CN109400665A - 从毛冬青中制备四种三萜类化合物对照品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从毛冬青中制备四种三萜类化合物对照品的方法，包括如下步骤：醇提、萃取、柱层析分离、纯化。本发明通过对毛冬青依次进行醇提、乙酸乙酯萃取、柱层析分离、纯化，特别是配合合适的柱层析分离工艺及纯化工艺，形成特定的三萜类化合物制备工艺。采用该工艺，不仅能够同时获得到四种三萜皂苷Ilexgenin A、lexsaponin A1、Ilexsaponin B1、Ilexsaponin B2，而且纯度很高，很适合作为化学对照品，为药物分析、中药材质量评价、生物活性研究及化学结构改造、合成提供了可靠的高纯度三萜皂苷类化合物样品来源。

Description

从毛冬青中制备四种三萜类化合物对照品的方法
技术领域
本发明属于中药及天然产物对照品分离纯化技术领域，涉及一种从毛冬青中制备四种三萜类化合物对照品的方法。
背景技术
毛冬青(Ilex pubescens Hook.et Arn.)为冬青科冬青属植物毛冬青的干燥根，别名细叶冬青、毛栋子、茶叶冬青等，多用根入药，主产于广东、广西、台湾等地。毛冬青根是我国一些江南省区民间常用药，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效，预防流感，治感冒、哮喘、扁桃体炎、中风瘫痪、烧烫伤、跌打损伤、止血、痈肿。南药《中草药学》记载：“清热解毒，活血通脉，消肿止痛。主治冠状动脉硬化性心脏病，急性心肌梗死，血栓闭塞性脉管炎，中心性视网膜炎，小儿肺炎，烧伤。”经现代药理实验和临床应用证明，毛冬青是治疗冠心病、心绞痛和脉管炎疾病较良好的药物，受到国内外学者广泛重视。据文献报道，毛冬青的化学成分主要为三萜皂苷和苷元类、黄酮类、木脂素类、香豆素类、半萜皂苷类、甾醇类及环烯醚萜类等化合物。其生物活性以血管栓塞性疾病研究居多，研究表明其药效活性成分为三萜皂苷及苷元类化合物。鉴于毛冬青中化合物的种类及结构丰富，其药用潜力巨大。
1983年，我国学者张树德、曾陇梅等从毛冬青根中发现了毛冬青酸(Ilexolicacid)和毛冬青苷甲(Ilexolide A)(化学通报,1983,(9):15)。1986年，秦国伟、陈政雄等从毛冬青根中提取分离到毛冬青皂苷甲(IlexsaponinA)(化学学报,1987,(45):249-255)。1987年，最早研究毛冬青化学成分的日本学者Kazuyuki首先从毛冬青植物根茎中得到了Ilexgenin A、Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1、Ilexsaponin B2等一系列三萜皂苷类化合物，且以新化合物的形式相继进行了报道(Pharm.Bull,1987,35(2):524-529)。
国内学者对毛冬青三萜皂苷提取纯化和有关活性进行了较为系统研究并取得了相关专利。刘国樵申请了毛冬青皂苷化合物用于制备由心肌缺血缺氧引起的心血管系统疾病的药物专利，具体涉及了一种五环三萜类毛冬青皂苷化合物用于制备心血管系统疾病的药物(公开号CN102499926A)。孙云、刘畅、葛玲甜等公开了从海南冬青等植物中获得的单体成分毛冬青皂苷Ilexsaponin A1在抗肿瘤方面的医药新用途(公开号CN103735557A)。同时，也公开了以毛冬青皂苷Ilexsaponin A1为原料制备成胶囊剂、片剂、滴丸剂、注射剂等药物剂型。曾宪仪、郭晟、陈新菊等以毛冬青提取物(其总皂苷含量≥50％)，并制成药剂学上可接受的制剂，申请了一种治疗脉管炎的中药有效部位及其制剂和制备方法专利(公开号CN1781503A)。张国明、华菊根、徐晓英等公开了一种毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，并以Ilexsaponin B1为对照，测定毛冬青总皂苷含量(公开号CN101284030A)。
