CN103570795B - 一种雷公藤红素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种雷公藤红素的制备方法，其特征在于，具体步骤为：将新鲜南蛇藤根洗净、切片，晒干，粉碎成南蛇藤粉；将南蛇藤粉浸泡提取；将提取液回收溶剂，得到提取物浸膏；将提取物浸膏用有机溶剂溶解，干法上硅胶柱，经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，收集含有雷公藤红素的洗脱部分，回收溶剂，得到雷公藤红素粗品；将雷公藤红素粗品用有机溶剂溶解，干法上硅胶柱，经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，收集含有雷公藤红素的洗脱部分回收溶剂，得到雷公藤纯品。本发明操作简单，工艺简便，对仪器和设备要求低，浸泡法获得的提取物直接进行两次硅胶柱层分离，避免溶剂萃取、酸碱处理等手段，产品收率高，浸泡溶剂经回收可反复使用，适合工业化生产。

Description

一种雷公藤红素的制备方法

技术领域

本发明涉及一种从南蛇藤药材中制备雷公藤红素的新方法，尤其涉及一种从南蛇藤中提取、分离、纯化雷公藤红素的制备方法，属于天然活性产物制备方法的技术领域。

背景技术

南蛇藤为卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤(celastrus orbiculatus Thunb)根。本品具有驱风除湿，活血解毒，消肿的功效。主治筋骨疼痛，四肢麻木，风湿性关节炎，腰腿痛，闭经，小儿惊风，痧症、痢疾、肿毒、毒蛇咬伤、跌打损伤。民间常用该药煎汤或外敷治疗风湿痹疼，该药的汤剂和酊剂已在临床上用于治疗类风湿性关节炎多年，疗效确切。南蛇藤化学成分复杂，已从该植物种子、叶及地上部分分离到50多种成分，主要有三萜类、黄酮类、有机酸类、多元醇类、甾体、生物碱及鞣质。其中三萜类、生物碱类、黄酮类含量较高。南蛇藤以其根入药，治疗风湿性和类风湿性关节炎，原发性血小板增多症，以及关节神经痛强直性脊柱炎和痹症。近年的国内外研究表明，南蛇藤在抗炎，抗肿瘤，抗氧化，抗多药耐药性以及抗生育方面都有着广阔的研究和应用前景，尤其最值得关注的是抗肿瘤方面的显著作用，其主要活性成分为南蛇藤素(雷公藤红素)。

雷公藤红素：分子式：C29H38O4，分子量：450.61，

结构式为：

雷公藤红素是一种具有多种生物活性的天然产物，具有显著的药理活性，如抗炎，免疫抑制，抗肿瘤，抗纤维化，抑制血管生成，诱导细胞凋亡等作用。雷公藤红素是目前很值得关注的天然活性物质，其药理活性广泛而显著，具有重要的研究开发价值，可有望开发成具有多种治疗作用的新药。雷公藤红素为三萜类，结构复杂，在植物中含量低，分离纯化工艺复杂，给制备红素带来困难，往往无法获得纯品。有关制备红素的方法有多种，有的用乙醇回流提取，上硅胶或氧化铝柱分离，有的用超声波提取，提取物用酸、碱沉淀，氧化铝柱层析等过程，在进行上述实验过程中，均说能获得纯品，有的还进行了专利申请，但他们的实验方法要获得真正纯度高的纯品，还是有一定困难。

以上可知，现有制备工艺步骤相对较长，操作繁琐，产品得率不高，关键是大多无法获得真正意义上的纯品。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，产品收率高，工艺稳定、方法有效的一种制备纯化雷公藤红素的新方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种雷公藤红素的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将新鲜南蛇藤根洗净、切片，晒干，粉碎成南蛇藤粉；

第二步：将第一步得到的南蛇藤粉用有机溶剂浸泡提取至少一次，合并提取液；

第三步：将第二步得到的提取液旋转蒸发回收溶剂，得到提取物浸膏；

第四步：将第三步得到的提取物浸膏用有机溶剂溶解，以层析用硅胶拌样，待有机溶剂挥发干净后，干法上硅胶柱，经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，薄层层析色谱检测洗脱进程，收集含有雷公藤红素的洗脱部分，旋转蒸发回收溶剂，得到雷公藤红素粗品；

第五步：将第四步得到的雷公藤红素粗品用有机溶剂溶解，以层析用硅胶拌样，待有机溶剂挥发干净后，干法上硅胶柱，经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，薄层层析色谱检测洗脱进程，收集含有雷公藤红素的洗脱部分，旋转蒸发回收溶剂，得到雷公藤纯品。

