CN103694308A - 短亭山麦冬新鲁斯可型甾体皂苷新化合物及制备鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从短亭山麦冬地下部位分离出的一种新鲁斯可型甾体皂苷新化合物，化学名称为：neoruscogenin1-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-xylopyranosid，由短葶山麦冬地下部位经粗提、大孔树脂吸附、反复萃取、硅胶柱层析、Spheladex LH-20柱层析、中压液相色谱仪分离所得，并采用1D和2D-NMR技术鉴定其结构。

Description

短亭山麦冬新鲁斯可型甾体皂苷新化合物及制备鉴定

技术领域

本发明涉及从短亭山麦冬地下部位中提取分离的一种新鲁斯可型甾体皂苷新化合物、制备方法及鉴定。

背景技术

短葶山麦冬为百合科(Lilaceae)山麦冬属(Liriope)植物短葶山麦冬Liriopemuscari(Decne)Baily的干燥块根，是《中国药典》一部“山麦冬”项下收载的常用中药。具有养阴润肺，益胃生津的功效，可用于肺燥干咳，阴虚痨嗽，喉痹咽痛，津伤口渴，内热消渴，心烦失眠，肠燥便秘”，广泛用于心血管系统、呼吸系统疾病及糖尿病等疾病的治疗。药理实验表明，短葶山麦冬药材可以显著延长小鼠存活时间、极显著增加小鼠的脾脏重量、显著增强小鼠的碳粒廓清作用。前期研究表明，短葶山麦冬中主要含甾体皂苷类、萜类、酰胺生物碱类、脂肪酸类等化合物，其中甾体皂苷是其主要生物活性成分。药理作用表明，短葶山麦冬药材中分离所得的甾体皂苷类化合物DT-13为其主要活性成分，其能抑制肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等肿瘤的生长和转移，并发现其通过与蛋白NMMHC IIA结合，调节肿瘤转移过程中的多种关键分子，进而抑制肿瘤。长期以来，在市场上，尤其是在福建省泉州市，惠安，仙游等地作为麦冬Ophiopogon japonicus的替代品使用。国内外学者对该植物化学成分研究报道甚少，仅有的文献大部分集中在我们研究小组对其成分的研究上[(1)余伯阳，徐国钧，平井康昭，等.湖北麦冬与短葶山麦冬的化学成分研究(II)[J].中国药科大学学报，1988，19：296.(2)程志红，吴弢，余伯阳，等.短亭山麦冬化学成分的研究[J].中草药，2005，36(6)：823-826.(3)Tian，Y.Q.；Kou，J.P.；Li，L.Z.；Yu，B.Y.Anti-inflammatory effects of aqueous extractfrom Radix Liriope muscari and its major active fraction and component.Chin.J.Nat.Med.2011，9，222-226.(4)Yu，B.Y.；Hirai.Y.；Shoji.J.；Xu，G.J.Comparative studies on the constituents ofophiopogonis tuber and its congeners.VI.Studies on the constituents of the subterranean part ofLiriope spicata var.prolifera and L.muscari，Chem.Pharm.Bull.1990，38，1931-1935.(5)Yu，B.Y.；Qiu S.X；Zaw，KY.；Xu.G.J.；Hirai Yusuaki；Shoji Junzo，et al.Steroidal glycosides from thesubterranean parts of Liriope spicata var.prolifera.Phytochemistry1996，43，201-206.(6)Cheng，Z.H.；Wu，T.；Annie Bligh SW，Bashall Alan.；Yu，B.Y.；cis-eudesmanesesquiterpene glycosides fromLiriope muscari and Ophiopogonjaponicus.J.Nat.Prod.2004，67，1761-3.(7)Cheng，Z.H.；Wu，T.；Yu，B.Y.Studies on Chemical constituents of Liriope muscari(in Chinese)，Zhong.Cao.Yao.2005，36，823-826.(8)Cheng，Z.H.；Wu，T.；Yu，B.Y.Two new steroidal glycosides from Liriope muscari.Chin.Chem.Lett.2006，17，31-34.(9)Jiang，T.；Qin，L.P.Research on the chemical constituentsand pharmacological activities of Liriope Lour，J.Chin.Intergr.Med.2007，5，465-469.(10)Jiang，Z.Ch.；Hua，h.；Li，Liu.L.；Qin，M.J.A new eudesmane sesquiterpene glycosides from Liriopemuscari.Asia.N.P.R.2012，14，491-495.(11)Li，W.J.；Cheng，X.L.；Liu，J.；Lin，R.Ch.；Wang，G.Li.Phenolic Compounds and Antioxidant Activities of Liriope muscari，Molecules.2012，17，1797-1808.(12)Xu，Q.；Wang，R.；Yu，B.Y.Effects of ruscogenin fucopyranoside on thedelayed type hypersensitivity and inflammatory reactions，J.Chin.Pharm.Univ.1993，24，98-101.(13)Yu，B.Y.；Yin，X.；Rong，Z.Y.；Yang，T.M.；Zhang，C.H.；Xu，G.J.Biological activities ofruscogenin1-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)][β-D-xylopyranosyl(1→3)]-β-D-fucopyranosidefrom tuberous roots of Liriope muscari(Decne.)Baily，J.Chin.Pharm.Univ.1994，25，286-288.(14)Wu，F.H.；Cao，J.S.；Jiang，J.Y.；Yu，B.Y.；Xu，Q.Ruscogenin glycoside(Lm-3)isolated fromLiriope muscari improves liver injury by dysfunctioning liver-infiltrating lymphocytes，J.Pharm.Pharmacol.2000，53，681-688.(15)Liu，J.L.；Chen，T.；Yu，B.Y.；Xu，Q.Ruscogenin glycoside(Lm-3)isolated from Liriope muscari inhibits lymphocyte adhesion to extracellular matrix，J.Pharm.Pharmacol.2002，54，959-966.(16)Tao，J.；Wang，H.Y.；Zhou，H.；Li，S.N.The saponinmonomer of dwarf lilyturf tuber，Lm-3，reduces L-type calcium currents during hypoxia in adult ratventricular myocytes，Life.Sci.2005，77，3021-3030.(17)Tao，J.；Wang，H.Y.；Chen，J.D.；Xu，H.E.；Li，S.N.Effects of saponin monomer13of dwarf lilyturf tuber on L-type calcium currents inadult rat ventricular myocytes，Am.J.Chin.Med.2005，33，797-806.(18)Sun，L.；Lin，S.S.；Zhao，R.P.；Yu，B.Y.；Yuan，S.T.；Zhang，L.Y.The saponin monomer of dwarf lilyturf tuber，DT-13，reduces human breast cancer cell adhesion and migration during hypoxiavia regulation of tissue factor，Biol.Pharm.Bull.2010，33，1192-1198.(19)Sun，L.；Lin，S.S.；Yu，B.Y.；Yuan，S.T.；Zhang，L.Y.High-throughput screening model for tissue factor inhibitorand effect of DT-13on anti-tumor metastasis，Chin.J.Nat.Med.2010，8，466-470.(20)Ma，S.T.；Kou，J.P.；Yu，B.Y.Safety evaluation of steroidal saponin DT-13isolated from the tuber of Liriopemuscari(Decne.)Baily，Food.Chem.Toxicol.2011，doi：10.1016/j.fct.2011.06.022.]

