CN103570795A - 一种雷公藤红素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种雷公藤红素的制备方法,其特征在于,具体步骤为:将新鲜南蛇藤根洗净、切片,晒干,粉碎成南蛇藤粉;将南蛇藤粉浸泡提取;将提取液回收溶剂,得到提取物浸膏;将提取物浸膏用有机溶剂溶解,干法上硅胶柱,经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱,收集含有雷公藤红素的洗脱部分,回收溶剂,得到雷公藤红素粗品;将雷公藤红素粗品用有机溶剂溶解,干法上硅胶柱,经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱,收集含有雷公藤红素的洗脱部分回收溶剂,得到雷公藤纯品。本发明操作简单,工艺简便,对仪器和设备要求低,浸泡法获得的提取物直接进行两次硅胶柱层分离,避免溶剂萃取、酸碱处理等手段,产品收率高,浸泡溶剂经回收可反复使用,适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从南蛇藤药材中制备雷公藤红素的新方法,尤其涉及一种从南蛇藤中提取、分离、纯化雷公藤红素的制备方法,属于天然活性产物制备方法的技术领域。
背景技术
南蛇藤为卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤(celastrus orbiculatus Thunb)根。本品具有驱风除湿,活血解毒,消肿的功效。主治筋骨疼痛,四肢麻木,风湿性关节炎,腰腿痛,闭经,小儿惊风,痧症、痢疾、肿毒、毒蛇咬伤、跌打损伤。民间常用该药煎汤或外敷治疗风湿痹疼,该药的汤剂和酊剂已在临床上用于治疗类风湿性关节炎多年,疗效确切。南蛇藤化学成分复杂,已从该植物种子、叶及地上部分分离到50多种成分,主要有三萜类、黄酮类、有机酸类、多元醇类、甾体、生物碱及鞣质。其中三萜类、生物碱类、黄酮类含量较高。南蛇藤以其根入药,治疗风湿性和类风湿性关节炎,原发性血小板增多症,以及关节神经痛强直性脊柱炎和痹症。近年的国内外研究表明,南蛇藤在抗炎,抗肿瘤,抗氧化,抗多药耐药性以及抗生育方面都有着广阔的研究和应用前景,尤其最值得关注的是抗肿瘤方面的显著作用,其主要活性成分为南蛇藤素(雷公藤红素)。
雷公藤红素:分子式:C29H38O4,分子量:450.61,
结构式为:
雷公藤红素是一种具有多种生物活性的天然产物,具有显著的药理活性,如抗炎,免疫抑制,抗肿瘤,抗纤维化,抑制血管生成,诱导细胞凋亡等作用。雷公藤红素是目前很值得关注的天然活性物质,其药理活性广泛而显著,具有重要的研究开发价值,可有望开发成具有多种治疗作用的新药。雷公藤红素为三萜类,结构复杂,在植物中含量低,分离纯化工艺复杂,给制备红素带来困难,往往无法获得纯品。有关制备红素的方法有多种,有的用乙醇回流提取,上硅胶或氧化铝柱分离,有的用超声波提取,提取物用酸、碱沉淀,氧化铝柱层析等过程,在进行上述实验过程中,均说能获得纯品,有的还进行了专利申请,但他们的实验方法要获得真正纯度高的纯品,还是有一定困难。
以上可知,现有制备工艺步骤相对较长,操作繁琐,产品得率不高,关键是大多无法获得真正意义上的纯品。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单,产品收率高,工艺稳定、方法有效的一种制备纯化雷公藤红素的新方法。
为了实现上述目的,本发明提供了一种雷公藤红素的制备方法,其特征在于,具体步骤为:
第一步:将新鲜南蛇藤根洗净、切片,晒干,粉碎成南蛇藤粉;
第二步:将第一步得到的南蛇藤粉用有机溶剂浸泡提取至少一次,合并提取液;
第三步:将第二步得到的提取液旋转蒸发回收溶剂,得到提取物浸膏;
第四步:将第三步得到的提取物浸膏用有机溶剂溶解,以层析用硅胶拌样,待有机溶剂挥发干净后,干法上硅胶柱,经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱,薄层层析色谱检测洗脱进程,收集含有雷公藤红素的洗脱部分,旋转蒸发回收溶剂,得到雷公藤红素粗品;
第五步:将第四步得到的雷公藤红素粗品用有机溶剂溶解,以层析用硅胶拌样,待有机溶剂挥发干净后,干法上硅胶柱,经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱,薄层层析色谱检测洗脱进程,收集含有雷公藤红素的洗脱部分,旋转蒸发回收溶剂,得到雷公藤纯品。
优选地,所述第二步中的浸泡提取的温度为0-35℃,南蛇藤粉和有机溶剂的体积比为1∶1-2,每次提取的浸泡时间为24h以上,浸泡期间进行搅拌,浸泡提取8次以上。
优选地,所述第三步、第四步以及第五步中旋装蒸发的温度为0-50℃,压力为0.07-0.1MPa。
优选地,所述第三步所得的提取物浸膏含有50wt%以上的雷公藤红素。
优选地,所述第四步中的有机溶剂为醋酸乙酯,提取物浸膏和有机溶剂的重量体积比为20g∶200ml(W/V),提取物浸膏和拌样用的硅胶的重量比为1∶10-15,提取物浸膏与装柱用的硅胶的重量比为20g∶1000-1200g(W/V),二氯甲烷与甲醇的体积比为20∶1-1∶1,所得的雷公藤红素粗品含有75-90wt%的雷公藤红素。