虽然传统技术表明Ilexgenin A、Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1、IlexsaponinB2为毛冬青中主要三萜类化学成分，但是还未有传统技术能够简单、快速制备出IlexgeninA、Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1、Ilexsaponin B2并且纯度能够作为化学对照品。
因此，亟待提供一种从毛冬青中简单、快速制备出Ilexgenin A、Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1、Ilexsaponin B2并且纯度能够作为化学对照品的方法。
发明内容
基于此，本发明的主要目的是提供一种从毛冬青中制备四种三萜类化合物对照品的方法。该方法能够简单、快速的制备出高纯度的Ilexgenin A、Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1、Ilexsaponin B2。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种从毛冬青中制备四种三萜类化合物对照品的方法，所述方法包括如下步骤：
醇提：取毛冬青，粉碎，以醇溶液为溶剂提取，获得醇提浓缩液；
萃取：将所述的醇提浓缩液分散于水中，乙酸乙酯萃取，所得萃取液经过滤、浓缩，获得乙酸乙酯萃取部位浸膏；
柱层析分离：取所述乙酸乙酯萃取部位浸膏进行正相硅胶柱或反相硅胶柱梯度洗脱，浓缩、TLC鉴别分析，分别获得Ilexgenin A粗品、Ilexsaponin A1粗品、Ilexsaponin B1粗品、Ilexsaponin B2粗品；
纯化：(1)取所述Ilexgenin A粗品，醇溶解、过滤，所得滤渣用醇洗涤至褪色后再溶解于乙酸乙酯与醇的混合体系中制备成饱和溶液，结晶，得Ilexgenin A对照品；(2)取所述Ilexsaponin B1粗品，醇溶解制备成饱和溶液，结晶，得Ilexsaponin B1对照品；(3)取所述Ilexsaponin B2粗品，醇溶解、过滤，所得滤渣用醇洗涤至褪色后再溶解于醇中制备成饱和溶液，结晶，得Ilexsaponin B2对照品；(4)取所述Ilexsaponin A1粗品，采用高效制备反相色谱法进行纯化精制，获得Ilexsaponin A1对照品。
在其中一些实施例中，柱层析分离的步骤中：所述正相硅胶柱的粒径为100目～300目，梯度洗脱采用氯仿:甲醇(30:1→20:1→15:1→10:1→8:1→5:1→2:1)；所述反相硅胶柱的填料为粒径40μm～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶填料，梯度洗脱采用甲醇:水(30:70→40:60→55:45→70:30→90:10)。
在其中一些实施例中，纯化的步骤中：所述的操作(1)、(2)、(3)中，所述的醇为甲醇或乙醇；
所述的操作(1)中的乙酸乙酯和甲醇的混合体系中二者的体积比为(3～5):1；
所述的操作(4)中，所述的纯化精制采用的检测条件包括：固定相为填料为C18键合相填料、柱长为200mm～300mm、直径10mm～30mm、填料粒径为5μm～10μm，流动相为含有质量浓度为0.01％～0.03％三氟乙酸的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为(35～45):(55～65)，等梯度洗脱。
在其中一些实施例中，所述的操作(4)中，所述的纯化精制采用的检测条件包括：固定相为填料为C18键合相填料，柱长为200mm～300mm、直径10mm～30mm、填料粒径为5μm～10μm，流动相为含有质量浓度为0.02％三氟乙酸的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为40:60等梯度洗脱。
