱层析I2至I8部分分别用凝胶Sephadex LH-20进行柱层析，用氯仿-甲醇进行洗脱除杂，分别收集所得洗脱液，减压回收浓缩至干得II2至II8，备用。

(6)将II7部分以RP-18为填料，用高效液相色谱仪进行纯化，得化合物1；将II5部分以RP-18为填料，用高效液相色谱仪进行纯化，得化合物2，3；将II8部分以RP-18为填料，用高效液相色谱仪进行纯化，得化合物4，5。

3、上述化合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(1)中，提取用的乙醇为6-10倍体积的50％-70％的乙醇，回流提取为2次，每次1小时。

4、上述化合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(2)中，所用大孔树脂为D101型，除杂乙醇浓度为20％-30％，所得合并液为50％-70％洗脱部分。

5、上述化合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(3)中，其所用的乙酸乙酯和药液比例为1∶1、正丁醇与药液比例为1∶1。

6、上述化合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(4)中，其所用的氯仿-甲醇体积比为10∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8的洗脱溶剂进行梯度洗脱，并分别收集各洗脱部分。

7、上述化合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(5)中，其所用的氯仿-甲醇梯度洗脱体积比为1∶1的混合溶剂，并分别收集各洗脱部分。

8、上述化合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(6)中，其II7以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为60％，水的浓度为40％；以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为65％，水的浓度为35％；再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为70％，水的浓度为30％，得纯度为98％以上的化合物1。II5以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为70％，水的浓度为30％；以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为75％，水的浓度为25％；再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为80％，水的浓度为20％，得纯度为98％以上的化合物2，3。II8以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为50％，水的浓度为50％；以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为55％，水的浓度为45％；再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为60％，水的浓度为40％，得纯度为98％以上的化合物4，5。

活性证明上述5个化合物具有良好的抗肿瘤作用。

该组化合物中的一种或两种以上的混合物在制备抗肿瘤药物方面的用途。

本发明的五个化合物的结构测定与推导：

化合物1：白色粉末，mp 276～278℃，[α]²⁴ _D-87.7(c 0.11，MeOH)，能溶于甲醇、乙醇，吡啶等，不溶于氯仿，水等，Liebermann-Burchard反应阳性(墨绿色)，提示该化合物为一甾体皂苷类化合物。IR除了在3400(羟基)，2950，1454、1376(-C＝C-)和1051(-C-O-)cm^-1处的吸收峰外，表现出特征的25R异螺甾烷型的特征吸收峰(978、918、892，863，892＞918cm^-1)。UPLC-IT-TOF结果表明该化合物的分子量为840，结合¹H、¹³C NMR推断化合物分子式为C₄₃H₆₈O₁₆。

¹H-NMR上给出甾体皂苷特征的两个甲基单峰δ0.94(3H，s，H-18)，δ1.06(3H，s，H-19)和δ1.21(3H，d，J＝4.0Hz，H-21)，0.67(3H，d，J＝4.0Hz，H-27)处的一个角甲基双峰，同时在δ5.28(1H，brs，H-6)出现一环内烯氢信号。在¹³C NMR上，其特征的双键烯碳δ140.61，123.82(见表.1-2)，尤其是典型的C-16，17位由于羟基取代而产生的重叠的低场位移至89.84(C-16)，89.94(C-17)的碳信号以及在甾体皂苷中比较少见的高场甲基信号9.42(C-21)，可以初步判断该化合物的苷元为偏诺皂苷元。

将该化合物进行2M HCl(二恶烷-H₂O，1∶1)水解，HP薄层色谱上可检出鼠李糖、木糖，同时在其氯仿层中可检出偏诺皂苷元。并且UPLC-IT-TOF给出其分子离子峰839.5844[M-H]^-的二级碎片峰708.8270[(M-H)-132]^-、575.3688[(M-H)-132-132]^-、431.3200[(M-H)-132-132-146]^-，表明其中一个木糖处于糖链的的末端位置，另一个木糖则次之，而鼠李糖直接连于苷元母核C-3位上。

在TOCSY谱中，从3个单糖的端基氢信号出发，可以分别找到各糖各自旋偶合系统，3个单糖的偶合系统如下：

1. 6.41-6.27-5.73-5.76-5.46-6.06-5.90(rha)

2. 6.88-5.74-5.59-5.93-5.76-5.17(xyl)

3. 6.71-5.62-5.42-5.32-5.77-5.18(xyl)