发明内容

本发明的目的是提供从短葶山麦冬地下部位中分离出的一种新鲁斯可型甾体皂苷新化合物，由短葶山麦冬地下部位经粗提、大孔树脂吸附、反复萃取、硅胶柱层析、Spheladex LH-20柱层析、中压液相色谱仪分离所得。本发明提供的一种新化合物是从短葶山麦冬地下部位中经粗提、大孔树脂吸附、反复萃取、硅胶柱层析、Spheladex LH-20柱层析、中压液相色谱仪分离分离所得的一种含新鲁斯可型甾体皂苷元母核类新化合物，其母核结构如下：

化合物化学名称为：neoruscogenin1-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-xylopyranoside。经过波谱解析和化学的方法确定了化合物结构为：

上述新化合物包含如下步骤制备所得：

(1)称取粉碎的短葶山麦冬地下部位，加入一定体积的乙醇，搅匀，回流提取，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，备用。

(2)将药液直接进行预处理过的大孔树脂吸附，并用水，乙醇洗脱除杂和洗脱，收集合并洗脱液，减压回收乙醇，备用。

(3)将(2)中所得药液依次用乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，将萃取液分别浓缩至浸膏，分别获得乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

(4)将正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱进行检测，显色，合并相同部分，浓缩至干，备用。

(5)将硅胶柱层析I2至I8部分分别用凝胶Sephadex LH-20进行柱层析，用氯仿-甲醇进行洗脱除杂，分别收集所得洗脱液，减压回收浓缩至干得II2至II8，备用。

(6)将II3部分以MCI为填料，用中压液相色谱仪进行纯化，得上述新化合物。。

3、如权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该该方法为：步骤(1)中，提取用的乙醇为6-10倍体积的50-70％的乙醇，回流提取为2次，每次1小时。