在其中一些实施例中，纯化的步骤中：所述的纯化精制采用的检测条件包括：检测波长为210nm，流速为2.0mL/min～30.0mL/min，进样浓度为50mg/mL～100mg/mL。
在其中一些实施例中，醇提的步骤中：所述的醇溶液为体积分数不低于90％的甲醇水溶液或者体积分数不低于90％的乙醇水溶液；所述的提取采用冷浸或者加热回流，其中加热回流的时间为45min～90min。
在其中一些实施例中，醇提的步骤中：所述毛冬青与醇溶液的比例为1g：(20～40)mL。
在其中一些实施例中，萃取的步骤中：所述水的重量是所述醇提浓缩液的5倍～10倍。
在其中一些实施例中，柱层析分离的步骤中：所述梯度洗脱采用的洗脱剂的体积是所述正相硅胶柱或反相硅胶柱柱体积的3倍～5倍。
在其中一些实施例中，纯化的步骤中：制备成饱和溶液的方式为加热、超声；所述醇为分析纯级。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明通过对毛冬青依次进行醇提、乙酸乙酯萃取、柱层析分离、纯化，特别是配合合适的柱层析分离工艺及纯化工艺，形成特定的三萜类化合物制备工艺。采用该工艺，能够同时获得高纯度的四种三萜皂苷Ilexgenin A、lexsaponin A1、Ilexsaponin B1、Ilexsaponin B2化学对照品，为药物分析、中药材质量评价、生物活性研究及化学结构改造、合成提供了可靠的高纯度三萜皂苷类化合物样品来源。
另外，该工艺：“三废”少，对环境污染少，方法简单易行，可靠，耗时少等，成本低廉、经济效益好，易于普及、且专属性好、重复性高、稳定性佳；所获得对照品规模为克级至百克，具有强大的可控空间，无论小规模的实验室制备或大规模的工业化推广都极具可行性。
附图说明
图1为本发明中Ilexgenin A的HPLC纯度检测图谱及紫外吸收图谱。
图2为本发明中Ilexsaponin A1的HPLC纯度检测图谱及紫外吸收图谱。
图3为本发明中Ilexsaponin B1的HPLC纯度检测图谱及紫外吸收图谱。
图4为本发明中Ilexsaponin B2的HPLC纯度检测图谱及紫外吸收图谱。
图5为本发明中Ilexsaponin A1的样品高效反相制备图谱。
图6一种从毛冬青中快速制备四种三萜类化学对照品的工艺流程图。
图7毛冬青药材指纹图谱(A)及四种三萜类化学对照品峰(B)对应图谱位置。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
三萜皂苷Ilexgenin A，白色无定型粉末，mp＞300℃。TLC10％硫酸乙醇105℃加热显蓝色。Liebermann-Burchard反应阳性。FAB-MS,m/z 503[M+H]+,分子式为C30H46O6。三萜皂苷Ilexsaponin A1，白色无定型粉末，mp＞300℃。TLC10％硫酸乙醇105℃加热显蓝色。Liebermann-Burchard反应阳性。5％硫酸乙醇加热回流热水解，TLC检测显示化合物含有葡萄糖，该化合物分子式为C36H56O11。三萜皂苷Ilexgenin A为三萜皂苷Ilexsaponin A1的苷元。三萜皂苷Ilexsaponin B1，白色无定型粉末，mp 246-247℃。TLC10％硫酸乙醇105℃加热显蓝色。Liebermann-Burchard和molish反应呈阳性。5％硫酸乙醇加热回流热水解，TLC检测显示化合物含有葡萄糖和木糖，化合物分子式为C41H66O13。三萜皂苷Ilexsaponin B2，白色无定型粉末，TLC10％硫酸乙醇105℃加热显蓝色。Liebermann-Burchard和molish反应呈阳性。5％硫酸乙醇加热回流热水解，TLC检测显示化合物含有葡萄糖、木糖和鼠李糖。化合物分子式为C53H86O22。