完成了单糖的自旋偶合系统归属后，从糖的端基氢信号出发，利用HSQC谱、DEPT谱和H-H COSY谱可对各单糖的相应碳氢信号的归属。

在¹³C NMR上，可看到三个明显的端基碳信号δ99.72，103.21和102.23，HSQC可知它们分别对应的端基氢为δ4.86(1H，d，J＝4.0Hz，H-1’)，δ5.40(1H，d，J＝8.0Hz，H-1”)，δ6.01(1H，br，H-1”’)和表明鼠李糖和两个木糖分别为α-型、β-型、α-型。将鼠李糖的¹³C NMR数据与methyl rhamnopyranoside的数据^[53]对照，可知其中的2个木糖分别连在鼠李糖的3位和2位上，在HMBC上，可看到鼠李糖的端基氢δ4.86与苷元的C-3(δC78.13)位相关，同时其中一木糖的端基氢δH5.40与鼠李糖的C-2’(δC 73.59)相关，也可找到另一个木糖的端基氢δ6.01与鼠李糖的C-3(δC72.82)相关。进一步与DT-13的数据比较对照，可确定化合物的结构为：25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-[α-L-吡喃木糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基，化学结构式为：

化合物2：白色粉末，mp 226～229℃，[α]²⁴ _D-79.3(c 0.12，MeOH)，能溶于甲醇、乙醇，吡啶等，不溶于氯仿，水等，Liebermann-Burchard反应阳性(墨绿色)，提示该化合物为一甾体皂苷类化合物。IR除了在3421(羟基)，2953，1458、1376(-C＝C-)和1039(-C-O-)cm^-1处的吸收峰外，表现出特征的25R异螺甾烷型的特征吸收峰(978、918、892、901、864，901＞918cm^-1)。UPLC-IT-TOF结果表明该化合物的分子量为924，结合¹H、¹³C NMR推断化合物分子式为C₄₇H₇₂O₁₈。

¹H-NMR上给出甾体皂苷特征的两个甲基单峰δ1.96(3H，s，H-18)，δ1.09(3H，s，H-19)和δ1.20(3H，d，J＝8.0Hz，H-21)，δ0.67(3H，d，J＝4.0Hz，H-27)处的一个角甲基双峰，同时在δ5.35(1H，d，J＝8.0Hz，H-6)出现一环内烯氢信号。在¹³C NMR上，其特征的双键烯碳δ140.56，123.88(见表.1-2)，尤其是典型的C-16，17位由于羟基取代而产生的重叠的低场位移至89.92(C-16)，90.01(C-17)的碳信号以及在甾体皂苷中比较少见的高场甲基信号9.54(C-21)，可以初步判断该化合物的苷元为偏诺皂苷元。同时，C谱中可看出含1个鼠李糖6位甲基碳信号δ17.87，以及2个木糖5位碳信号δ66.01和δ67.09。

将该化合物进行2M HCl(二恶烷-H₂O，1∶1)水解，HP薄层色谱上可检出鼠李糖、木糖，同时在其氯仿层中可检出偏诺皂苷元。并且UPLC-IT-TOF给出其分子离子峰925.4730[M+H]⁺的二级碎片峰841.4684[(M+H)-84]⁺、695.5877[(M+H)-84-146]⁺、563.2872[(M+H)-84-146-132]⁺、431.3132[(M+H)-84-146-132-132]⁺，表明鼠李糖处于糖链末端位置，其中一个木糖则次之，另一个木糖则直接连于苷元母核C-3位上。

在TOCSY谱中，从3个单糖的端基氢信号出发，可以分别找到各糖各自旋偶合系统，3个单糖的偶合系统如下：

1. 4.91-4.87-4.23-4.26-3.96-4.56-4.40(rha)

2. 5.38-4.24-4.19-4.53-4.36-3.67(xyl)

3. 5.21-4.22-4.02-3.82-4.27-3.68(xyl)

完成了单糖的自旋偶合系统归属后，从糖的端基氢信号出发，利用HSQC谱、DEPT谱和H-H COSY谱可对各单糖的相应碳氢信号进行归属。

在¹³C NMR上，可看到三个明显的端基碳信号δ99.60，101.71和103.40，HSQC可知它们分别对应的端基氢为δ4.91(1H，d，J＝8.0Hz，H-1’)，δ6.16(1H，brs，H-1”)，δ5.35(1H，d，J＝8.0Hz，H-1”’)，表明分别为β-型、α-型、β-型。将鼠李糖的¹³C NMR数据与methylxylopyranoside的数据对照，可知鼠李糖和其中的1个木糖分别连在另一个木糖的3位和2位上，以及在HMBC上，可看到木糖的端基氢δ4.91与苷元的C-3(δC78.06)位相关，同时另一木糖的端基氢δH6.16与前一木糖的C-2’(δC 78.89)相关，也可找到鼠李糖的端基氢δ5.35与前一木糖的C-3(δC78.78)相关。另外，UPLC-IT-TOF给出了碎片离子峰841.4684[(M+H)-84]⁺，结合C谱NMR数据(δC170.31和21.03，170.55和20.88)可推测化合物中含两个乙酰基。在HSQC、HMBC谱中，可以发现鼠李糖2位碳δC76.79的δH5.84(1H，t)和δC170.45远程相关，5位碳的δC67.09的δH4.86(1H，m)和δC170.31远程相关，表明两个乙酰基分别存在于糖链外端鼠李糖的碳2位和碳5位上。进一步与DT-13的数据比较对照，可确定化合物的结构为：25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[2，4-O-二乙酰基-β-D-吡喃鼠李糖基-(1→3)]-β-D-吡喃木糖基，化学结构式为：