优选地,所述第五步中的有机溶剂为醋酸乙酯,雷公藤红素粗品和有机溶剂的重量体积比为15g∶150ml(W/V),雷公藤红素粗品和拌样用的硅胶的重量比为1∶10.15,雷公藤红素粗品与装柱用的硅胶的重量比为1∶50-60,二氯甲烷与甲醇的体积比为20∶1-1∶1。
优选地,所述第二步中浸泡提取所用的有机溶剂为正己烷。
优选地,所述的第四步和第五步中所用的硅胶为200-300目柱层析用硅胶。
优选地,所述的第四步和第五步中薄层层析色谱的检测条件为:硅胶GF254板,展开剂为:体积比为30∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液,以雷公藤红素对照品对照,直立上行展开,紫外灯254nm下检视。
优选地,所述的第五步中使用HPLC检测所得到的雷公藤纯品的纯度,HPLC条件为:C18200mm×4.6mm色谱柱,采用体积比为87∶13的甲醇和体积浓度为1%的醋酸溶液的混合液为为流动相,流速:1.0mm/min,检测波长为425nm。
按本发明的所述制备方法,雷公藤红素的得率为0.95‰(以干燥药材计算),纯度为≥98.0%,所得的雷公藤红素可用于医药行业及其他用途。
与现有技术相比,本发明的优点是操作简单,工艺简便,对仪器和设备要求低,浸泡法获得的提取物直接进行两次硅胶柱层分离,避免溶剂萃取、酸碱处理等手段,产品收率高,浸泡溶剂经回收可反复使用,适合工业化生产。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂,兹以优选实施例,作详细说明如下。
实施例
一种雷公藤红素的制备方法,具体步骤为:
将鲜南蛇藤根6千克洗净,切片,晒干,置粉碎机中粉碎成南蛇藤粉,约五公斤,将上述南蛇藤粉置塑料桶中,按南蛇藤粉:正己烷体积比为1∶1.5的比例,加入化学纯正己烷,室温20℃下浸泡提取,并经常搅拌,每次提取的浸泡时间为24小时,每批次南蛇藤粉浸泡8次,合并浸泡提取液;在50℃、压力为0.08MPa条件下,用旋转蒸发仪减压回收溶剂,得雷公藤红素含量为50wt%的提取物浸膏20g,提取率为0.4%。
将提取物浸膏用200ml醋酸乙酯溶解,加入200g200-300目柱层析用硅胶拌样,60℃水浴加热,使醋酸乙酯挥干后,将其装入直径为φ10cm,预先加入3kg空白200-300目柱层析用硅胶的柱中,先用体积比为20∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱,先用体积比为20∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱,再逐步增加洗脱液中甲醇的比例,依次用体积比为20∶2、20∶3、20∶4…20∶19的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱,每种比例的洗脱液使用到层析分离柱底部某一非主色带洗脱下来后,再换一种新的比例洗脱液,最终用体积比为1∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱,,用TLC薄层层析色谱检测洗脱进程(硅胶GF254板,展开剂为:体积比为30∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液,以雷公藤红素对照品对照,直立上行展开,紫外灯254nm下检视),以雷公藤红素对照品为对照,直立上行展开,紫外灯254nm下检视,收集含有雷公藤红素的洗脱部分,在50℃、压力为0.08MPa条件下旋转蒸发回收溶剂,得到雷公藤红素粗品10g,含量为88wt%。
将雷公藤红素粗品再进行第二次硅胶柱层析,先用150ml醋酸乙酯溶解,加入200g200-300目柱层析用硅胶拌样,60℃水浴加热,使醋酸乙酯挥干后,装入直径为φ8cm预先加入2.5kg空白200-300目柱层析用硅胶的柱中,先用体积比为20∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱,先用体积比为20∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱,再逐步增加洗脱液中甲醇的比例,依次用体积比为20∶2、20∶3、20∶4…20∶19的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱,每种比例的洗脱液使用到层析分离柱底部某一非主色带洗脱下来后,再换一种新的比例洗脱液,用TLC薄层层析色谱检测洗脱进程(硅胶GF254板,展开剂为:体积比为30∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液,以雷公藤红素对照品对照,直立上行展开,紫外灯254nm下检视,收集一个斑点的雷公藤红素组分),在50℃、压力为0.08MPa条件下,用旋转蒸发仪减压回收溶剂,得到雷公藤红素纯品5g。经HPLC检测,雷公藤红素的含量≥98%,HPLC条件为:C18200mm×4.6mm色谱柱,采用体积比为87∶13的甲醇和体积浓度为1%的醋酸溶液的混合液为为流动相,流速:1.0mm/min,检测波长为425nm。