4、权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(2)中，所用大孔树脂为D101型，除杂乙醇浓度为20％-30％，所得合并液为50％-70％洗脱部分。

5、权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(3)中，其所用的乙酸乙酯和溶剂比例为1∶1、正丁醇与溶剂比例为1∶1。

6、权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(4)中，其所用的氯仿-甲醇体积比为10∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8的洗脱溶剂进行梯度洗脱，并分别收集各洗脱部分。

7、权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(5)中，其所用的氯仿-甲醇梯度洗脱体积比为1∶1的混合溶剂，并分别收集各洗脱部分。

8、权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(6)中，其II3所用的甲醇-水梯度洗脱体积比为8∶2，7∶3，6∶4，用中压液相色谱仪进行纯化，得纯度为98％以上的该新化合物。

本发明的化合物的结构测定与推导：

白色粉术，能mp263～266℃，[α]²⁵ _D-42.4(c0.09，MeOH)，能溶于甲醇、乙醇，吡啶等，不溶于氯仿，水等，提提示该化合物为一甾体皂苷类化合物。IR在3367401(羟基)，2950，1454、1377(-C＝C-)和1050(-C-O-)cm^-1处有吸收峰外，表现出新鲁斯可特征的螺甾烷型的特征吸收峰(980、918、899、853cm^-1)。UPLC-IT-TOF结果表明该化合物的分子量为706，结合¹H、¹³C-NMR推断化合物分子式为C₃₈H₅₈O₁₂。

¹H-NMR上给出甾体皂苷特征的两个甲基单峰δ0.82(3H，s，H-18)，δ1.38(3H，s，H-19)和δ0.99(3H，d，J＝7.0Hz，H-21)处的一个角甲基双峰，同时在δ5.55出现一环内烯氢信号，和δ4.75(1H，brs)，δ4.78(1H，brs)处的两个环外烯氢信号。

进一步通过与已知苷元(鲁斯可皂苷元、偏诺皂苷元、薯蓣皂苷元、新鲁斯可皂苷元等)¹³CNMR数据比较，推测该化合物为新鲁斯可皂苷元。其特征数据包括：C5～6环内双键(δ139.48，124.84)，和δ144.53(C-25)、δ108.6(C-27)。而HMBC的相关信息可以进一步对苷元的特征位点进行归属和确证，如CH₃-18(δ0.80)与C-12(δ40.11)、C-14(δ56.59)和C-17(δ62.74)相关，CH₃-19(δ1.37)与C-1(δ83.62)、C-5(δ139.48)、C-9(δ50.23)和C-10(δ42.95)相关，CH₃-21(δ1.38)与C-17(δ62.74)、C-20(δ41.89)和C-22(δ109.37)相关，27位的两个环外烯氢δ4.78(1H，brs)，δ4.75(1H，brs)与C-24(δ28.96)、C-25(δ144.53和C-26(δ64.96)相关，因此确定化合物苷元为新鲁斯可皂苷元。

在碳谱发现的δ100.16(木糖)、100.52(鼠李糖)两个端基糖的信号，HSQC显示分别对应的端基氢为δ4.57(1H，d，J＝9.0Hz)和6.17(1H，brs)，通过偶合常数推测它们分别为β-和α-型。将该化合物进行2M HCl(二恶烷-H₂O，1∶1)水解，HP薄层色谱上可检出岩藻糖和鼠李糖，同时在其氯仿层中可检出新鲁斯可皂苷元。在HMBC谱中，可以发现岩藻糖端基氢δ4.57与苷元C-1(δ83.62)相关，鼠李糖的端基氢δ6.17与木糖C-2’(δ72.50)相关，另外发现在C-1产生了6.62的低场苷化位移，而C-3化学位移未发生改变，说明仅苷元的C-1位有糖链存在，因而糖链结构得以确定。

同时，UPLC-IT-TOF二级质谱ESIMS²给出准分子离子峰707.3966[M+H]⁺的碎片峰561.3445[(M+H)-146]^+-429.3008[(M+H)-146-132]⁺，也证实该化合物为以新鲁斯可皂苷元为母核的双糖甾体皂苷，并且鼠李糖位于糖链外侧。进一步与DT-13的数据比较对照，可确定化合物的结构为：neoruscogenin1-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-xylopyranoside，化学结构式为：

表1本发明的新化合物的核磁数据：¹H(400MHz)and¹³C NMR(100MHz)in pyridine-d₅

附图说明

图1 ¹H NMR spectrum(pyridine-d5)