化合物3：白色粉末，mp 234～236℃，[α]²⁵ _D-100.5(c 0.09，MeOH)，能溶于甲醇、乙醇，吡啶等，不溶于氯仿，水等，Liebermann-Burchard反应阳性(墨绿色)，提示该化合物为一甾体皂苷类化合物。IR除了在3409(羟基)，2953，1459、1378(-C＝C-)和1041(-C-O-)cm^-1处的吸收峰外，表现出特征的25R异螺甾烷型的特征吸收峰(978、917、892、901、863，901＞917cm^-1)。UPLC-IT-TOF给出分子离子峰1067.4909[M+N_a]⁺，结果表明该化合物的分子量为1044，结合¹H、¹³C NMR推断化合物分子式为C₅₁H₈₀O₂₂。

¹H-NMR上给出甾体皂苷特征的两个甲基单峰δ0.93(3H，s，H-18)，δ1.02(3H，s，H-19)和δ1.20(3H，d，J＝8.0Hz，H-21)，δ0.66(3H，d，J＝7.2Hz，H-27)处的一个角甲基双峰，同时在δ5.27(1H，d，J＝6.0Hz，H-6)出现一环内烯氢信号。在¹³CNMR上，其特征的双键烯碳δ144.32，121.90(见表.1-2)，尤其是典型的C-16，17位由于羟基取代而产生的重叠的低场位移至90.06(C-16)，90.19(C-17)的碳信号以及在甾体皂苷中比较少见的高场甲基信号9.79(C-21)，可以初步判断该化合物的苷元为偏诺皂苷元。同时，C谱中可看出含1个鼠李糖6位甲基碳信号δ18.70和5位碳信号70.10，以及2个木糖5位碳信号δ66.02和δ66.89。

将该化合物进行2M HCl(二恶烷-H₂O，1∶1)水解，HP薄层色谱上可检出鼠李糖、木糖、葡萄糖，同时在其氯仿层中可检出偏诺皂苷元。并且UPLC-IT-TOF给出其分子离子峰1067.4909[M+N_a]⁺的二级碎片峰921.4486[(M+N_a)-146]⁺、789.4100[(M+N_a)-146-132]⁺、657.3605[(M+N_a)-146-132-132]⁺、431.3339[(M+N_a)-146-132-132-42-162]⁺，结合HSQC、HMBC谱，表明鼠李糖处于糖链末端位置，其中一个木糖则次之，另一个木糖则连于葡萄糖上，且葡萄糖上可能含有一个乙酰基，而葡萄糖则直接连于苷元母核C-3位上。

在TOCSY谱中，从4个单糖的端基氢信号出发，可以分别找到各糖各自旋偶合系统，4个单糖的偶合系统如下：

1. 4.97-4.52-4.10-4.82-4.16-4.87-4.86(glu)

2. 4.90-4.08-4.20-4.16-3.51-3.52(xyl)

3. 5.45-4.29-4.56-4.14-3.64-3.67(xyl)

4. 6.08-4.54-4.06-3.98-4.09-1.73-1.76(rha)

完成了单糖的自旋偶合系统归属后，从糖的端基氢信号出发，利用HSQC谱、DEPT谱和H-H COSY谱可对各单糖的相应碳氢信号进行归属。

在¹³C NMR上，可看到四个明显的端基碳信号δ103.25，100.16，103.46和102.61，HSQC可知它们分别对应的端基氢为δ4.97(1H，brs，H-1’)，δ4.89(1H，d，J＝7.2Hz，H-1”)，δ5.45(1H，d，J＝7.0Hz，H-1”’)，δ6.08(1H，brs，H-1”’)，表明分别为α-型、β-型、β-型、α-型。将葡萄糖糖的¹³C NMR数据与methyl glucopyranoside的数据[53]对照，可知其中的1个木糖连在葡萄糖的2位上，而第2个木糖连接在第1个木糖的3位上，鼠李糖则在糖链最外端，即连接在第2木糖3位上，以及在HMBC上，可看到葡萄糖的端基氢δ4.97与苷元的C-3(δC73.66)位相关，同时第一个木糖的端基氢δH4.89与葡萄糖的C-2’(δC 78.55)相关，第二个木糖的端基氢δ5.45与第一个木糖的C-3’(δC 78.93)相关，也可找到鼠李糖的端基氢δ6.08与第2个木糖的C-3(δC79.00)相关。另外，UPLC-IT-TOF给出了碎片离子峰657.3605[(M+N_a)-146-132-132]⁺，431.3339[(M+N_a)-146-132-132-42-162]⁺，结合C谱NMR数据(δC170.52和20.81)可推测化合物中含1个乙酰基，并且在HSQC、HMBC谱中，可以发现葡萄糖4位碳δC72.44的δH4.82(1H，t)和δC170.52远程相关，表明乙酰基存在于葡萄糖的碳4位上。进一步与DT-13的数据比较对照，可确定化合物的结构为：