本发明以毛冬青药材为原料，经醇提、萃取、通过正相或反相硅胶柱分离、结晶或反相高效液相制备色谱精制四步骤可批量获得三萜皂苷Ilexgenin A、lexsaponin A1、Ilexsaponin B1、Ilexsaponin B2四个化学对照品，所得对照品规模为克级以上。主要包括提取、萃取、正相或反相硅胶柱分离、重结晶或高效液相反相色谱制备四步骤可获得上述四种化学对照品。其结构式如下：
实施例1
本实施例提供一种从毛冬青中分离制备四种三萜类化学对照品的方法，包括以下步骤(参见图6)：
(1)毛冬青醇提浓缩液：将毛冬青药材粉碎成粗粉(过20目药筛)，以90％(v/v)甲醇溶液冷浸提取，药材:甲醇溶液(1g:40mL)倍量提取3次，60℃，减压回收提取液，合并浓缩液，得到毛冬青药材醇提浓缩液。
(2)萃取：取毛冬青药材醇提浓缩液用5倍量蒸馏水分散于分液漏斗，用乙酸乙酯进行萃取(等体积溶剂萃取3次)，过滤、60℃，0.02～0.07MPa减压浓缩回收萃取液，得乙酸乙酯部位萃取浸膏。
(3)分离：取毛冬青乙酸乙酯部位萃取浸膏进行正相硅胶(100～300目)上柱，洗脱剂及体积比依次为：氯仿:甲醇(30:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、2:1)，每梯度洗脱量为柱体积3倍，每1000mL洗脱液减压浓缩，浓缩回收样品进行GF254薄层板鉴别分析，对相同样品液进行合并。
Ilexgenin A粗品主含于氯仿:甲醇30:1～20:1流动比例；Ilexsaponin A1粗品主含于氯仿:甲醇10:1流动比例；Ilexsaponin B1粗品主含于氯仿:甲醇5:1流动比例；Ilexsaponin B2粗品主含于氯仿:甲醇2:1流动比例。
(4)结晶：
取上述含Ilexgenin A粗品，甲醇溶解、过滤；滤渣用甲醇洗涤褪色(淡黄色褪至白色)，取洗涤后褪色样品，溶解于乙酸乙酯:甲醇(4:1)(v/v)系统，加热、超声饱和后，室温放冷析出白色絮状结晶，即为Ilexgenin A纯品，纯度检测参见图1，纯度为大于98％。
取含Ilexsaponin B1粗品溶于甲醇，超声、加热溶解达饱和状态后，放置室温冷却结晶，可得针状Ilexsaponin B1纯品。纯度检测参见图3，纯度为大于98％。
取Ilexsaponin B2粗品，加入少量甲醇，真空抽滤，将滤渣用甲醇洗涤至褪色，将洗涤后滤渣再用甲醇溶解，超声、加热成饱和溶液，室温冷却结晶，可得Ilexsaponin B2针状结晶纯品。纯度检测参见图4，纯度为大于98％。
(5)制备：取上述Ilexsaponin A1粗品，采用高效反相制备分离进行纯化精制，制备柱为市售产品，填料为C18键合相填料，填料粒径为5μm，柱长为250mm，直径10mm。采用等度洗脱，流动相为含有0.02％(w/v)三氟乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈与水的比为40:60(v/v)，柱温室温，紫外210nm监测，流速为3mL/min，样品浓度50mg/mL，进样量0.2mL。合理收集图谱中主要吸收物质峰(参见图5)，且需样品吸收到达500mAU后开始收集，浓缩干燥即得外观为纯白色粉末、纯度大于98％的Ilexsaponin A1对照品。纯度检测参见图2。对照品所获得规模为十克至百克级。
本实施例中，毛冬青药材指纹图谱见图7中A，四种三萜类化学对照品峰见图7中B对应图谱位置。
实施例2
本实施例提供一种从毛冬青中分离制备四种三萜类化学对照品的方法，包括以下步骤(参见图6)：
(1)毛冬青醇提浓缩液：将毛冬青药材粉碎成粗粉(过20目药筛)，以95％(v/v)乙醇冷浸提取，药材:乙醇(1g:40mL)倍量提取3次，60℃，减压回收提取液，合并回收液，得到毛冬青药材醇提浓缩液。
(2)萃取：取毛冬青药材醇浸膏浓缩液用8倍蒸馏水分散，乙酸乙酯进行萃取(等体积萃取3次)，过滤、60℃，减压浓缩回收萃取液，得毛冬青乙酸乙酯部位萃取浸膏。