图2 ¹³CNMR spectrum(pyridine-d5)

图3 DEPT spectrum(pyridine-d5)

图4 ¹H-¹H COSY spectrum(pyridine-d5)

图5 HSQC spectrum(pyridine-d5)

图6 HMBC spectrum(pyridine-d5)

图7 TCOSY spectrum(pyridine-d5)

图8 IT-TOF spectrum

图9 IR spectrum

具体实施方式

一种从短亭山麦冬地下部位中分离得到的一种含新鲁斯可型甾体皂苷元母核类新化合物，其母核结构如下：

化合物化学名称为：neoruscogenin1-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-xylopyranoside。经过波谱解析和化学的方法确定了化合物的结构为：

上述新化合物由以下分离方法所得：

(1)称取粉碎的短葶山麦冬地下部位10KG，加入8倍体积的70％的乙醇，搅匀，回流提取为2次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，备用。

(2)将药液直接进行预处理过的D101大孔树脂吸附，并用水，30％乙醇洗脱除杂2-4柱程和70％进行洗脱4-6柱程，收集合并70％洗脱液，减压回收乙醇，备用。

(3)将(2)中所得药液依次用乙酸乙酯(溶剂和乙酸乙酯比例为1∶1)、正丁醇(溶剂和正丁醇比例为1∶1)萃取2-3次，将萃取液分别浓缩至浸膏，分别获得乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

(4)将正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇-水按比例10∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8进行分别梯度洗脱2-6柱程，分别收集各部分洗脱液，用薄层色谱进行检测，显色，合并相同部分，浓缩至干，备用。

(5)将硅胶柱层析I2至I8部分分别进行凝胶Sephadex LH-20除杂，用氯仿-甲醇体积比为1∶1进行洗脱除杂，分别收集各部分所得洗脱液，60度以下减压回收浓缩至干得II2至II8，备用。

(6)将II3部分以MCI为填料，用中压液相色谱仪进行纯化，其II3以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为60％，水的浓度为40％；以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为70％，水的浓度为30％；再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为80％，水的浓度为20％，流速15.0ml/min，进行梯度洗脱，得纯度为98％以上的上述新化合物。

Claims (8)

1.一种从短亭山麦冬地下部位中分离得到的短亭山麦冬新鲁斯可型甾体皂苷新化合物的分离鉴定及制备，化学名称为：neoruscogenin1-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-xylopyranoside。化学结构式为：

2.根据权利要求1所述的从短亭山麦冬中分离的新化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取粉碎的短葶山麦冬地下部位，加入一定体积的乙醇，搅匀，回流提取，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，备用。

(2)将药液直接进行预处理过的大孔树脂吸附，并用水，乙醇洗脱除杂和洗脱，收集合并洗脱液，减压回收乙醇，备用。

(3)将(2)中所得药液依次用乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，将萃取液分别浓缩至浸膏，分别获得乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

(4)将正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱进行检测，显色，合并相同部分，浓缩至干，备用。

(5)将硅胶柱层析I2至I8部分分别用凝胶Sephadex LH-20进行柱层析，用氯仿-甲醇进行洗脱除杂，分别收集所得洗脱液，减压回收浓缩至干得II2至II8，备用。

(6)将II3部分以MCI为填料，用中压液相色谱仪进行纯化，得上述新化合物。

3.如权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该该方法为：步骤(1)中，提取用的乙醇为6-10倍体积的50-70％的乙醇，回流提取为2次，每次1小时。

4.权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(2)中，所用大孔树脂为D101型，除杂乙醇浓度为20％-30％，所得合并液为50％-70％洗脱部分。

5.权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(3)中，其所用的乙酸乙酯和溶剂比例为1∶1、正丁醇与溶剂比例为1∶1。

6.权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(4)中，其所用的氯仿-甲醇体积比为10∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8的洗脱溶剂进行梯度洗脱，并分别收集各洗脱部分。

7.权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(5)中，其所用的氯仿-甲醇梯度洗脱体积比为1∶1的混合溶剂，并分别收集各洗脱部分。

8.权利要求2所述化新合物的分离方法，其特征在于该方法为：步骤(6)中，其II3以甲醇-水为流动相，梯度洗脱条件如下：0到10分钟，甲醇-水为流动相中，甲醇体积浓度为60％，水的浓度为40％；以另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为70％，水的浓度为30％；再于另外的10分钟内，甲醇的浓度匀速变为80％，水的浓度为20％，得纯度为98％以上的该新化合物。

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