25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-4-O-乙酰基-α-D-葡萄糖基，化学结构式为：

化合物4：白色粉末，mp 259～261℃，[α]²⁴ _D-56.6(c 0.12，MeOH)，能溶于甲醇、乙醇，吡啶等，不溶于氯仿，水等，Liebermann-Burchard反应阳性(墨绿色)，提示该化合物为一甾体皂苷类化合物。IR除了在3412(羟基)，2952，1457、1377(-C＝C-)和1044(-C-O-)cm^-1处的吸收峰外，表现出特征的25R异螺甾烷型的特征吸收峰(979、919、892、901、864，901＞919em^-1)。UPLC-IT-TOF结果表明该化合物的分子量为1070，结合¹H、¹³C NMR推断化合物分子式为C₅₃H₈₂O₂₂。

¹H-NMR上给出甾体皂苷特征的两个甲基单峰δ1.04(3H，s，H-18)，δ1.13(3H，s，H-19)和δ0.92(3H，d，J＝8.0Hz，H-21)，δ0.66(3H，d，J＝4.0Hz，H-27)处的一个角甲基双峰，同时在δ5.29(1H，d，J＝8.0Hz，H-6)出现一环内烯氢信号。在¹³C NMR上，其特征的双键烯碳δ141.27，121.66(见表.1-2)，尤其是典型的C-16，17位由于羟基取代而产生的重叠的低场位移至89.82(C-16)，89.91(C-17)的碳信号以及在甾体皂苷中比较少见的高场甲基信号9.41(C-21)，可以初步判断该化合物的苷元为偏诺皂苷元。同时，C谱中可看出含1个鼠李糖6位甲基碳信号δ18.42和5位碳信号δ69.57，以及2个木糖5位碳信号δ66.48和δ68.84。

将该化合物进行2M HCl(二恶烷-H₂O，1∶1)水解，HP薄层色谱上可检出鼠李糖、木糖、岩藻糖，同时在其氯仿层中可检出偏诺皂苷元。并且UPLC-IT-TOF给出其分子离子峰1071.5398[M+H]⁺的二级碎片峰841.4684[(M+H)-84-146]⁺、709.4132[(M+H)-84-146-132]⁺、577.3749[(M+H)-84-146-132-132]⁺、431.3165[(M+H)-84-146-132-132-146]⁺，结合HSQC、HMBC谱，表明鼠李糖处于糖链末端位置，且可能含有一个乙酰基，其中一个木糖则次之，另一个木糖则连于岩藻糖上，而岩藻糖则直接连于苷元母核C-3位上。

在¹³C NMR上，可看到四个明显的端基碳信号δ99.53，103.14，101.60和103.18，HSQC可知它们分别对应的端基氢为δ4.85(1H，d，J＝8.0Hz，H-1’)，δ5.46(1H，brs，H-1”)，δ6.10(1H，d，J＝8.0Hz，H-1”’)，δ5.29(1H，d，J＝4.0Hz，H-1”’)，表明分别为β-型、α-型、β-型、α-型。同时将岩藻糖的¹³C NMR数据与methyl fucopyranoside的数据^[53]对照，可知其中的2个木糖分别连在个岩藻糖的3位和2位上，而鼠李糖则连接在3位岩藻糖的木糖3位上，将数据与样品D34-27对比发现，该化合物仅仅比D34-27在δC170.38处和δC20.93处多2个糖信号，另外，UPLC-IT-TOF给出了碎片离子峰841.4684[(M+H)-84-146]⁺，结合C谱NMR数据(δC170.38和20.93，δC170.64和20.84)可推测化合物中含2个乙酰基，并且在HSQC、HMBC谱中，可以发现鼠李糖4位碳δC75.83的δH5.83(1H，t)和δC170.38远程相关，3位碳δC76.36的δH5.81(1H，t)和δC170.64远程相关，并且在H-HCOSY中也可看到δH5.83(1H，t)和δH5.81(1H，t)相关，表明2个乙酰基分别存在于糖链外端鼠李糖的碳4位和3位上。进一步与DT-13的数据比较对照，可确定化合物的结构为：

25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[3，4-O-二乙酰基-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃岩藻糖基，化学结构式为：

化合物5：白色粉末，mp 257～258℃，[α]²⁵ _D-77.9(c 0.17，MeOH)，能溶于甲醇、乙醇，吡啶等，不溶于氯仿，水等，Liebermann-Burchard反应阳性(墨绿色)，提示该化合物为一甾体皂苷类化合物。IR除了在3401(羟基)，2952，1456、1377(-C＝C-)和1042(-C-O-)cm^-1处的吸收峰外，表现出特征的25R异螺甾烷型的特征吸收峰(979、919、893、901、864，901＞919cm^-1)。UPLC-IT-TOF结果表明该化合物的分子量为1028，结合¹H、¹³C NMR推断化合物分子式为C₅₁H₈₀O₂₁。