(3)分离：取毛冬青乙酸乙酯部位萃取浸膏进行正相硅胶(100～300目)上柱，洗脱剂及体积比依次为：氯仿:甲醇(30:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、2:1)，每梯度洗脱量为柱体积4倍，每1000mL洗脱液减压浓缩，浓缩回收样品进行GF254薄层板鉴别分析，对相同样品液进行合并。
Ilexgenin A主含于氯仿:甲醇30:1～20:1流动比例；Ilexsaponin A1主含于氯仿:甲醇10:1流动比例；Ilexsaponin B1主含于氯仿:甲醇5:1流动比例；Ilexsaponin B2主含于氯仿:甲醇2:1流动比例。
(4)结晶：
取上述含IlexgeninA样品，用加入甲醇溶解，过滤；滤渣用甲醇洗涤至样品颜色褪去(淡黄色褪至白色)，取洗涤后褪色样品，溶解于乙酸乙酯:甲醇(4:1)，加热、超声使之成饱和溶液后，室温放冷析出白色絮状结晶即为Ilexgenin A纯样品。纯度检测参见图1，纯度为大于98％。
取Ilexsaponin B1粗品溶于甲醇中，加热、超声溶解，达饱和状态后放置室温冷却结晶，可得Ilexsaponin B1针状纯品。纯度检测参见图3，纯度为大于98％。
取Ilexsaponin B2粗品，加入少量甲醇，真空抽滤，得滤渣，将滤渣反复用甲醇洗涤至褪色，滤渣甲醇溶解，超声、加热成饱和溶液，室温放置冷却结晶，可得高纯度Ilexsaponin B2针状结晶样品。纯度检测参见图4，纯度为大于98％。
(5)制备：取上述Ilexsaponin A1粗品，高效反相制备分离方法进行纯化精制，制备柱为市售产品，填料为C18键合相填料，填料粒径为5μm，柱长为250mm，直径30mm。色谱条件为：采用等度洗脱，流动相为含有0.02％(w/v)三氟乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈与水的比为40:60(v/v)，柱温室温，紫外210nm监测，流速为20mL/min，样品浓度50mg/mL，进样量0.8mL。合理洗脱液，浓缩干燥即得外观为纯白色粉末、纯度大于98％的IlexsaponinA1纯品。纯度检测参见图2。
本实施例中，毛冬青药材指纹图谱见图7中A，四种三萜类化学对照品峰见图7中B对应图谱位置。
实施例3
本实施例提供一种从毛冬青中分离制备四种三萜类化学对照品的方法，包括以下步骤(参见图6)：
(1)毛冬青醇提浓缩液：取毛冬青药材粗粉(过20目药筛)，以95％(v/v)甲醇为提取溶剂加热回流提取，药材:甲醇(1g:20mL)倍量提取3次，每次提取时间45min。60℃、减压条件下回收提取液，合并回收液，得到毛冬青药材醇提浓缩液。
(2)萃取：用5倍量蒸馏水分散毛冬青药材醇提浓缩液，乙酸乙酯进行萃取(等体积溶剂萃取3次)。过滤、60℃、减压浓缩回收萃取液，得乙酸乙酯部位萃取浸膏。
(3)分离：取上述毛冬青乙酸乙酯萃取部位浸膏进行反相柱洗脱，洗脱剂及体积比依次为：甲醇:水(30:70、40:60、55:45、70:30、90:10)，每梯度洗脱量为柱体积5倍，每1000mL洗脱液减压浓缩，浓缩回收样品进行GF254薄层板鉴别分析，合并相同洗脱液。
Ilexgenin A主含于甲醇:水(90:1)流动相比例；Ilexsaponin A1主含于甲醇:水(70:30)流动相比例；Ilexsaponin B1主含于甲醇:水(55:45)流动相比例；Ilexsaponin B2主含于甲醇:水(40:60)流动相比例。减压浓缩回收各样品部分，得各单个对照样品粗品。
(4)结晶：
取上述Ilexgenin A粗品，甲醇溶解、过滤；滤渣用甲醇洗涤至颜色褪去(淡黄色褪至白色)，取褪色样品，溶于乙酸乙酯:甲醇(4:1)系统，加热、超声使完全溶解，并达饱和状态后，室温放冷，析出白色絮状结晶，即为Ilexgenin A纯样品。纯度检测参见图1，纯度为大于98％。
取上述Ilexsaponin B1粗品溶于80％乙醇溶液，超声、加热溶解，待饱和后放置室温冷却结晶，可得针状Ilexsaponin B1纯品。纯度检测参见图3，纯度为大于98％。