将所得的雷公藤红素进行质谱检测和核磁检测,数据如下:mp200-202℃,ESI-MS(+)m/z473[M+Na]+,451[M+H]+,1H-NMR-(500MHz,CDCl3):δ7.06(1H,dd,J=7.0,1.0Hz,H-6),6.49(1H,d,J=1.0Hz,H-1),6.32(1H,d,J=7.0Hz,H-7),2.20(3H,s,H-23),1.42(3H,s,H-25),1.27(3H,s,H-26),1.26(3H,s,H-30),1.08(3H,s,H-28),0.57(3H,s,H-27)。
13C-NMR(125MHz,CDCl3)
δ:120.5(C-1),178.3(C-2),120.3(C-3),127.5(C-4),147.0(C-5),135.3(C-6),118.2(C-7),165.0(C-8),39.9(C-9),172.6(C-10),28.7(C-11),29.3(C-12),39.3(C-13),43.0(C-14),29.5(C-15),32.4(C-16),45.3(C-17),44.3(C-18),33.8(C-19),31.1(C-20),34.4(C-21),36.3(C-22),10.5(C-23),38.4(C-25),21.5(C-26),18.7(C-27),31.5(C-28),182.5(C-29),30.7(C-30)。
本发明产品的波谱数据数据与雷公藤红素(celastrol)的波谱数据一致。
Claims (9)
1.一种雷公藤红素的制备方法,其特征在于,具体步骤为:
第一步:将新鲜南蛇藤根洗净、切片,晒干,粉碎成南蛇藤粉;
第二步:将第一步得到的南蛇藤粉用有机溶剂浸泡提取至少一次,合并提取液;
第三步:将第二步得到的提取液旋转蒸发回收溶剂,得到提取物浸膏;
第四步:将第三步得到的提取物浸膏用有机溶剂溶解,以层析用硅胶拌样,待有机溶剂挥发干净后,干法上硅胶柱,经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱,薄层层析色谱检测洗脱进程,收集含有雷公藤红素的洗脱部分,旋转蒸发回收溶剂,得到雷公藤红素粗品;
第五步:将第四步得到的雷公藤红素粗品用有机溶剂溶解,以层析用硅胶拌样,待有机溶剂挥发干净后,干法上硅胶柱,经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱,薄层层析色谱检测洗脱进程,收集含有雷公藤红素的洗脱部分,旋转蒸发回收溶剂,得到雷公藤纯品。
2.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法,其特征在于,所述第二步中的浸泡提取的温度为0-35℃,南蛇藤粉和有机溶剂的体积比为1∶1-2,每次提取的浸泡时间为24h以上,浸泡期间进行搅拌,浸泡提取8次以上。
3.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法,其特征在于,所述第三步、第四步以及第五步中旋装蒸发的温度为0-50℃,压力为0.07-0.1MPa。
4.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法,其特征在于,所述第四步中的有机溶剂为醋酸乙酯,提取物浸膏和有机溶剂的重量体积比为20g∶200ml,提取物浸膏和拌样用的硅胶的重量比为1∶10-15,提取物浸膏与装柱用的硅胶的重量比为20g∶1000-1200g,二氯甲烷与甲醇的体积比为20∶1-1∶1,所得的雷公藤红素粗品含有75-90wt%的雷公藤红素。
5.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法,其特征在于,所述第五步中的有机溶剂为醋酸乙酯,雷公藤红素粗品和有机溶剂的重量体积比为15g∶150ml,雷公藤红素粗品和拌样用的硅胶的重量比为1∶10.15,雷公藤红素粗品与装柱用的硅胶的重量比为1∶50-60,二氯甲烷与甲醇的体积比为20∶1-1∶1。
6.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法,其特征在于,所述第二步中浸泡提取所用的有机溶剂为正己烷。
7.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法,其特征在于,所述的第四步和第五步中所用的硅胶为200-300目柱层析用硅胶。
8.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法,其特征在于,所述的第四步和第五步中薄层层析色谱的检测条件为:硅胶GF254板,展开剂为:体积比为30∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液,以雷公藤红素对照品对照,直立上行展开,紫外灯254nm下检视。
9.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法,其特征在于,所述的第五步中使用HPLC检测所得到的雷公藤纯品的纯度,HPLC条件为:C18200mm×4.6mm色谱柱,采用体积比为87∶13的甲醇和体积浓度为1%的醋酸溶液的混合液为为流动相,流速:1.0mm/min,检测波长为425nm。
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