¹H-NMR上给出甾体皂苷特征的两个甲基单峰δ1.03(3H，s，H-18)，δ1.16(3H，s，H-19)和δ1.26(3H，d，J＝8.0Hz，H-21)，δ0.69(3H，d，J＝4.0Hz，H-27)处的一个角甲基双峰，同时在δ5.32(1H，d，J＝8.0Hz，H-6)出现一环内烯氢信号。在¹³C NMR上，其特征的双键烯碳δ140.37，121.93，尤其是典型的C-16，17位由于羟基取代而产生的重叠的低场位移至89.93(C-16)，89.79(C-17)的碳信号以及在甾体皂苷中比较少见的高场甲基信号9.51(C-21)，可以初步判断该化合物的苷元为偏诺皂苷元。同时，C谱中可看出含1个鼠李糖6位甲基碳信号δ17.79和5位碳信号δ66.98，以及2个木5位碳信号δ66.05和δ65.59。

将该化合物进行2M HCl(二恶烷-H₂O，1∶1)水解，HP薄层色谱上可检出鼠李糖、木糖、岩藻糖，同时在其氯仿层中可检出偏诺皂苷元。并且UPLC-IT-TOF给出其分子离子峰1029.7416[M+H]⁺的二级碎片峰841.4684[(M+H)-42-146]⁺、709.4132[(M+H)-42-146-132]⁺、577.3749[(M+H)-42-146-132-132]⁺、431.3175[(M+H)-42-146-132-132-146]⁺，结合HSQC、HMBC谱，表明鼠李糖处于糖链末端位置，且可能含有一个乙酰基，其中一个木糖则次之，另一个木糖则连于岩藻糖上，而岩藻糖则直接连于苷元母核C-3位上。

在TOCSY谱中，从3个单糖的端基氢信号出发，可以分别找到各糖各自旋偶合系统，3个单糖的偶合系统如下：

1. 4.94-4.17-4.15-4.14-4.18-0.97(fuc)

2. 5.49-4.84-3.71-4.10-4.49-3.66(xyl)

3. 6.08-4.16-4.13-4.56-4.58-3.66(xyl)

4. 5.38-4.19-4.53-5.88-4.95-1.48-1.50(rha)

完成了单糖的自旋偶合系统归属后，从糖的端基氢信号出发，利用HSQC谱、DEPT谱和H-H COSY谱可对各单糖的相应碳氢信号进行归属。

在¹³C NMR上，可看到四个明显的端基碳信号δ99.24，103.32，101.59和103.13，HSQC可知它们分别对应的端基氢为δ4.94(1H，d，J＝8.0Hz，H-1’)，δ5.49(1H，brs，H-1”)，δ6.08(1H，d，J＝8.0Hz，H-1”’)，δ5.38(1H，d，J＝4.0Hz，H-1”’)，表明分别为β-型、α-型、β-型、α-型。将岩藻糖的¹³C NMR数据与methyl fucopyranoside的数据对照，可知其中的2个木糖分别连在个岩藻糖的3位和2位上，而鼠李糖则连接在3位岩藻糖的木糖3位上，以及在HMBC上，可看到岩藻糖的端基氢δ4.94与苷元的C-3(δC77.26)位相关，同时其中一木糖的端基氢δH5.49与岩藻糖的C-2’(δC 76.52)相关，另一个木糖的端基氢δ6.08与岩藻糖C-3’(δC75.52)相关，也可找到鼠李糖的端基氢δ5.38与处于岩藻糖3位上的木糖的C-3(δC77.64)相关。另外，UPLC-IT-TOF给出了碎片离子峰841.4684[(M+H)-42-146]⁺，结合C谱NMR数据(δC170.54和20.98)可推测化合物中含1个乙酰基，并且在HSQC、HMBC谱中，可以发现鼠李糖4位碳δC75.73的δH5.85(1H，t)和δC170.54远程相关，表明乙酰基存在于糖链外端鼠李糖的碳4位上。进一步与DT-13的数据比较对照，可确定化合物的结构为：

25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[4-O-乙酰基-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃岩藻糖基，化学结构式为：

表1本发明的五个化合物的核磁数据：¹H(400MHz)and¹³C NMR(100MHz)inpyridine-d₅

表2本发明的五个化合物的核磁数据：¹H(400MHz)and¹³C NMR(100MHz)inpyridine-d₅

附图说明

图1 ¹H NMR spectrum of 1(pyridine-d5)

图2 ¹³CNMR spectrum of 1(pyridine-d5)

图3 DEPT spectrum of 1(pyridine-d5)

图4 ¹H-¹H COSY spectrum of 1(pyridine-d5)

图5 HSQC spectrum of 1(pyridine-d5)