取Ilexsaponin B2粗品，加入少量乙醇，真空抽滤，将滤渣反复用乙醇洗涤至褪色，再用85％(v/v)乙醇溶液溶解，超声、加热成饱和溶液，放置室温冷却结晶，得纯度大于98％的Ilexsaponin B2针状结晶。纯度检测参见图4。
(5)制备：取上述Ilexsaponin A1粗品，采用高效反相制备分离进行精制，制备柱为市售产品，填料为C18键合相填料，填料粒径为5μm，柱长为250mm，直径20mm。采用等度洗脱，流动相为含有0.02％(w/v)三氟乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈与水的比为40:60(v/v)，柱温室温，紫外210nm监测，流速为12mL/min，样品浓度50mg/mL，进样量0.8mL。合理收集主要物质峰洗脱液，浓缩干燥即得外观为纯白色粉末、纯度大于98％的IlexsaponinA1对照品。纯度检测参见图2。
本实施例中，毛冬青药材指纹图谱见图7中A，四种三萜类化学对照品峰见图7中B对应图谱位置。
实施例4
本实施例提供一种从毛冬青中分离制备四种三萜类化学对照品的方法，包括以下步骤(参见图6)：
(1)毛冬青醇提浓缩液：将毛冬青药材粉碎成粗粉(过20目药筛)，以90％(v/v)乙醇加热回流提取，药材:乙醇(1g:20mL)倍量提取3次，每次提取时间为60min。60℃、减压条件下回收提取液，合并浓缩液，得毛冬青药材醇提浓缩液。
(2)萃取：取毛冬青药材醇提浓缩液用10倍量重蒸馏水分散，乙酸乙酯进行萃取(等体积溶剂萃取4次)，过滤、60℃，减压浓缩回收，得乙酸乙酯部位萃取浸膏。
(3)分离：取毛冬青乙酸乙酯萃取部位萃取浸膏进行反相柱洗脱，洗脱剂及体积比依次为：甲醇:水(25:75、40:60、55:45、70:30、90:10)，每梯度洗脱量为柱体积5倍，每1000mL洗脱液减压浓缩，浓缩回收样品进行GF254薄层板鉴别分析，对相同洗脱液合并。
Ilexgenin A主含于甲醇:水(90:1)流动相比例；Ilexsaponin A1主含于甲醇:水(70:30)流动相比例；Ilexsaponin B1主含于甲醇:水(55:45)流动相比例；Ilexsaponin B2主含于甲醇:水(40:60)流动相比例。减压浓缩回收各部分，得各单个对照样品粗品。
(4)结晶：
取上述含IlexgeninA粗品，甲醇溶解、过滤；滤渣用甲醇洗涤至样品颜色褪去(淡黄色褪至白色)，取洗涤后样品，溶解于乙酸乙酯:甲醇(3:1)体系，超声、加热溶解，达饱和状态后，室温放冷析出白色絮状结晶，即为Ilexgenin A纯样品。纯度检测参见图1，纯度为大于98％。
取含Ilexsaponin B1粗品溶于乙醇中，超声、加热溶解，达饱和状态后，放置室温冷却结晶，可得针状Ilexsaponin B1样品。纯度检测参见图3，纯度为大于98％。
取含Ilexsaponin B2粗品，加入少量乙醇，真空抽滤，得滤渣，将滤渣反复用甲醇洗涤至颜色退去，将滤渣用90％(v/v)乙醇溶液溶解，超声、加热成饱和溶液，放置室温冷却结晶，可得纯度大于98％的Ilexsaponin B2针状结晶样品。纯度检测参见图4。
(5)制备：
取上述Ilexsaponin A1粗品，采用高效反相制备方法纯化精制，制备柱为市售产品，填料为C18键合相填料，填料粒径为5μm，柱长为250mm，直径30mm。色谱洗脱条件为采用等度洗脱，流动相为含有0.02％(w/v)三氟乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈与水的比为40:60(v/v)，柱温室温，紫外210nm监测，流速为20mL/min，样品浓度100mg/mL，进样量0.8mL。合理收集洗脱液，浓缩干燥，即得外观为纯白色粉末、纯度大于98％的IlexsaponinA1对照品。谱峰参见图5，纯度检测参见图2。