优选地，所述第二步中的浸泡提取的温度为0-35℃，南蛇藤粉和有机溶剂的体积比为1∶1-2，每次提取的浸泡时间为24h以上，浸泡期间进行搅拌，浸泡提取8次以上。

优选地，所述第三步、第四步以及第五步中旋装蒸发的温度为0-50℃，压力为0.07-0.1MPa。

优选地，所述第三步所得的提取物浸膏含有50wt％以上的雷公藤红素。

优选地，所述第四步中的有机溶剂为醋酸乙酯，提取物浸膏和有机溶剂的重量体积比为20g∶200ml(W/V)，提取物浸膏和拌样用的硅胶的重量比为1∶10-15，提取物浸膏与装柱用的硅胶的重量比为20g∶1000-1200g(W/V)，二氯甲烷与甲醇的体积比为20∶1-1∶1，所得的雷公藤红素粗品含有75-90wt％的雷公藤红素。

优选地，所述第五步中的有机溶剂为醋酸乙酯，雷公藤红素粗品和有机溶剂的重量体积比为15g∶150ml(W/V)，雷公藤红素粗品和拌样用的硅胶的重量比为1∶10.15，雷公藤红素粗品与装柱用的硅胶的重量比为1∶50-60，二氯甲烷与甲醇的体积比为20∶1-1∶1。

优选地，所述第二步中浸泡提取所用的有机溶剂为正己烷。

优选地，所述的第四步和第五步中所用的硅胶为200-300目柱层析用硅胶。

优选地，所述的第四步和第五步中薄层层析色谱的检测条件为：硅胶GF254板，展开剂为：体积比为30∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液，以雷公藤红素对照品对照，直立上行展开，紫外灯254nm下检视。

优选地，所述的第五步中使用HPLC检测所得到的雷公藤纯品的纯度，HPLC条件为：C18200mm×4.6mm色谱柱，采用体积比为87∶13的甲醇和体积浓度为1％的醋酸溶液的混合液为为流动相，流速：1.0mm/min，检测波长为425nm。

按本发明的所述制备方法，雷公藤红素的得率为0.95‰(以干燥药材计算)，纯度为≥98.0％，所得的雷公藤红素可用于医药行业及其他用途。

与现有技术相比，本发明的优点是操作简单，工艺简便，对仪器和设备要求低，浸泡法获得的提取物直接进行两次硅胶柱层分离，避免溶剂萃取、酸碱处理等手段，产品收率高，浸泡溶剂经回收可反复使用，适合工业化生产。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下。

实施例

一种雷公藤红素的制备方法，具体步骤为：

将鲜南蛇藤根6千克洗净，切片，晒干，置粉碎机中粉碎成南蛇藤粉，约五公斤，将上述南蛇藤粉置塑料桶中，按南蛇藤粉：正己烷体积比为1∶1.5的比例，加入化学纯正己烷，室温20℃下浸泡提取，并经常搅拌，每次提取的浸泡时间为24小时，每批次南蛇藤粉浸泡8次，合并浸泡提取液；在50℃、压力为0.08MPa条件下，用旋转蒸发仪减压回收溶剂，得雷公藤红素含量为50wt％的提取物浸膏20g，提取率为0.4％。

将提取物浸膏用200ml醋酸乙酯溶解，加入200g200-300目柱层析用硅胶拌样，60℃水浴加热，使醋酸乙酯挥干后，将其装入直径为φ10cm，预先加入3kg空白200-300目柱层析用硅胶的柱中，先用体积比为20∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，先用体积比为20∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，再逐步增加洗脱液中甲醇的比例，依次用体积比为20∶2、20∶3、20∶4…20∶19的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，每种比例的洗脱液使用到层析分离柱底部某一非主色带洗脱下来后，再换一种新的比例洗脱液，最终用体积比为1∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，，用TLC薄层层析色谱检测洗脱进程(硅胶GF254板，展开剂为：体积比为30∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液，以雷公藤红素对照品对照，直立上行展开，紫外灯254nm下检视)，以雷公藤红素对照品为对照，直立上行展开，紫外灯254nm下检视，收集含有雷公藤红素的洗脱部分，在50℃、压力为0.08MPa条件下旋转蒸发回收溶剂，得到雷公藤红素粗品10g，含量为88wt％。

将雷公藤红素粗品再进行第二次硅胶柱层析，先用150ml醋酸乙酯溶解，加入200g200-300目柱层析用硅胶拌样，60℃水浴加热，使醋酸乙酯挥干后，装入直径为φ8cm预先加入2.5kg空白200-300目柱层析用硅胶的柱中，先用体积比为20∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，先用体积比为20∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，再逐步增加洗脱液中甲醇的比例，依次用体积比为20∶2、20∶3、20∶4…20∶19的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，每种比例的洗脱液使用到层析分离柱底部某一非主色带洗脱下来后，再换一种新的比例洗脱液，用TLC薄层层析色谱检测洗脱进程(硅胶GF254板，展开剂为：体积比为30∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液，以雷公藤红素对照品对照，直立上行展开，紫外灯254nm下检视，收集一个斑点的雷公藤红素组分)，在50℃、压力为0.08MPa条件下，用旋转蒸发仪减压回收溶剂，得到雷公藤红素纯品5g。经HPLC检测，雷公藤红素的含量≥98％，HPLC条件为：C18200mm×4.6mm色谱柱，采用体积比为87∶13的甲醇和体积浓度为1％的醋酸溶液的混合液为为流动相，流速：1.0mm/min，检测波长为425nm。