图6 HMBC spectrum of 1(pyridine-d5)

图7 TCOSY spectrum of 1(pyridine-d5)

图8 IT-TOF spectrum of 1

图9 IR spectrum of 1

图10 ¹H NMR spectrum of 2(pyridine-d5)

图11 ¹³CNMR spectrum of 2(pyridine-d5)

图12 DEPT spectrum of 2(pyridine-d5)

图13 ¹H-¹H COSY spectrum of 2(pyridine-d5)

图14 HSQC spectrum of 2(pyridine-d5)

图15 HMBC spectrum of 2(pyridine-d5)

图16 TCOSY spectrum of 2(pyridine-d5)

图17 IT-TOF spectrum of 2

图18 IR spectrum of 2

图19 ¹H NMR spectrum of 3(pyridine-d5)

图20 ¹³CNMR spectrum of 3(pyridine-d5)

图21 DEPT spectrum of 3(pyridine-d5)

图22 ¹H-¹H COSY spectrum of 3(pyridine-d5)

图23 HSQC spectrum of 3(pyridine-d5)

图24 HMBC spectrum of 3(pyridine-d5)

图25 TCOSY spectrum of 3(pyridine-d5)

图26 IT-TOF spectrum of 3

图27 IR spectrum of 3

图28 ¹H NMR spectrum of 4(pyridine-d5)

图29 ¹³CNMR spectrum of 4(pyridine-d5)

图30 DEPT spectrum of 4(pyridine-d5)

图31 ¹H-¹H COSY spectrum of 4(pyridine-d5)

图32 HSQC spectrum of 4(pyridine-d5)

图33 HMBC spectrum of4(pyridine-d5)

图34 TCOSY spectrum of 4(pyridine-d5)

图35 IT-TOF spectrum of 4

图36 IR spectrum of 4

图37 ¹H NMR spectrum of 5(pyridine-d5)

图38 ¹³CNMR spectrum of 5(pyridine-d5)

图39 DEPT spectrum of 5(pyridine-d5)

图40 ¹H-¹H COSY spectrum of 5(pyridine-d5)

图41 HSQC spectrum of 5(pyridine-d5)

图42 HMBC spectrum of 5(pyridine-d5)

图43 TCOSY spectrum of 5(pyridine-d5)

图44 IT-TOF spectrum of 5

图45 IR spectrum of 5

具体实施方式

一组从短葶山麦冬地下部位中分离得到的5个含有偏诺型甾体皂苷元母核类化合物，其母核结构如下：

化合物化学名称分别为：化合物1、25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-[α-L-吡喃木糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基，化合物2、25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[2，4-O-二乙酰基-β-D-吡喃鼠李糖基-(1→3)]-β-D-吡喃木糖基，化合物3、25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-4-O-乙酰基-α-D-葡萄糖基，化合物4、25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[3，4-O-二乙酰基-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃岩藻糖基，化合物5、25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[4-O-乙酰基-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃岩藻糖基。经过波谱解析和化学的方法确定了化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5的结构，分别为：

上述五个化合物由以下分离方法所得：

具体实施例1

化合物1：

(1)称取粉碎的短葶山麦冬地下部位10kg，加入8倍体积的70％的乙醇，搅匀，回流提取为2次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，备用。

(2)将药液直接进行预处理过的D101大孔树脂吸附，并用水，30％乙醇洗脱除杂2-4柱程和70％进行洗脱4-6柱程，收集合并70％洗脱液，减压回收乙醇，备用。

(3)将(2)中所得药液依次用乙酸乙酯(药液和乙酸乙酯比例为1∶1)、正丁醇(药液和正丁醇比例为1∶1)萃取2-3次，将萃取液分别浓缩至浸膏，分别获得乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

(4)将正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇按比例10∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8进行分别梯度洗脱2-6柱程，分别收集各部分洗脱液，用薄层色谱进行检测，显色，合并相同部分，浓缩至干，备用。

(5)将硅胶柱层析I2至I8部分分别进行凝胶Sephadex LH-20除杂，用氯仿-甲醇体积比为1∶1进行洗脱除杂，分别收集各部分所得洗脱液，60度以下减压回收浓缩至干得II2至II8，备用。

(6)将II7部分以RP-18为填料，用高效液相进行纯化，其II7以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为60％，水的浓度为40％；以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为65％，水的浓度为35％；再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为70％，水的浓度为30％，流速1.0ml/min得纯度为98％以上的化合物1。

具体实施例2

化合物2：

(1)称取粉碎的短葶山麦冬地下部位10kg，加入8倍体积的70％的乙醇，搅匀，回流提取为2次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，备用。

(2)将药液直接进行预处理过的D101大孔树脂吸附，并用水，30％乙醇洗脱除杂2-4柱程和70％进行洗脱4-6柱程，收集合并70％洗脱液，减压回收乙醇，备用。

(3)将(2)中所得药液依次用乙酸乙酯(药液和乙酸乙酯比例为1∶1)、正丁醇(药液和正丁醇比例为1∶1)萃取2-3次，将萃取液分别浓缩至浸膏，分别获得乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