本实施例中，毛冬青药材指纹图谱见图7中A，四种三萜类化学对照品峰见图7中B对应图谱位置。
实施例5
本实施例提供一种从毛冬青中分离制备四种三萜类化学对照品的方法，包括以下步骤(参见图6)：
(1)毛冬青药材醇提浓缩液：取毛冬青药材粗粉(过20目药筛)，90％(v/v)甲醇加热回流提取，药材:乙醇(1g:30mL)倍量重提取3次，每次提取时间为90min。60℃、减压条件回收提取液，合并浓缩液，得毛冬青药材醇提浓缩液。
(2)萃取：取毛冬青药材醇提浓缩液用8倍量蒸馏水分散，乙酸乙酯进行萃取(等体积溶剂萃取3次)，过滤、60℃条件下，减压回收萃取液，得乙酸乙酯部位萃取浸膏。
(3)分离：取上述毛冬青乙酸乙酯部位萃取浸膏进行反相柱洗脱，洗脱剂及体积比依次为：乙醇:水(20:80、40:60、55:45、70:30、90:10)，每梯度洗脱量为柱体积4倍，每1000mL接液减压浓缩，浓缩回收样品进行GF254薄层板鉴别分析，合并洗脱液。
Ilexgenin A主含于乙醇:水90:1流动相比例；Ilexsaponin A1主含于乙醇:水70:30流动相比例；Ilexsaponin B1主含于乙醇:水55:45流动相比例；Ilexsaponin B2主含于乙醇:水60:40流动相比例。减压浓缩回收各样品部分，得各单个对照品粗品。
(4)结晶：
取上述Ilexgenin A粗品乙醇溶解，过滤；滤渣用乙醇洗涤至颜色褪去(淡黄色褪至白色)，取褪色粗品，溶于乙酸乙酯:甲醇(5:1)(v/v)体系，加热、超声完全溶解，饱和状态后，室温放冷析出白色絮状结晶，即为Ilexgenin A纯样品。纯度检测参见图1，纯度为大于98％。
取含Ilexsaponin B1粗品溶于甲醇中，超声、加热溶解，达饱和状态后放置室温冷却结晶，可得针状Ilexsaponin B1样品。纯度检测参见图3，纯度为大于98％。
取含Ilexsaponin B2粗品，加入少量甲醇，真空抽滤，得滤渣，将滤渣反复用甲醇洗涤至颜色退去，将洗涤后滤渣用甲醇溶解，超声、加热成甲醇饱和溶液，放置室温冷却结晶，可得高纯度Ilexsaponin B2针状结晶样品，即为Ilexsaponin B2化学对照品。纯度检测参见图4，纯度为大于98％。
(5)制备：取上述含Ilexsaponin A1粗品，采用高效反相制备分离方法进行纯化精制，制备柱为市售产品，填料为C18键合相填料，粒径为10μm，柱长为250mm，直径20mm。采用等度洗脱，流动相为含有0.02％(w/v)三氟乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈与水的比为40:60(v/v)，柱温室温，紫外210nm监测，流速为15mL/min，样品浓度100mg/mL，进样量0.5mL。合理收集图谱吸收峰(参见图5)，浓缩干燥得白色粉末状、纯度大于98％的Ilexsaponin A1化学对照品。纯度检测参见图2。
本实施例中，毛冬青药材指纹图谱见图7中A，四种三萜类化学对照品峰见图7中B对应图谱位置。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种从毛冬青中制备四种三萜类化合物对照品的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
醇提：取毛冬青，粉碎，以醇溶液为溶剂提取，浓缩，获得醇提浓缩液；
萃取：将所述的醇提浓缩液分散于水中，乙酸乙酯萃取，所得萃取液经过滤、浓缩，获得乙酸乙酯萃取部位浸膏；
柱层析分离：取所述乙酸乙酯萃取部位浸膏进行正相硅胶柱或反相硅胶柱梯度洗脱，浓缩、TLC鉴别分析，分别获得Ilexgenin A粗品、Ilexsaponin A1粗品、Ilexsaponin B1粗品、Ilexsaponin B2粗品；