将所得的雷公藤红素进行质谱检测和核磁检测，数据如下：mp200-202℃，ESI-MS(+)m/z473[M+Na]+，451[M+H]+，1H-NMR-(500MHz，CDCl3)：δ7.06(1H，dd，J＝7.0，1.0Hz，H-6)，6.49(1H，d，J＝1.0Hz，H-1)，6.32(1H，d，J＝7.0Hz，H-7)，2.20(3H，s，H-23)，1.42(3H，s，H-25)，1.27(3H，s，H-26)，1.26(3H，s，H-30)，1.08(3H，s，H-28)，0.57(3H，s，H-27)。

13C-NMR(125MHz，CDCl3)

δ：120.5(C-1)，178.3(C-2)，120.3(C-3)，127.5(C-4)，147.0(C-5)，135.3(C-6)，118.2(C-7)，165.0(C-8)，39.9(C-9)，172.6(C-10)，28.7(C-11)，29.3(C-12)，39.3(C-13)，43.0(C-14)，29.5(C-15)，32.4(C-16)，45.3(C-17)，44.3(C-18)，33.8(C-19)，31.1(C-20)，34.4(C-21)，36.3(C-22)，10.5(C-23)，38.4(C-25)，21.5(C-26)，18.7(C-27)，31.5(C-28)，182.5(C-29)，30.7(C-30)。

本发明产品的波谱数据数据与雷公藤红素(celastrol)的波谱数据一致。

Claims (5)

1.一种雷公藤红素的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将新鲜南蛇藤根洗净、切片，晒干，粉碎成南蛇藤粉；

第二步：将第一步得到的南蛇藤粉用有机溶剂浸泡提取至少一次，合并提取液；所述第二步中的浸泡提取的温度为0-35℃，南蛇藤粉和有机溶剂的体积比为1:1-2，每次提取的浸泡时间为24h以上，浸泡期间进行搅拌，浸泡提取8次以上；所述第二步中浸泡提取所用的有机溶剂为正己烷；

第三步：将第二步得到的提取液旋转蒸发回收溶剂，得到含有50wt%以上雷公藤红素的提取物浸膏；

第四步：将第三步得到的提取物浸膏用有机溶剂溶解，以层析用硅胶拌样，待有机溶剂挥发干净后，干法上硅胶柱，经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，薄层层析色谱检测洗脱进程，收集含有雷公藤红素的洗脱部分，旋转蒸发回收溶剂，得到雷公藤红素粗品；所述的有机溶剂为醋酸乙酯，提取物浸膏和有机溶剂的重量体积比为20g:200ml，提取物浸膏和拌样用的硅胶的重量比为1：10-15，提取物浸膏与装柱用的硅胶的重量比为20g:1000-1200g，二氯甲烷与甲醇的体积比为20：1-1:1，所得的雷公藤红素粗品含有75-90wt%的雷公藤红素；

第五步：将第四步得到的雷公藤红素粗品用有机溶剂溶解，以层析用硅胶拌样，待有机溶剂挥发干净后，干法上硅胶柱，经二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，薄层层析色谱检测洗脱进程，收集含有雷公藤红素的洗脱部分，旋转蒸发回收溶剂，得到雷公藤纯品；所述第五步中的有机溶剂为醋酸乙酯，雷公藤红素粗品和有机溶剂的重量体积比为15g:150ml，雷公藤红素粗品和拌样用的硅胶的重量比为1：10.15，雷公藤红素粗品与装柱用的硅胶的重量比为1:50-60，二氯甲烷与甲醇的体积比为20：1-1:1。

2.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法，其特征在于，所述第三步、第四步以及第五步中旋装蒸发的温度为0-50℃，压力为0.07-0.1MPa。

3.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法，其特征在于，所述的第四步和第五步中所用的硅胶为200-300目柱层析用硅胶。

4.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法，其特征在于，所述的第四步和第五步中薄层层析色谱的检测条件为：硅胶GF254板，展开剂为：体积比为30:1的二氯甲烷和甲醇的混合液，以雷公藤红素对照品对照，直立上行展开，紫外灯254nm下检视。

5.如权利要求1所述的雷公藤红素的制备方法，其特征在于，所述的第五步中使用HPLC检测所得到的雷公藤纯品的纯度，HPLC条件为：C18 200mm×4.6mm色谱柱，采用体积比为87:13的甲醇和体积浓度为1%的醋酸溶液的混合液为为流动相，流速：1.0mm/min，检测波长为425nm。