(4)将正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇按比例10∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8进行分别梯度洗脱2-6柱程，分别收集各部分洗脱液，用薄层色谱进行检测，显色，合并相同部分，浓缩至干，备用。

(5)将硅胶柱层析I2至I8部分分别进行凝胶Sephadex LH-20除杂，用氯仿-甲醇体积比为1∶1进行洗脱除杂，分别收集各部分所得洗脱液，60度以下减压回收浓缩至干得II2至II8，备用。

(6)将II5部分以RP-18为填料，用高效液相进行纯化，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为70％，水的浓度为30％；以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为75％，水的浓度为25％；再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为80％，水的浓度为20％，流速1.0ml/min，得纯度为98％以上的化合物2。

具体实施例3

化合物3：

(1)称取粉碎的短葶山麦冬地下部位10kg，加入8倍体积的70％的乙醇，搅匀，回流提取为2次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，备用。

(2)将药液直接进行预处理过的D101大孔树脂吸附，并用水，30％乙醇洗脱除杂2-4柱程和70％进行洗脱4-6柱程，收集合并70％洗脱液，减压回收乙醇，备用。

(3)将(2)中所得药液依次用乙酸乙酯(药液和乙酸乙酯比例为1∶1)、正丁醇(药液和正丁醇比例为1∶1)萃取2-3次，将萃取液分别浓缩至浸膏，分别获得乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

(4)将正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇按比例10∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8进行分别梯度洗脱2-6柱程，分别收集各部分洗脱液，用薄层色谱进行检测，显色，合并相同部分，浓缩至干，备用。

(5)将硅胶柱层析I2至I8部分分别进行凝胶SephadexLH-20除杂，用氯仿-甲醇体积比为1∶1进行洗脱除杂，分别收集各部分所得洗脱液，60度以下减压回收浓缩至干得II2至II8，备用。

(6)将II5部分以RP-18为填料，用高效液相进行纯化，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为70％，水的浓度为30％；以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为75％，水的浓度为25％；再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为80％，水的浓度为20％，流速1.0ml/min，得纯度为98％以上的化合物3。

具体实施例4

化合物4：

(1)称取粉碎的短葶山麦冬地下部位10kg，加入8倍体积的70％的乙醇，搅匀，回流提取为2次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，备用。

(2)将药液直接进行预处理过的D101大孔树脂吸附，并用水，30％乙醇洗脱除杂2-4柱程和70％进行洗脱4-6柱程，收集合并70％洗脱液，减压回收乙醇，备用。

(3)将(2)中所得药液依次用乙酸乙酯(药液和乙酸乙酯比例为1∶1)、正丁醇(药液和正丁醇比例为1∶1)萃取2-3次，将萃取液分别浓缩至浸膏，分别获得乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

(4)将正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇按比例10∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8进行分别梯度洗脱2-6柱程，分别收集各部分洗脱液，用薄层色谱进行检测，显色，合并相同部分，浓缩至干，备用。

(5)将硅胶柱层析I2至I8部分分别进行凝胶Sephadex LH-20除杂，用氯仿-甲醇体积比为1∶1进行洗脱除杂，分别收集各部分所得洗脱液，60度以下减压回收浓缩至干得II2至II8，备用。

(6)将II8部分以RP-18为填料，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为50％，水的浓度为50％；以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为55％，水的浓度为45％；再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为60％，水的浓度为40％，流速1.0ml/min，得纯度为98％以上的化合物4。

具体实施例5

化合物5：

(1)称取粉碎的短葶山麦冬地下部位10kg，加入8倍体积的70％的乙醇，搅匀，回流提取为2次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，备用。

(2)将药液直接进行预处理过的D101大孔树脂吸附，并用水，30％乙醇洗脱除杂2-4柱程和70％进行洗脱4-6柱程，收集合并70％洗脱液，减压回收乙醇，备用。

(3)将(2)中所得药液依次用乙酸乙酯(药液和乙酸乙酯比例为1∶1)、正丁醇(药液和正丁醇比例为1∶1)萃取2-3次，将萃取液分别浓缩至浸膏，分别获得乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

(4)将正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇按比例10∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8进行分别梯度洗脱2-6柱程，分别收集各部分洗脱液，用薄层色谱进行检测，显色，合并相同部分，浓缩至干，备用。

(5)将硅胶柱层析I2至I8部分分别进行凝胶Sephadex LH-20除杂，用氯仿-甲醇体积比为1∶1进行洗脱除杂，分别收集各部分所得洗脱液，60度以下减压回收浓缩至干得II2至II8，备用。

(6)将II8部分以RP-18为填料，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为50％，水的浓度为50％；以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为55％，水的浓度为45％；再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为60％，水的浓度为40％，流速1.0ml/min，得纯度为98％以上的化合物5。