纯化：(1)取所述Ilexgenin A粗品，醇溶解、过滤，所得滤渣用醇洗涤至褪色后再溶解于乙酸乙酯与醇的混合体系中制备成饱和溶液，结晶，得Ilexgenin A对照品；(2)取所述Ilexsaponin B1粗品，醇溶解制备成饱和溶液，结晶，得Ilexsaponin B1对照品；(3)取所述Ilexsaponin B2粗品，醇溶解、过滤，所得滤渣用醇洗涤至褪色后再溶解于醇中制备成饱和溶液，结晶，得Ilexsaponin B2对照品；(4)取所述Ilexsaponin A1粗品，采用高效制备反相色谱法进行纯化精制，获得Ilexsaponin A1对照品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，柱层析分离的步骤中：所述正相硅胶柱的粒径为100目～300目，梯度洗脱采用氯仿:甲醇(30:1→20:1→15:1→10:1→8:1→5:1→2:1)；所述反相硅胶柱的填料为粒径40μm～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶填料，梯度洗脱采用甲醇:水(30:70→40:60→55:45→70:30→90:10)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，纯化的步骤中：所述的操作(1)、(2)、(3)中，所述的醇为甲醇或乙醇；所述的操作(1)中的乙酸乙酯和甲醇的混合体系中二者的体积比为(3～5):1；所述的操作(4)中，所述的纯化精制采用的检测条件包括：固定相为填料为C18键合相填料、柱长为200mm～300mm、直径10mm～30mm、填料粒径为5μm～10μm，流动相为含有质量浓度为0.01％～0.03％三氟乙酸的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为(35～45):(55～65)，等梯度洗脱。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的操作(4)中，所述的纯化精制采用的检测条件包括：固定相为填料为C18键合相填料、柱长为200mm～300mm、直径10mm～30mm、填料粒径为5μm～10μm，流动相为含有质量浓度为0.02％三氟乙酸的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为40:60，等梯度洗脱。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，纯化的步骤中：所述的纯化精制采用的检测条件包括：检测波长为210nm，流速为2.0mL/min～30.0mL/min，进样浓度为50mg/mL～100mg/mL。
6.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，醇提的步骤中：所述的醇溶液为体积分数不低于90％的甲醇水溶液或者体积分数不低于90％的乙醇水溶液；所述的提取采用冷浸或者加热回流，其中加热回流的时间为45min～90min。
7.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，醇提的步骤中：所述毛冬青与醇溶液的比例为1g：(20～40)mL。
8.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，萃取的步骤中：所述水的重量是所述醇提浓缩液的5倍～10倍。
9.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，柱层析分离的步骤中：所述梯度洗脱采用的洗脱剂的体积是所述正相硅胶柱或反相硅胶柱柱体积的3倍～5倍。
10.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，纯化的步骤中：制备成饱和溶液的方式为加热、超声；所述醇为分析纯级。
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