本发明的五个化合物的抗肿瘤活性研究：

1.肿瘤细胞细胞培养

将MDA-MB-435肿瘤细胞株，以含10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃，5％CO₂条件下培养。当细胞密度达到8×10⁵个/mL时，进行传代培养(离心法)，即以1000rpm，离心5分钟，弃掉上清液，以新鲜的10％DMEM培养基重悬细胞，以2×105个/mL的密度传代接种。

2.实验药物的配制

称取适量各样品分别溶解于DMSO中，使之浓度为100mM，储存液4℃保存。

实验之前，将储存液用无血清的DMEM高糖培养基稀释，使药物浓度为100μM，并且保证DMSO的最终浓度低于1‰。

加入不同体积的无血清的DMEM培养基稀释成不同浓度。同时用含有1‰DMSO的无血清的DMEM培养基作为阴性对照。

3.药物对肿瘤细胞株的毒性

将肿瘤细胞用10％DMEM培养基悬浮，以1×10⁶cell/mL的细胞密度接种96孔培养板(150μL/孔)，37℃、5％CO2培养24小时。在肿瘤细胞株的对数生长期，加入不同浓度的药物，37℃、5％CO₂培养72小时或者24小时。

4.MTT法检测细胞活力

药物作用72小时后弃去原培养液，按照终浓度0.5mg/ml加入MTT在培养箱中孵育3小时后去除MTT溶液，加入150μL DMSO，振荡器震荡10分钟使结晶溶解，酶标仪570nm，650nm双波长检测。利用IC₅₀计算软件，计算药物的IC₅₀(半数抑制浓度)，以Doxorubicin和P_t作为阳性药。

表3化合物对MDA-MB-435肿瘤细胞的的抑制作用(IC₅₀值)

化合物名称	IC50(μg/ml)
		化合物1	＞100
化合物2	0.39
		化合物3	7.27
化合物4	＞100
		化合物5	＞100
Doxorubicin	11.48
		Pt	5.52

上述实验结果表明：化合物1、4、5对MDA-MB-435肿瘤细胞具有一定的抑制作用，而化合物2、3对MDA-MB-435肿瘤细胞具有明显的抑制作用，具有较好的量效关系。

Claims (3)

1.从短葶山麦冬地下部位分离得到的5个偏诺型甾体皂苷类化合物，分别为：

化合物1：化学名称为25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-[α-L-吡喃木糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基，化学结构式为

化合物2：化学名称为25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[2，4-O-二乙酰基-β-D-吡喃鼠李糖基-(1→3)]-β-D-吡喃木糖基，化学结构式为

化合物3：化学名称为25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-4-O-乙酰基-α-D-葡萄糖基，化学结构式为

化合物4：化学名称为25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[3，4-O-二乙酰基-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃岩藻糖基，化学结构式为

化合物5：化学名称为25(R)-偏诺皂苷元-3-O-[α-L-吡喃木糖基-(1→2)]-[4-O-乙酰基-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃岩藻糖基，化学结构式为

2.根据权利要求1所述的从短葶山麦冬中分离得到的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取粉碎的短葶山麦冬地下部位，加入6-10倍体积的50％-70％乙醇，搅匀，回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，备用；

(2)将药液直接进行预处理过的D101大孔树脂吸附，并依次用水，20％-30％乙醇洗脱除杂和50％-70％乙醇洗脱，收集合并洗脱液，减压回收乙醇，备用；

(3)将(2)中所得药液依次用乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，将萃取液分别浓缩至浸膏，分别获得乙酸乙酯、正丁醇萃取物；

(4)将正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇体积比为10∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8的洗脱溶剂进行梯度洗脱，并分别收集各洗脱部分，用薄层色谱进行检测，显色，合并相同部分，浓缩至干，备用；

(5)将硅胶柱层析I2至I8部分分别用凝胶Sephadex LH-20进行柱层析，用氯仿-甲醇体积比为1∶1的混合溶剂进行洗脱除杂，分别收集各部分所得洗脱液，减压回收浓缩至干，得II2至II8，备用；

(6)将II7部分以RP-18为填料，用高效液相色谱仪进行纯化，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为60％，水的浓度为40％，以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为65％，水的浓度为35％，再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为70％，水的浓度为30％，得纯度为98％以上的化合物1；将II5部分以RP-18为填料，用高效液相色谱仪进行纯化，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为70％，水的浓度为30％，以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为75％，水的浓度为25％，再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为80％，水的浓度为20％，得纯度为98％以上的化合物2，3；将II8部分以RP-18为填料，用高效液相色谱仪进行纯化，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为50％，水的浓度为50％，以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为55％，水的浓度为45％，再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为60％，水的浓度为40％，得纯度为98％以上的化合物4，5。

3.根据权利要求1所述的从短葶山麦冬中分离得到的偏诺型甾体皂苷类化合物的一种或两种以上的混合物在制备抗肿瘤药物方面的用途。